The authors have no acknowledgements.

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız Sydney İl Sağlık İlçe Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır. izin prosedürleri, proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahı sağlayacak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri mevzuat uyumu sağlayın. 1. Protokol EM sabitleyici Hazırlama için <ol><li> Sabitleştirici 100 ml için, 65 ° C bir konik bir şişe içinde 25 ml distile su, ısıya paraformaldehit toz 2 g eklenerek manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmak suretiyle paraformaldehid hazırlar. NOT: Glutaraldehyde, paraformaldehıt ve sodyum kakodilat tampon tüm tehlikeli maddeler ve her zaman fumehood ele alınmalıdır. </li><li> Daha sonra soğumaya bırakın 65 ºC min 2 ısı. Gerekirse, sodyum hidroksit çözeltisi ekleme dropwISE tamamen çözeltinin-berraklaştırılması için karıştırılırken. NOT: sodyum hidroksit tehlikeli, dikkatli olun. </li><li> EM notu stok glutaraldehit 10 ml, 50 ile 0.2 M sodyum kakodilat tamponu ml sükroz 2 g ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 1.0 M CaCl 2 2 ml ekleyin. </li><li> Damıtılmış su ile 100 ml&#39;ye solüsyonu yapmadan önce pH 7.4&#39;e ayarlayın. Nihai sabitleyici% 2.5 glutaraldehit,% 2 paraformaldehit, 2 mmol CaCl2, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 2 sukroz içermektedir. Toplam Osmolalite 440 mOsmol / L olduğundan emin olun. Preparat 24 saat içinde kullanın. </li></ol> Karaciğer 2. perfüzyon Fixation <ol><li> 37 ºC - 35 Sıcak perfüzyon tampon ve fiksatif. kan kaybı tamponu ve fiksatif doğru sıcaklık doku bütünlüğünü sağlamak için yardımcı olur. </li><li> 50 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg iksilazin tek bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezi uygulayın. </li><li> Hayvan altına alındıktan sonraarka bacak çekilmesi ve kuyruk tutam tarafından değerlendirilen derin anestezi, Y kesi karaciğer ve portal ven ortaya çıkarmak için hayvanın karın künt uçlu makas ile yapılır. NOT: Bu ekipman kolayca SEM görülecektir mikroorganizmalar ve genel enkaz ile örneklerin kirlenmesini önlemek için temiz olduğundan emin olun. </li><li> Diğer daha distalde karaciğer, karaciğer portal ven yaklaşık bir proksimal iki çok gevşek sütür kravat. </li><li> Kanül sabitlemek için .Tighten dikişler (fareler için sıçanlar için 18 G, 22 G) uygun boyutta IV kanül ile portal ven cannulate. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su ile perfüzyon başlar 37 ° C ısıtıldı ve H 2 0 10 cm arasında bir basınçta. PBS içinde 5 ila 20 mi, genellikle karaciğer asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​için gereklidir. NOT: hava kabarcıkları da embolizasyon ve basınca sekonder eserler neden olarak kanül bağlı tüpler aracılığıyla karaciğer girmesine izin vermeyin; Hepatositlerde hasar, siPerfüzyon basıncı fazla yüksek ise, nusoids ve LSEC fenestrasyonlar oluşur. </li><li> Abdominal ve torakal vena kava tampon karaciğer serbestçe çıkmak için izin Sever. Bu LSECs yüksek geri basınç hasarını önler. </li><li> Karaciğer kan ücretsizdir sonra, EM fiksatif ile PBS değiştirin ve karaciğer sertleştirilmiş ve çok solgun kadar, yaklaşık 5 dakika boyunca serpmek. </li><li> Perfüzyon durdurun ve 1 sabitlenir karaciğer kesti - keskin neşter kullanılarak 2 mm 3 blok. </li><li> 4 ºC&#39;de 72 saat - 24 EM sabitleştirici sonrası düzeltme doku. Not: Genellikle, underfixation overfixation daha eserler neden olur. </li><li> 4 ºC&#39;de depolama için 0.1 M sodyum kakodilat tampon sonrası düzeltme dönemi izleyen sabitleyici değiştirin. NOT: Bu şekilde saklanan örnekler bir (12 aya kadar) önemli zaman döneminde, ancak zamanında ikincil sabitleme için korunacaktır ve sınav En iyi sonuçlar için tavsiye edilir. </li></ol> 3. İğne Perfusion NOT: İğne sabitleme doğrudan biyopsi karaciğer dokusu içine fiksatif enjekte edilmesini içeren perfüzyon fiksasyon bir