Siamo grati al signor Roger Ackroyd, Andrew Wyman e Mr Chris Stoddard, consulente chirurghi a Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, per il loro aiuto ad acquisire campioni di tessuto esofageo e il loro sostegno del nostro lavoro. Ringraziamo Ashraful Haque per il suo aiuto incorporare linee di cellule tumorali nel modello. Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario per questo studio da sovvenzioni dal Bardhan Research and Education Trust (BRET) e Yorkshire Cancer Research (YCR).

Cellule esofagee umane sono ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Il consenso informato è ottenuto per il tessuto da utilizzare a scopo di ricerca, e il tessuto utilizzato in modo anonimo sotto le opportune approvazioni etiche (SSREC 165/03, Tessuto umano di ricerca Bank Licenza 12179). 1. Isolamento di cellule umane esofageo epiteliali <ol><li> Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, preparare il terreno di coltura epiteliale mescolando medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) e F12 di Ham in un rapporto 3: 1 (v: v). Aggiungere 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico, 0,4 mg / ml idrocortisone, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 2 x 10 -7 M triiodotironina, 1 x 10 -10 M tossina colerica, 2 x 10 -3 M glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B. </li><li> Utilizzo di serietecniche sterili, mettono 11 ml di DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml di amfotericina B in un pallone di coltura tissutale T75. Aggiungere 1 x 10 6 lethally irradiati topo fibroblasti 3T3 12 in 1 ml dello stesso terreno e incubare una notte a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Ciò produrrà uno strato alimentatore per la successiva coltura di cellule epiteliali. </li><li> Usando un bisturi e seguendo le raccomandazioni di un anatomopatologo, sezionare un 2 campione di circa 2 cm di tessuto dallo sfondo regione libera da malattia esofagea mucosa squamosa ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Trasporto al laboratorio in un contenitore 50 ml di terreno di trasporto sterile (PBS 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 0.625 mg / ml anfotericina B) a temperatura ambiente. </li><li> A questo punto, memorizzare il tessuto nel trasportomezzo per fino a 12 ore (una notte) a 4 ° C, per convenienza; tuttavia non utilizzare periodi di inattività quali risultano nella vitalità cellulare ridotta. </li><li> Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, sterilizzare un bisturi per immersione in etanolo al 70% per 5 min. Sciacquare in PBS sterile. </li><li> Collocare il tessuto in una piastra di Petri sterile e utilizzare il bisturi per tagliare in 0,5 centimetri strisce. Aggiungere 5 ml di 0,1% (w / v) in PBS tripsina al piatto Petri, posizionare il coperchio sul piatto e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di FCS al tessuto in piastra di Petri di inibire la tripsina. Tenendo la striscia di tessuto con pinze sterili, raschiare delicatamente la superficie epiteliale con la lama di bisturi per 1-2 min per strip per rimuovere le cellule epiteliali nel mezzo circostante. Rimuovere il tessuto raschiato e mettere da parte. Ripetere il processo per tutte le strisce di tessuto. </li><li> Raccogliere il terreno contenente le cellule epiteliali staccate in una provetta da centrifuga da 15 mle centrifugare (5 min, 200 xg). Versare il surnatante e risospendere il pellet in 12 ml di terreno epiteliale (descritto al punto 1.1). </li><li> Eliminare e scartare il supporto dallo strato di cellule di alimentazione nel pallone T75 preparato al punto 1.2. Utilizzare una pipetta sterile per aggiungere la sospensione cellulare contenente cellule epiteliali appena isolate nel pallone e incubare a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata. </li><li> Dopo 24 ore versare fuori e scartare il terreno di coltura, che conterrà anche detriti cellulari, e sostituirlo con 12 ml di mezzo fresco epiteliale. Continuare incubando a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Colonie inizierà ad apparire nei prossimi 24-48 ore e possono essere visualizzati posizionando il pallone di coltura al microscopio ottico standard. Versare il terreno di coltura esaurito e sostituirlo con un volume uguale di mezzo fresco ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Una volta che il pallone ha raggiunto l&#39;80% di confluenza, il passaggio delle cellule 13. Dividere il cells in un rapporto di 1: 5 per aumentare il numero di cellule per uso nel modello. Seguire passo 1.2 per stabilire strati di alimentazione del combustibile