Özofagus skuamöz hücreli karsinomu ESCC, ölümcül ve tüm dünyada yaygındır. Üç boyutlu organoidler, ESCC'nin ağır yüküyle mücadele etmek için alandaki ilerlemeyi hızlandırmak için kullanılabilir. 4NQO ile tedavi edilen farelerden elde edilen tek hücreli 3D organoidler, ESCC'nin başlatılmasına ve geliştirilmesine eşlik eden moleküler değişikliklerin fonksiyonel ek açıklaması için kolayca ve ucuz bir şekilde manipüle edilebilir.
Bu model, mutajen kaynaklı tümörlerin genetik heterojenliğini yakalar. Bu nedenle, bu organoidler, yeni terapötik stratejileri test etmek veya tümörigenezi yönlendiren belirgin genetik değişiklikleri tanımlamak için fizyolojik olarak ilgili bir platform sağlar. Hayvan diseksiyonu ve organ toplamanın gösterilmesine yardımcı olan bir personel ortağı olan Yasuto Tomita olacak ve parafin gömme prosedürü için organoidin hazırlanmasını gösteren Norihiro Matsuura, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırma görevlisi olacak.
Başlamak için, orta karın kürkünü sıkıştırarak ve cerrahi makas kullanarak ötenazi farelerin derisini açın, alt karın bölgesinden çeneye kraniyokaudal, ventral orta hat insizyonu yapın. Orta hat insizyonundan başlayarak, farenin her iki tarafındaki uzuvlara uzanan radyal kesikler yapın, cilt kapaklarını şişirin. Servikal trakeayı açığa çıkarmak için, diseksiyon makası kullanarak, tükürük bezlerini orta hatta bölün.
Torasik trakeayı açığa çıkarmak için sternumu çıkarın. Peritonu forseps ile hafifçe sıkıştırın ve kaldırın ve periton kraniyokaudal olarak bölmek için makas kullanın. ve yanal olarak göğüs kafesi boyunca.
Karaciğeri diyaframın kaudal yüzeyinden yavaşça geri çekin ve sternal çentikteki diyaframda, özellikle ksifoid işlemin dorsal yüzeyinde küçük bir kesi yapmak için makas kullanın. Göğüs kafesi torasik içerikten ayrıldıktan sonra, diyaframdaki insizyona makas yerleştirin ve aşağıdaki organların zarar görmesini önlemek için sternumun dorsal yüzeyine yakından yapışan servikal kuşağa kraniyal olarak diseke edin. Makas kullanarak sternumun her iki tarafındaki kaburgaları kesin ve sternumu çıkarın.
Karın yemek borusunu açığa çıkarmak için, antrumu forseps ile tutarak mideyi önden yavaşça kaldırın. Makas kullanarak, dalak, pankreas ve mezenteri mide ve yemek borusundan diseke edin. Torasik yemek borusunu açığa çıkarmak için, trakeayı derhal kaudal olarak tiroid kıkırdağına yavaşça kaldırın ve iris makası kullanarak trakeanın dorsal tarafının yemek borusunu diseke edin.
Tiroid kıkırdağındaki trakeayı iris makası ile bölün. Trakeayı yemek borusunun geri kalanından kaudal yönde dikkatlice diseke ederek soyun. Akciğeri, kalbi ve timusu trakea ile tamamen çıkarın.
Mideyi pilorda makasla bölün. Antrumu forseps ile tutarak ve kraniyal olarak diseksiyon yaparak yemek borusunu omurdan ayırın. Yemek borusunu tiroid kıkırdağı seviyesinde bölün ve yemek borusu ve mideyi tamamen toplayın.
Yemek borusunu kardiyada bölerek mide ve yemek borusunu ayırın ve yemek borusunun dış yüzeyindeki herhangi bir fasyayı diseke edin. Histoloji için bir örnek ayırmak için, makasla uzunlamasına bölün. Kalan sağlam yemek borusunu ve soğuk PBS'yi buzun üzerine yerleştirin.
Mideyi daha büyük eğrilik boyunca açın ve PBS ile yeterince yıkayın. Ön mideyi ayırın ve soğuk PBS ile yıkayın. Dili hasat etmek için, iğnelenmiş iğneyi burundan çıkarın ve dili cımbızla çekin.
Dili mümkün olduğunca uzun süre kesin ve buz üzerinde soğuk PBS'ye yerleştirin. Ayrışmış dokuyu bir kültür kabına aktardıktan sonra, forseps kullanarak kas tabakasını epitelden dikkatlice çıkarın. Epiteli 500 mikrolitre% 0.25 tripsin içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 37 santigrat derece ve 800 rpm'de 10 dakika boyunca bir termomikserde inkübe edin.