çeşididir. sabitleştirici onları asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve sabitleştirici doku bloğun tüm teşhir amacıyla kan damarları aracılığıyla temizlenmesi için amaçtır. Bakım basınç yaralanması 18,19 önlemek için düşük enjekte etme basıncını tutmak için alınmalıdır. <ol><li> Hayvan veya konunun karaciğer küçük bir parça çıkarıp kan ve enkaz kaldırmak için tuzlu suda durulayın. </li><li> Ince uçlu bir iğne (tipik olarak bir insülin şırıngası) ile donatılmış bir şırınga halinde normal tuzlu su çizin. </li><li> Kan dokusu dışarı kızarmış kadar karaciğere çok yavaş tuzlu su enjekte edilir. Çoklu enjeksiyonlar gerekebilir. </li><li> Ince delikli bir iğnesi (tipik bir insülin şırınga) ile donatılmış bir başka şırınga içine EM fiksatif çizin. </li><li> Zor ve renk tan hale gelinceye kadar karaciğere çok yavaş fiksatif enjekte edilir. Çoklu püskürtmes gerekebilir. </li><li> Keskin bir neşter kullanılarak 2 mm 3 blok - 1 içine sabit karaciğer kesin. 72 saat 4 ° C - 24 EM sabitleştirici kuluçkaya yatmaktadır. İkincil fiksasyon başlamadan önce 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kere yıkayın. </li></ol> Taramalı Elektron Mikroskobu için 4. Hazırlık <ol><li> Yıkama örnek 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kez. Lipidler düzeltmek için, sonrası 2 saat süreyle 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde% 2 osmiyum tetroksit numuneyi düzeltin. NOT: glutaraldehit ve osmiyum tetroksit çapraz reaksiyona ve SEM eserler üretmek olarak komple yıkama çok önemlidir. </li><li> Dehidrasyonu başlatma etanol artan konsantrasyonlarda örnekleri durulayın. 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde ilk durulama; % 70 etanol ile 5 dakika boyunca, sonra 3 kez; % 90 etanol ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın; % 100 etanol içinde 5 dakika için 2 defa yıkayın; ve son olarak% 100 etanol (moleküler elek) içinde 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın. </li><li> Örneklerinden her etanolü çıkarmak<html> ve fumehood içinde ve heksametildisilazan (HMDS) ile değiştirin ve 10 dakika süre ile bırakın. Doku örneklerinden HMDS &#39;yi çıkarın ve buharlaşmasına izin verin. NOT: Bu nedenle son dehidrasyon aşaması için kullanmadan önce RT ulaşmak için izin yaparken soğuk HMDS oldukça higroskopik olduğunu. </li><li> İsteğe bağlı olarak, hemen örnekleri monte veya SEM mount hazır olana kadar bir kurutucu içine yerleştirin. </li></ol> 5. Montaj NOT: Doğru örnek montaj SEM altında analiz için kullanılabilir açıkça belirlenen sinüzoidler sayısını en üst düzeye çıkaracaktır. <ol><li> Metal SEM taslakları tabanını Etiket ve taslakları üstüne çift taraflı iletken karbon bandı uygulayın. </li><li> Sonraki SEM için en iyi sinüzoidlerin ile yüzeyi tanımlamak için diseksiyon mikroskop kullanılarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Saplama karbon bant yüzeyine yukarı o yüzeyi yerleştirin. </li><li> Çubuk örnekleri sıkıca saplama, numuneler artık serpme kaplama için hazırız. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6.. Kaplama NOT: Bir püskürtme kaplayıcı gerekçesiyle numune iletken metal (altın veya platin) ince bir film ile kaplanması örnek ve elektron ışını hasardan korur. Kaplama ise ilgi çok kalın yapıları gölgede olabilir. <ol><li> Otomatik ince püskürtme kaplayıcıda vakum odasına yerleştirin taslakları, 45 saniye boyunca rotasyona modu ve otomatik püskürtme kaplama ayarlayın. Ancak altın da uygundur, ince ayrıntılarıyla için platin kaplama kullanın. </li><li> Monte karaciğer örneklerinin dış yüzeylerine karbon boya ince bir tabaka sürün kat değil sinüs yüzeyleri özen. </li><li> Örnekler platin ile kaplanır ve karbon boya kuruduktan sonra da SEM ile ilgili gözlem için hazırdır. Örnekler bir kurutucu içinde saklanabilir. </li></ol> 7. Tarama Elektron Mikroskobu Kullanımı <ol><li> Yer taramalı elektron mikroskobu içine numune ve vakum