irraggiato 3T3 in ogni contenitore che riceverà le cellule epiteliali 24 ore prima di passaging cellule. Nota: utilizzare le cellule epiteliali del modello esofageo descritto di seguito tra i passaggi 1 e solo il 4. </li></ol> 2. Isolamento di fibroblasti umani esofagee <ol><li> Lavorare in una cappa a flusso laminare e con tecnica sterile, prendere il tessuto accantonato nella fase 1.7. Mettere in una piastra di Petri sterile e tritare finemente da taglio con una lama di bisturi sterile. Aggiungere 10 ml di 0,5% (w / v) collagenasi Una soluzione e posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e incubare a 37 ° C durante la notte in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. </li><li> Trasferire il digest in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare (10 min, 200 xg), con attenzione versare fuori e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura di fibroblasti (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutammina, 100 IU / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,625 mg / ml anfotericina B). </li><li> Posizionare la sospensione in un pallone T75 e incubare a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. Dopo 24 ore versate fuori dal mezzo, che conterrà detriti e sostituirlo con 12 ml di terreno fresco fibroblasti. Sostituire il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni e le cellule di passaggio una volta raggiunto l&#39;80% di confluenza 13, dividendo le cellule in un rapporto 1: 5 per aumentare il numero di cellule. Nota: utilizzare le cellule di fibroblasti nel modello descritto di seguito tra i passaggi 4 e solo il 10. </li></ol> 3. Preparazione del De-cellularized esofageo Scaffold <ol><li> Ottenere intatto suina esofagi a un mattatoio di suini Landrace appena macellati che vengono utilizzati per la produzione alimentare. Una sola esofago fornirà ponteggi sufficienti per circa 30 costrutti separati. Nota: A causa della vasta e ora consuming protocollo di sterilizzazione richiesto, è normalmente vale ottenimento e l&#39;elaborazione di un minimo di 10 esofagi contemporaneamente. </li><li> Porre immediatamente l&#39;esofago appena asportato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di soluzione di iodio-povidone 10% per 5 minuti per ridurre qualsiasi carica microbica contaminante. Trasferire l&#39;esofago di una seconda pentola contenente circa 100 ml di PBS sterile contenente 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B. <ol><li> Rimettere il coperchio sul recipiente e trasportare il esofagi torna al laboratorio a temperatura ambiente. Due o tre esofagi possono essere trasportati in ciascun contenitore, a seconda delle loro dimensioni. </li></ol></li><li> Una volta in laboratorio, gestire il tessuto in una cappa a flusso laminare con tecnica asettica per minimizzare la contaminazione microbica. Sterilizzare pinzette, forbici e lame bisturi immergendo per 5 minuti nel 70% di etanolo, e risciacquo in PBS sterile. </li><li> Maneggiare le esophagus utilizzando una pinzetta sterile. Utilizzando le forbici, tagliare aperto l&#39;esofago longitudinalmente. Sciacquare il tessuto posizionando l&#39;esofago in una pentola sterile 180 ml contenente circa 100 ml di PBS sterile e scuotendo delicatamente per rimuovere eventuali detriti. </li><li> Pulire una bacheca di sughero dissezione spruzzando liberamente con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere l&#39;esofago dalla PBS, e l&#39;utilizzo di aghi sterili, pin out l&#39;esofago sul bordo, mucosa più in alto di superficie. Afferrare la superficie mucosa ad una estremità dell&#39;esofago con una pinzetta sterile e tirare fuori dal bordo. Questo separerà mucosa dalla sottomucosa sottostante. <ol><li> Quindi, utilizzare un bisturi sterile per sezionare l&#39;esofago longitudinalmente lungo la lamina propria, rimuovendo gli spilli dissezione progredisce per consentire la mucosa per essere sollevato lontano. </li></ol></li><li> Conservare la mucosa sezionato e gettare la sottomucosa sottostante. </li><li> Tagliare ed eliminare i più prossimale e distale 2 cm di tegli mucosa in quanto vi è un maggior numero di ghiandole della sottomucosa e una spessa lamina propria in quelle aree, rispettivamente, 7. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto rimanente in 5 centimetri 2. Mettere tutto il tessuto tagliato in una pentola sterile 180 ml contenente circa 150 ml di PBS sterile e agitare delicatamente per lavare il tessuto. Se il trattamento più di cinque esofagi contemporaneamente, può essere necessario utilizzare più vasi per questo e le tre fasi successive. </li><li> Con una pinzetta sterile, trasferire il tessuto tagliato in una pentola 180 ml contenente 150 ml di sterile 1 M NaCl, 200 UI / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina e 1,25 mg / ml di amfotericina B. Incubare per 72 ore a 37 ° C. </li><li> Collocare il tessuto in una nuova pentola 180 ml contenente 150 ml di PBS sterile. L&#39;epitelio avrà iniziato a separare visibilmente dal tessuto sottostante. Buccia delicatamente l&#39;epitelio staccarsi dal esofago maiale con pinza sterile e scartare. <ol><li> Posizionare il restante tproblema in una nuova pentola 180 ml e aggiungere 150 ml di PBS sterile. Agitare delicatamente per 5 minuti per lavare. Eliminare il PBS e ripetere altre due volte con PBS fresco. </li></ol></li><li> Posizionare tutto il tessuto in una bottiglia di vetro da 500 ml contenente 400 ml di soluzione sterile 80% (v / v) di glicerolo soluzione per 24 ore a temperatura ambiente. Trasferimento a 400 ml di soluzione sterile 90% (v / v) di glicerolo per altre 24 ore. </li><li> Conservare in 400 ml di soluzione di glicerolo sterile al 100% a temperatura ambiente per un minimo di 4 mesi a disidratarsi e sterilizzare il tessuto preservando l&#39;integrità della membrana basale. </li></ol> 4. Produzione della cultura mediatica <ol><li> Preparare siero di vitello neonato chelato per l&#39;uso nel terreno di coltura. <ol><li> Versare 100 g di Chelex 100 in una bottiglia di vetro 1 L e aggiungere acqua deionizzata. Il volume esatto non è critica ma acqua sufficiente deve essere aggiunto a coprire la polvere Chelex. Aggiungere un agitatore magnetico e sterilizzare in autoclave (121 ° C per15 min). </li><li> Lasciare che la bottiglia si raffreddi e la Chelex di stabilirsi. In una cappa a flusso laminare versare l&#39;acqua in eccesso, aggiungere 500 ml di siero di vitello neonato (NCS) e lasciare suscitare una notte a 4 ° C. </li><li> Smettere di mescolare, lasciare il Chelex di stabilirsi, questo può richiedere fino a 30 minuti. In una cappa a flusso laminare decantare il siero chelato con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il Chelex, e conservare in 10 ml aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparare tre diversi media in una cappa a flusso laminare, che inizia con pro-proliferativa e termina con formulazioni pro-differenziativi. <ol><li> Preparare Composite Media I composto da DMEM e Hams F12 in un rapporto 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutammina, 0.5 mg / ml idrocortisone, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodotironina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesterone, 10 mg / ml ininsulina, 10 ug / ml transferrina, 10 ng / ml di selenio, 1 x 10 -3 M etanolammina e 0,1% (v / v) chelato NCS. </li><li> Preparare Composite Media II come Composite Media I eccetto sostituire siero chelato con 0,1% (v / v) non chelato NCS. </li><li> Preparare composito medio III come Composite Media II tranne progesterone omettere e siero aumento al 2% (v / v) non chelato NCS. </li></ol></li></ol> 5. La produzione della mucosa esofagea modello umano <ol><li> Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare, con tecnica asettica per mantenere un ambiente sterile. Sterilizzare tutti gli strumenti da immersione in etanolo al 70% per 5 minuti, prima di risciacquare in PBS sterile. </li><li> Il giorno prima che sia necessario, reidratare il acellulare suina patibolo esofageo. Un pezzo di scaffold è richiesto per ogni costrutto per essere preparati. <ol><li> Per reidratare i tessuti posto sufficienti pezzi di ponteggio suina in una pentola contenente 100 ml di PBS sterile, agitarsi e ammollo per 10 minuti. Decant PBS e sostituirlo con PBS fresco. Ripetere il processo di lavaggio cinque volte per garantire la rimozione di ogni traccia di glicerolo. </li></ol></li><li> Testare la sterilità scaffold incubando il tessuto reidratato notte in 100 ml di DMEM a 37 ° C. Se non vi è alcun cambiamento del colore o torbidità del terreno di coltura alla fine del periodo di incubazione del ponteggio viene considerato sterile. Una volta che la sterilità è stata confermata, posizionare il 5 centimetri 2 acellulare ponteggio in un piatto ben 6, lato sottomucosa alto. </li><li> Inserire un anello sterile grado medico acciaio inossidabile (diametro interno 10 mm, diametro esterno 20 mm) sul centro di ciascun scaffold e premere delicatamente con pinza sterile, per garantire una tenuta adeguata con il tessuto. </li><li> Raccogliere i fibroblasti utilizzando Tripsina-EDTA 13 per produrre una sospensione cellulare. Contare le cellule utilizzando un emocitometro 14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un