Kısa santrifüjlemeden sonra, hücre süspansiyonunu dairesel hareketler kullanarak geniş delikli bir ucu olan 50 mililitrelik bir konik tüp üzerinde tutulan 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin, ardından yıkamak için dairesel hareketler kullanarak süzgeçten 3 mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü veya STI ekleyin, ardından hücreleri itmek için süzgeci 1 mililitrelik bir tüberkülin şırınga pistonunun tabanıyla ovalayın. Süzgeci 3 mililitre PBS ile 3 ila 5 kez yıkayın, süzgeci yıkamalar arasında şırınganın tabanıyla yıkayın. Hücreleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, yeniden süspansiyon için tüpte 1 mililitre çözelti bırakarak süpernatantı çıkarın.
Pelet yeniden askıya alındıktan sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpü tekrar santrifüj ettikten sonra, peleti 100 mikrolitre fare organoid ortamında veya MOM'da yeniden askıya alın ve otomatik bir hücre sayımı gerçekleştirin. Plaka 5,% 75 bazal membran ekstraktında veya BME'de 000 canlı hücre ve kuyu başına 50 mikrolitre toplam hacimli MOM.
200 mikrolitrelik geniş delikli bir uç kullanarak, uç ile kuyunun alt veya yanları arasındaki teması önleyerek her bir kuyunun ortasına yavaşça 50 mikrolitrelik bir damlacık ekleyin. BME'nin% 5 karbondioksit ve% 95 bağıl nem ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde 30 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, kuyucuk başına dikkatlice 500 mikrolitre MOM ekleyin.
MOM'u 3. veya 4. günde değiştirin ve daha sonra geçiş için hazır olana kadar bundan sonra her 2 ila 3 günde bir değiştirin. Çözülmemiş BME'yi buz üzerinde tutun, MOM'u,% 0.05 tripsin ve STI'yi kullanmadan önce 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Geniş delikli bir mikropipet ucu kullanarak, BME kubbesindeki organoidleri süpernatant ile birlikte toplayın ve yukarı ve aşağı pipetleme yaparak BME'yi bozun.
Organoid pelet kısa santrifüjleme ile elde edildikten sonra, yerinden çıktıktan sonra,% 0.05 tripsin 500 mikrolitre içinde tekrar askıya alın. Tüpü bir termomikserde 37 santigrat derece ve 800 rpm'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsini 600 mikrolitre CY ile etkisiz hale getirin.
Süpernatanı santrifüj edip attıktan sonra, hücre peletini 100 mikrolitre MOM içinde yeniden askıya alın. Tripan mavisi dışlama ile otomatik hücre sayımı gerçekleştirin. Organoidleri sabitlemek için, peleti yavaşça yerinden çıkarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede 300 mikrolitre% 4 paraformaldehit içinde yeniden askıya alın.
Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüp rafını ters çevirerek ve yüzeyi bir tavan filmi tabakasıyla kaplayarak bir gömme yüzeyi hazırlayın, ardından karşılık gelen organoid kimlikle etiketleyin. PBS ile yıkanmış organoid pelet içinde çıkarılan paraformaldehiti, tüpün yan tarafına 50 mikrolitre agar ekleyerek dikkatlice yerleştirin. Bu adımı yineleyin.
Pelet rahatsız etmeden, agar jel damlacığındaki peleti, 45 dakika boyunca 4 santigrat derecede katılaşma için gömme yüzeyindeki tavan filmine aktarın. Forseps kullanarak, katılaşmış organoid pelet içeren damlacığı etiketli bir patoloji kasetine dikkatlice aktarın. Normal murin özofagus dili ve ön mide organoidleri parlak alan görüntüleme ve histolojik boyama ile morfolojik olarak incelendi.
4NQO ile tedavi edilen bir fareden alınan özofagus skuamöz hücreli karsinom, nükleer atipi ve ani keratinizasyon gösterdi. Alt kültür üzerinde organoid oluşum hızının belirlenmesi ile değerlendirilen organoidlerin kendini yenileme kapasitesi, olgunlaşmış organoidlerde azalmış proliferatif bazaloid hücreleri yansıtan zamanın bir fonksiyonu olarak oluşum hızının azaldığını göstermiştir. Organoidlerin büyüme kinetiği, çeşitli zaman noktalarında morfolojileri ile ortaya çıkar.
Organoidlerin iç çekirdeğinin keratinizasyonu 10. günde belirginleşir. Proliferatif bazaloid hücreler, 14. gün ve 21. gün zaman noktalarında bile en dıştaki hücre tabakasında kalır. 4NQO ile tedavi edilmemiş farelerden üretilen normal fare dili organoidlerinin iki katına çıkan bir popülasyon eğrisi, çoklu pasajlar ve uzun vadeli kültür üzerinde istikrarlı büyümelerini göstermektedir.
Organoidler, yeni terapötik hedefleri tanımlamak için yüksek verimli tarama, spesifik gen fonksiyonunu sorgulamak için CRISPR tabanlı düzenleme veya tümör mikro ortamındaki hangi etkileşimlerin dönüşümü etkilediğini tanımlamak için ko-kültür için platformlardır. Bu teknik, kısmi EMT ve HPV enfeksiyonu gibi fenomenleri, aerosindirim sistemi skuamöz hücreli kanserlerinin biyolojisinde bağışıklık sistemi ile etkileşimleri ile birlikte araştırmamızı sağlamıştır.