mikroskop dönün. &lt;/ Li&gt; <li> Düşük büyütmede başlanarak numunelerin görünüm için standart mikroskop çalışma prosedürleri kullanarak, giderek artan büyütme. </li><li> Mikroskop mesafe, nokta boyutunu ve astigmatizma çalışmak için uygun ayarlanır emin olun. </li><li> Tespit bütünlüğü için kontrol edin. LSEC boşluklar çoğunlukla ücretsiz ve 30 ölçüm fenestrasyonlar içeriyorsa - 250 nm çapında bu genellikle o numune hazırlama başarılı olmuştur işaret eder. </li><li> Sinüzoidlerinde boşlukların tamamen veya fenestrasyonlar yoksun iseniz numune hazırlama başarılı olmamıştır veya önemli bir patoloji yoktur. Bu durumda, çok ince bir jilet ile örnek dilim ve kesme yüzeyleri kaplanabilir ve başarılı bir şekilde sabit sinüzoidler için analiz edilmiştir. </li><li> Yaklaşık 15.000-20.000 × büyütme iyi fiksasyon ve fenestrasyonlar açıkça (görünür nerede genellikle en az 10 fenestrasyonlar içeren enkaz ücretsiz düz LSEC yüzeyleri seçin). </li><li> Karaciğer başına en az iki blok kullanılarak, blok farklı alanlarından, karaciğer başına en az 10 sinüzoidler görüntülerini kaydedin. 15.000 10 mikrografları Örnekleme - fenestrasyonlar ölçümü tüm karaciğer temsilcisi olmak için hayvan başına 20.000 × büyütme genellikle yeterlidir. </li></ol> 8. Analiz NOT: NIH ücretsiz indirebilirsiniz ImageJ yazılım fenestrasyonu çap ve frekans (ölçmek için kullanılmaktadır <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Açık Resim J ve resim (Ekran shot 1) gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın. </li><li> Fenestre ve defenestrated alanlar dahil LSEC tüm düz alanı etrafında çokgen ImageJ aracını iz kullanma. Bu yanlış gözenekliliği şişirmek gibi sadece elek plakaları iz yok. Obscuri olabilir hücre yüzeyi üzerinde artıkların herhangi bir büyük parçalar hariçng fenestrasyonlar. </li><li> , Fenestrasyonu çapını ölçmek satırı aracını seçerek her fenestrasyon en uzun çapı boyunca bir çizgi takip ve çizgi ölçmek için &quot;m&quot; basın ve &quot;D&quot; kalıcı resmin üzerine çizgi çizmek (berabere). Bu çizgi fenestrasyonu çapı olarak tanımlanır. hat uzunluğu artık ImageJ sonuçları kutunun (Ekran shot 2) satışa sunulacak. </li><li> Daha büyük 250 nm üzerindeki LSEC sitoplazmada delikler, hem de fenestrasyonlar tüm boşlukları ölçün. Boşluklar genellikle boşluklar da hastalık ve toksisite sonucu oluşabilir, ancak kötü perfüzyon veya fiksasyon, yansıtan eserler bulunmaktadır. boşluklar verileri daha sonra analiz fenestrasyon parametrelerinin hesaplanması dışında tutulacaktır. </li><li> Dairesel olmayan boşluklar alan boşlukları etrafında izleme ve ImageJ kendi alanını hesaplayarak hesaplanmalıdır. </li><li> Furthe için bir EXCEL elektronik tabloya ImageJ sonuçları kutusundan verileri yapıştırınr analizi. </li></ol> 9. Hesaplamalar <ol><li> (Boşluklar ≥ 250 nm boşluklar, dahil değil) Tüm fenestrasyonu çapları ortalama fenestrasyon çapı = ortalama. </li><li> R, yarıçap, tek tek fenestrasyon çapı (r = D / 2), aşağıdakileri içeren olmayan boşluklar hesaplanır fenestrasyon alan = πr 2. </li><li> Gözeneklilik (%) = (Σ (πr 2) / analiz edilen toplam alan - boşlukların Σ (alan =)) (2 um)) x 100. </li><li> Fenestrasyonu frekansı = fenestrasyonlar toplam sayısı / (toplam alan (boşlukların alan) (mikron 2)-Σ analiz. </li></ol> Fenestrasyonlu Verilerin 10. Sunumu NOT: fenestrasyonu verilerinin ölçümü de dahil olmak üzere Mümkün yayınlar aşağıdaki bilgileri içermelidir <ol><li> Kullanılan sınır çapları genellikle (fenestrasyonlar tanımlamak ne doğrulayan bir açıklama ile fenestrasyon çapı,fenestrasyonu frekans (sayı / um 2) ve porozite (%),) nm 50-250 arası. </li><li> Boşluklar analizi, fenestrasyon çapı ve ciğer, bloklar, görüntü ve fenestrasyonlar sayısının frekans dağılımı grafiği analize dahil edilmelidir dahil edilip onaylayan bir açıklama. </li></ol>

<ol>