appropriate volume di terreno fibroblasti per produrre un conteggio cellulare finale di 2,5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di terreno fibroblasti, contenente 5 x 10 5 fibroblasti esofagee umani, all&#39;interno di ogni anello. Inondare la zona intorno all&#39;esterno dell&#39;anello con circa 2 ml di terreno di fibroblasti. Incubare a 37 ° C in un CO 2, atmosfera umidificata al 5%. </li><li> Dopo 24 ore rimuovere il anelli e fibroblasti medio e aggiungere almeno 5 ml di terreno di fibroblasti fresco in ogni pozzetto, assicurando che il ponteggio è totalmente immerso nella media. Culture per 1 settimana a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata sostituendo la soluzione ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Dopo 1 settimana rimuovere le piastre e 6 contengono i ponteggi ad una cappa diluvio laminare, rimuovere il supporto e capovolgere ogni impalcatura con pinza sterile, ponendo la superficie della mucosa superiore. Questo punto di tempo è indicato come giorno 0. </li><li> Posizionare gli anelli in acciaio sulla superficie della mucosa nel centro diil tessuto come al punto 5.4. </li><li> Preparare i flaconi T75 delle cellule epiteliali per tripsinizzazione 13. Dopo il lavaggio PBS e prima dell&#39;aggiunta della soluzione di tripsina-EDTA, aggiungere 2 ml di soluzione sterile 0,02% (w / v) di EDTA a ciascun contenitore. Incubare per 2 min a 37 ° C. Toccare delicatamente il pallone staccare selettivamente lo strato alimentatore i3T3 lasciando le cellule epiteliali allegati. Nota: Generalmente non è pratico o necessario al paziente abbinare le cellule epiteliali dei fibroblasti già incorporati nel modello della settimana precedente. </li><li> Eliminare la soluzione EDTA contenente il livello di alimentazione e aggiungere la soluzione tripsina-EDTA per raccogliere le cellule epiteliali 13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro 14. Centrifugare la sospensione cellulare (10 minuti, 200 xg). Risospendere il pellet di cellule in un volume appropriato di composito Piano 1 per produrre un conteggio cellulare finale di 5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di composito Media I, contenente 1 x 10 6 cellule epiteliali, all&#39;interno del ring. Inondare la zona intorno all&#39;esterno dell&#39;anello con circa 2 ml di Composite medio I e posizionare i costrutti in incubatore a 37 ° C in 5% CO 2, atmosfera umidificata. </li><li> Dopo 24 ore (giorno 1) rimuovere gli anelli e medie e aggiungere almeno 5 ml di fresco Composite Medio I, garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare alla incubatrice. Dopo un ulteriore 24 ore (Day 2) rimuovere il supporto e sostituiti con almeno 5 ml di Composite Media II, ancora una volta garantendo i ponteggi sono completamente sommerse e tornare al incubatrice. </li><li> Il giorno 4 place grado medico sterile griglie maglia di acciaio inossidabile (2 cm di larghezza x 2 centimetri alti lunghezza x 0,5 cm), entro piastre 6 e fresco, uno per ogni costrutto. Utilizzare pinzette sterili per trasferire i costrutti sulla parte superiore delle griglie in acciaio, mucosa alto superficie. <ol><li> Aggiungere sufficiente Composite Piano III in modo che il liquido raggiunge la parte inferiore del composito, ma la superficie èesposto all&#39;aria, questo assicura che il campione viene mantenuto ad una interfaccia aria-liquido. Il volume esatto di medio richiesto varierà a seconda dello spessore del ponteggio, il volume del pozzo e l&#39;altezza esatta del reticolo in acciaio inossidabile. </li></ol></li><li> Mantenere i compositi in un&#39;interfaccia aria-liquido da 10 a 20 giorni (giorno 14 al giorno 24), a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. Sostituire il composito medio III con terreno fresco ogni 2 o 3 giorni (Lunedi, Mercoledì, Venerdì è un regime user-friendly). Nota: Dopo 5 giorni a un&#39;interfaccia aria-liquido (giorno 9) i costrutti hanno un epitelio esofageo sufficientemente maturo per essere utilizzato in esperimenti di impatto dei fattori ambientali sull&#39;epitelio esofageo. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, fissare i costrutti per analisi istologica e immunoistochimica 7, o estratto proteico 15 o RNA 11,16 dall&#39;epitelio per ulteriori analysè. Se necessario, trattenere il terreno di coltura condizionato per analisi di molecole di segnalazione 17 extracellulari. </li></ol>