	<li>Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).</li><li>Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+and+the+liver+sieve:+the+role+of+fenestrated+sinusoidal+endothelium+in+lipoprotein+metabolism,+atherosclerosis,+and+cirrhosis.">Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis.</a> Hepatology. 21, 863-874 (1995).</li><li>Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sieve:+considerations+concerning+the+structure+and+function+of+endothelial+fenestrae,+the+sinusoidal+wall+and+the+space+of+Disse.">The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse.</a> Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+feeding+and+fasting+on+fenestrations+in+the+liver+sinusoidal+endothelial+cell.">The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell.</a> Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+serotonin+receptor-2B+rescues+small-for-size+liver+graft+failure+in+mice.">Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice.</a> Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).</li><li>Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Loss+of+Responsiveness+to+2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine+in+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells.">Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+age+is+associated+with+ultrastructural+changes+in+isolated+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).</li><li>Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).</li><li>McLean, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+pseudocapillarization+of+the+human+liver.">Age-related pseudocapillarization of the human liver.</a> J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).</li><li>Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudocapillarization+and+associated+energy+limitation+in+the+aged+rat+liver.">Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver.</a> Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acute+oxidative+stress+on+the+ultrastructure+of+the+perfused+rat+liver.">The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver.</a> Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).</li><li>Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+liver+injury:+defenestration+in+noncirrhotic+livers-a+scanning+electron+microscopic+study.">Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study.</a> Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+liver+sinusoidal+endothelium+in+a+baboon+model+of+type+1+diabetes.">Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).</li><li>Fraser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+perfusion+pressure+damages+the+sieving+ability+of+sinusoidal+endothelium+in+rat+livers.">High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers.</a> Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+the+fenestrated+endothelial+lining+of+rat+liver+sinusoids.">An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids.</a> J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+characterization+of+the+endothelial+cell+in+the+rat+liver+sinusoid+under+normal+and+various+experimental+conditions,+as+a+contribution+to+the+distinction+between+endothelial+and+Kupffer+cells.">An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells.</a> J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).</li><li>Fahimi, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+and+immersion+fixation+of+rat+liver+with+glutaraldehyde.">Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde.</a> Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).</li><li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Vreuls, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-fixation:+a+novel+method+to+improve+microscopy+of+human+liver+needle+biopsies.">Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies.</a> Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).