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	<li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li><li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+effect+of+bile,+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa.">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture.">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression,+hTERT+activation,+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development,+invasion,+and+differentiation.">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li><li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model.">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation.">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li><li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty.">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li><li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model.">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li><li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa.">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li><li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer.">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells.">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta,+p+53+and+Ki67+protein+in+normal,+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues.">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li><li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+keratins:+biology+and+pathology.">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li><li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo manoscritto descrive la produzione e caratterizzazione di un modello mucosa esofagea umana biologicamente rilevante adatto per l&#39;uso come una piattaforma sperimentale per studiare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori di stress ambientali sulla dell&#39;epitelio esofageo. I passi più critici per la produzione di successo di un modello mucosa esofagea umano sono: garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali rimangono proliferativa e non hanno già cominciato a di...

La mucosa esofagea comprende una stratificato, epitelio squamoso sopra uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria, ed è uno dei primi siti per incontrare stress ambientali ingeriti. L&#39;esposizione a tossine alimentari è implicato nello sviluppo del carcinoma squamoso dell&#39;esofago, mentre reflusso duodenogastro-esofageo è un fattore critico nella patogenesi della Barrett Metaplasia, che è associata ad un aumentato rischio di progressione di adenocarcinoma esofageo. Carcinomi esofagei sono l&#39;8 ° più comune tumore maligno nei maschi del Regno Unito e di adenocarcinoma esofageo è in rapido aumento nel mondo occidentale 1. Inoltre, c&#39;è stata poca miglioramento nella prognosi della malattia, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni complessiva di circa il 15%. Di conseguenza, vi è la necessità per le piattaforme sperimentali per studiare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori di stress ambientali su questo epitelio esofageo e il loro potenziale coinvolgimento nella svipment di metaplasia o neoplasia. Sebbene linee cellulari immortalizzate o tumorali permettono ai ricercatori di studiare la risposta delle cellule epiteliali a questi fattori di stress in vitro, rimangono proliferativa e non riescono a differenziarsi in cellule epiteliali mature trovate su gli strati superficiali della mucosa esofagea. Inoltre, linee cellulari che hanno già subito tumorigenesi possono fornire solo informazioni limitate per quanto riguarda le reazioni iniziali di cellule normali all&#39;interno dell&#39;epitelio a fattori ambientali; e questa è la fase in cui il potenziale di intervento terapeutico potrebbe essere più alta. Infine, i sistemi di coltura cellulare convenzionali non riescono a catturare le interazioni potenzialmente importanti tra cellule epiteliali e mesenchimali e tra queste cellule e la matrice circostante che si verificano all&#39;interno dei tessuti in vivo. Modelli animali forniscono un microambiente più realistico per studiare le risposte del epitheli esofageoum e può incorporare l&#39;induzione artificiale della malattia da reflusso gastro-esofageo 2. Tuttavia può essere più impegnativo per manipolare i fattori di stress ambientali in questi modelli, e non può rappresentare appieno la risposta entro dell&#39;esofago umano. Altri modelli sperimentali esofagee umani sono stati sviluppati che utilizzano cellule primarie, cellule immortalizzate o linee cellulari tumorali su un collagene, o combinati collagene / Matrigel, impalcatura contenenti fibroblasti 3,4. È meno laborioso per generare questi scaffold rispetto al ponteggio esofageo acellulare descritto in questo manoscritto, e questi modelli organotipiche fornire