</li><li>Furrer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+reverts+age-related+capillarization+and+failure+of+regeneration+in+the+liver+through+a+VEGF-dependent+pathway.">Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OxLDL+induced+injury+and+defenestration+of+HLSECs+via+LOX-1.">OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1.</a> J Mol Endocrinol. , (2014).</li><li>May, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+model+for+conditional+induction+and+rescue+of+portal+hypertension+reveals+a+role+of+VEGF-mediated+regulation+of+sinusoidal+fenestrations.">A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations.</a> PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).</li><li>Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+can+act+as+vascular+permeability+factor+in+the+hepatic+sinusoids+through+upregulation+of+porosity+of+endothelial+cells.">VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).</li><li>Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD47-binding+peptide+of+thrombospondin-1+induces+defenestration+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells.</a> Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).</li><li>Wack, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+ultrastructure+evaluated+during+the+revascularization+of+regenerating+rat+liver.">Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.</a> Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).</li><li>Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sinusoidal+wall+permeability+and+liver+fatty+change+after+two-thirds+hepatectomy:+An+ultrastructural+study+in+the+rat.">Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat.</a> Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).</li><li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase&#8211;generated+superoxide.">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase&#8211;generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li><li>Barber&#225;-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life.">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid.">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperlipidemia+and+surfactants:+the+liver+sieve+is+a+link.">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

doğru ve tekrarlanabilir karaciğer sinüzoidal endotel durumunu ölçmek için yeteneği, bu son derece özel hücrelerin biyolojisinin anlaşılmasında önemli bir adımdır. Böyle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu 32, atomik kuvvet mikroskobu 33 d-STORM (doğrudan Stokastik Optik Reconstrucion Mikroskopi) 34 gibi daha yeni teknikler in vitro bu hücrelerin morfolojisi hakkında önemli bilgiler vermek, ancak SEM görselleştirmek ve onların yapısını ...

Karaciğer sinusoidal endotelyal hücreleri (LSECs) yüksek hepatik sinusoid duvarını kaplayan endotel farklılaşmış hücrelerdir. LSECs olmayan diyaframlı olan fenestrasyonlar ile delinir, transselüler çapı 50-250 nm gözenekleri. LSECs yüzeyinin% 20 kadar elek plakalar 1-3 (Şekil 1) olarak adlandırılan yüzlerce onlarca gruplar halinde genellikle fenestrasyon, ile kaplıdır. Fenestrasyonlar bir yüksek verimli ultrafiltrasyon sistemi oluşturmak, plazma ve kan ve hepatositler arasında nanosubstrates aktarımını sağlar. Fenestrasyonlar dinamik yapıları vardır - kendi büyüklüğü ve / veya numara hem çeşitli fizyolojik devletler, uyuşturucu ve hastalığa tepki olarak değiştirilebilir. Örneğin, fenestrasyonlar tok halde 4 daha aç bırakılmış daha büyük olan; Hücre yaşlanması ve bir çok hastalık durumunda 7-13 oluşur başına 5,6 ve büyüklüğü bir azalmaya ve fenestrasyonlar sayısı; 2-di-iodoamphetamine fenestrasyon sayısını artırır </sup&gt;. Fenestrasyonlar büyüklüğü ve sayısı doğru ölçümü LSEC morfolojisi, çeşitli hastalık, toksik ve fizyolojik devletler tarafından nasıl etkilendiğini anlamak için önemlidir; Karaciğer fonksiyon üzerindeki etkileri; ve geliştirmek için terapötik girişimlerin 1 fenestrasyonuna modüle. fenestrasyonlar çalışma zordur. sağlam