uno strumento utile, in particolare nello studio di invasione del 5,6, dove l&#39;infiltrazione delle cellule tumorali nel gel di collagene può essere prontamente osservato. Tuttavia questi gel di collagene hanno non nativi proprietà meccaniche e mancano di alcune caratteristiche del tessuto originale, tra cui una membrana basale specifico e l&#39;appropriate topografia della superficie. Ciò può influenzare il comportamento delle cellule con conseguente, ad esempio, più povera adesione tra l&#39;epitelio e scaffold utilizzando un gel di collagene scaffold 7. Di conseguenza è stato sviluppato il acellulare porcine scaffold esofageo, con il vantaggio di essere un ponteggio biologicamente più realistica e quindi più appropriato per l&#39;uso come una piattaforma sperimentale. E &#39;stato anche dimostrato che è preferibile incorporare cellule primarie nei costrutti esofagee di linee cellulari immortalizzate esofagee epiteliali, come Het-1A, poiché queste cellule formano un epitelio multistrato ma non riescono a stratificare o differenziare 4,7,8 . Di conseguenza, questo protocollo è stato adattato da un metodo già in uso in laboratorio MacNeil per fare ingegneria tessutale della pelle e della mucosa orale 9,10 e incorpora un porcine scaffold esofageo de-cellularized combinata con cellule primarie umane esofagee epiteliali e fibroblasti. Thiprotocollo s produce un maturo, epitelio stratificato, simile a quello della normale esofago umano come dimostrato da CK4, CK14, Ki67 e involucrin colorazione. Il modello risultante fornisce una piattaforma sperimentale per studiare le risposte ai fattori di stress ambientale, ed è stato utilizzato in modo efficace per studiare i cambiamenti nell&#39;espressione genica nell&#39;epitelio esofageo in risposta a refluito componenti 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

L&#39;incidenza di adenocarcinoma esofageo e il suo precursore, metaplasia di Barrett, sono in rapido aumento nel mondo occidentale. Inoltre adenocarcinoma esofageo ha in genere una prognosi infausta, con scarso miglioramento dei tassi di sopravvivenza negli ultimi anni. Queste sono condizioni difficili da studiare e vi è stata una mancanza di piattaforme sperimentali adatti per indagare i disturbi della mucosa esofagea. Un modello della mucosa esofagea umano è stato sviluppato in laboratorio MacNeil che, a differenza dei sistemi di coltura cellulare 2D convenzionali, ricapitola le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice presenti in vivo e produce un maturo, epitelio stratificato simile a quello della normale umana esofago. In breve, il modello si usano cellule non trasformate normali primari fibroblasti umani esofagee e epiteliali coltivate all&#39;interno di un ponteggio acellulare esofageo suina di derivazione. Caratterizzazione immunoistochimica di questo modelloda CK4, CK14, Ki67 e involucrina colorazione dimostra adeguata ripresa del istologico della mucosa esofagea umano. Questo modello fornisce un robusto, modello sperimentale biologicamente rilevanti della mucosa esofagea umana. Può essere facilmente manipolato per indagare su una serie di domande di ricerca, tra cui l&#39;efficacia di agenti farmacologici e l&#39;impatto dell&#39;esposizione a fattori ambientali, come l&#39;alcool, le tossine, ad alta temperatura o componenti refluito gastro-esofageo. Il modello facilita anche periodi prolungati di coltura non ottenibili con coltura cellulare convenzionale 2D, consentendo, tra l&#39;altro, lo studio dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di un epitelio maturo per l&#39;agente di interessi per un massimo di 20 giorni. Inoltre, una varietà di linee cellulari, come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett, può essere incorporata nel modello per studiare processi come invasione tumorale e responsivene drogass in un ambiente più biologicamente rilevante.

Questo manoscritto descrive il processo necessario, indicata schematicamente in figura 1, alla cultura modelli 3D dell&#39;epitelio esofageo umana con successo. Per confermare l&#39;idoneità del modello come una piattaforma sperimentale istologico e gli studi di immunoistochimica sono stati intrapresi confrontando i tessuti coltivati ​​con mucosa esofagea squamose umano. Valutazione istologica dell&#39;epitelio prodotto con il metodo descritto mostra un maturo, multistr...

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Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all&#39;interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Views.  University of Sheffield.  Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano. 