karaciğer dokusu veya kültür LSECs hem daha önce sadece gözlem kullanılarak elektron mikroskobu mümkün olmuştur bu yüzden fenestrasyonlar çapı, geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü altında yatıyor. taramalı elektron mikroskobu (SEM), en sık SEM binlerce endotel yüzeyi ve ölçüm geniş alanların gözlem için sağlar, çünkü fenestrasyon boyutu, frekans ve gözeneklilik (fenestrasyon delinmiştir LSEC membran yüzdesi) incelemek için kullanılmıştır değil onlarca fenestrasyonlar binlerce eğer. Kendi programını rağmen, rapor sonuçlara yönelik çalışmalar SEM-tabanlıBu tür fenestrasyon boyut, sayı, frekans ve gözeneklilik LSEC parametreleri literatürde (Tablo 1) geniş çapta değişebilir. Fenestrasyonlar ve elek plakaları sözleşme, kırmak dilate veya numune hazırlanması sırasında birleşme kırılgan yapılardır, bu nedenle dikkatli işleme kendi bütünlüğünü korumak için gereklidir. Artmış perfüzyon basıncı 14; Fiksatif ve tampon 15 yanlış ozmolarite; yetersiz fiksasyon veya fiksasyon süresi; ve post-fiksasyon dehidrasyon ve kurutma hızı ultrastrüktürü korunması müdahale eserler (Şekil 2) üretebilir SEM için işleme her alanlardır. Fenestrasyonlar kaybı (&quot;Defenestration &#39;) ve fenestrasyon çekme indirgenmiş fenestrasyon çapı ve hücre gözeneklilik ile sonuçlanır, kötü tespitin sonucu olarak meydana gelebilir. SEM analizi için numunelerin korunmasını geliştirmek için yöntemler daha önce 15-17 tarif edilmiştir ve tartışılacaktırBurada örnek korunmasını artırmak için nasıl ek ipuçları. Numune korunması temel amaçları LSEC yüzeyi görsel böylece sinüzoidler kan kaldırmak ve yüksek basınç ya da geciktirilmiş tespit birinden LSEC zarar görmesini önlemek için vardır. Portal ven yoluyla fiksatif Whole karaciğer perfüzyon karaciğer fiksasyon için tercih edilen bir yöntemdir. Detaylı olarak tarif edildiği gibi başka bir yerde 16,18 perfüzyon düşük bir basınçta yapılmalıdır (örneğin, H 2 0 10 cm) LSEC basınçla ilgili perfüzyon eserler ve zarar gelmesini önlemek için, tipik olarak, hücre membranında içinde olduğu gibi büyük boşluklar göstermiştir. Başka bir yerde 19 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi Bununla birlikte, makul bir sabitleme genellikle, insan ve hayvanlarda karaciğer biyopsi iğnesi perfüzyon kullanılarak elde edilebilir. Kan örneği üzerinden temizlendi kadar bu teknik, doğrudan dokuya sabitleştirici enjekte içerir ve doku sağlam ve sabitlenir. Elektron mikroskobu için örneklerin Fixation perf olması gerekirkaraciğerleri derece hızlı otolitik süreçleri sonucunda ortaya çıkan ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek için kan akımının kesilmesini takiben mümkün olduğunca çabuk ormed. Biz de eserler dahil en aza indirir ve fenestrasyonlar ölçümünü standartlaştıran görüntü analizi bir yöntem mevcut. Gözeneklilik ve fenestrasyon frekansı için mikrograflar için sinüzoidler seçiminde değişimi, eserlerin görüntü analizi ve hücre alanının ölçümü geçme sonuçlarını büyük farklılıklara yol açmıştır. Değerlendirilmesi ve fenestrasyonları ve veri sunumu için minimum gereksinimleri ölçümü için bir standart yaklaşım açıkça daha önce 4,10,20-31 literatürde ele alınmamıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Taramalı elektron mikroskopisi işlemiyle düşük büyütme ilk görselleştirme çok büyük karaciğer damarları ve sinüzoidlerde (Şekil 1A) gözlemlemek için yeterince büyük bir açık alan ile, karaciğer numunesinin düz bir yüzey ortaya koyar. Montaj saplama doğru karaciğer blok yerleştirme sağlanması Bu nedenle (Şekil 1B) kaçınılmalıdır sinüzoidlerin ve karaciğer Glisson kapsülü net görüntüler elde etmek için gereklidir. Büyütme artan karaciğer yoğ...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Görüntüleme.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Video: A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Biyoloji

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...