Ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı); Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve NYSTEM (C026447 C026446) hibe yoluyla ileri araştırmacılar için bir burs ile desteklenmiştir.

1.. Kültür Medya, Kaplamalı Yemekleri ve hPSCs ve Bakım hazırlanması 1.1 Medya hazırlık Not: en fazla 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C&#39;de sterilizasyon ve mağaza için tüm ortamı Filtre. Reaktif isimler, şirket ve katalog numaraları Malzeme tabloda listelenmiştir. <ol><li> DMEM/10% FCS: 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep ve 5 ml L-Glutamin birleştirin. </li><li> HES-ortamı: 800 ml DMEM/F12, KSR 200 mi, 5 ml L-glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum esansiyel amino asitler çözeltisi, 1 ml β-mercaptoethanol birleştirin. FGF-2 ortamın süzülmesi ve sonra 10 ng / ml ilave edilir. DİKKAT: β-Mercaptoethanol inhalasyon, yenmesi ve cilt temasından kaçınmak, zehirlidir. </li><li> KSR-farklılaştırma ortamı: 820 ml DMEM Knockout, KSR 150 mi, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum esansiyel amino asitler çözeltisi ve 1 ml β-mercaptoethanol birleştirin. </li><li> N2-differentiatiortamı üzerinde: 980 ml ​​dH 2 O 12 g DMEM/F12 toz çözündürün 1.55 g Glukoz, 2 g sodyum bikarbonat ve 100 mg APO insan transferin ekleyin. Ortama çözünmüş çözeltisi ekleyin, 25 mg insan insülini ve 40 ul 1 N NaOH ile 2 ml dH 2 O karıştırın. 100 ul putressin dihidroklOliirürü, 60 ul selenit, 100 ul progesteron ekleyin ve dH 2 O. ile 1 L&#39;ye kadar ses getirmek </li></ol> Kültür kaplarına 1.2 Kaplama <ol><li> Matrigel kaplama: Çözülme 1 ml &#39;çözülene kadar bölenin üzerine 19 ml DMEM/F12 pipetleyerek matrigel alikosunu donduruldu. 40 mikron hücre süzgecinden ve plaka 8 ml/10 cm çanak geçirilerek kümeleri kaldırmak. Oda sıcaklığında 1 saat için yemekler inkübe edin. Hücrelerin hemen önce, kaplama Matrigel aspire. Not: 4 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklarda gelme çünkü matrigel ile hızlı çalışın </li><li> PO / Lam / FN kaplama: 10 cm çanak için 15 ug / ml Poli-L Ornithin hidrobromitin içeren 1x PBS 10 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe çanak 1x kez PBS ile yıkayın plakaları ve 2 ug / ml fare Laminin-I ve 2 ug / ml ihtiva eden fibronektin 1x PBS 10 ml/10 cm tabak ekleyin. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe yemekler Hücreleri kaplama önce tamamen çözüm kaldırmak ve plakalar üzerinde kapak olmadan doku kültürü kaputu duvara onları ayakta tarafından 15-20 dakika oda sıcaklığında iyice kurumasını bekleyin. Not: yemekleri bir (gözle görülebilir) yüzeyinde kristal yapıları görebilirsiniz zaman tamamen kuru ve hücre kaplama için hazırız. Plakalar, bu kurutulmuş halde bir kaç saat için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. PO / Lam / FN yemekler 2 gün önceden hazırlıklı olmak zorunda. Acil durumlarda, Lam / FN sadece 2-4 saat inkübe edilebilir. Ancak, bu optimal farklılaşma / sağkalım sonuçlarını riski olabilir. </li></ol> HPSCs 1.3 Bakım Not: hPSCs% 0.1 jelatin ve mitotikal inaktive fare embriyonik fibroblast (M tutulurHES-ortam içinde EFs) ile takviye edilmiş 10 ng / ml FGF-2, daha önce tarif edildiği gibi 10,12. Hücreler 6-8 gün, her bölünmüş olmalıdır. <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (magnezyum veya kalsiyum olmadan 1x PBS) 8 ml,% 0.1 jelatin ile kaplayın, 10 cm tabak. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla dondurulmuş MEFS çözülme. 10 ml DMEM/10% FBS 1 milyon MEFS ekleyin. </li><li> Jelatin aspire ve hücreler plaka. En az 6 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile bir kez, plakayı yıkayın ve 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye edilmiş 10 ml HES-orta ekleyin, hazırlanan MEF plakadan DMEM/10% FBS aspire. Aracı, 20 dakika boyunca 37 ° C &#39;de ısınmasına izin verin. Not: hPSCs manuel bölmek için gömülü bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu kullanılır. Bununla birlikte, hücreler, uygun alternatif yöntemler kullanılarak geçişli olabilir. </li><li> Gömülü bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu altında, bir hücre hırsızı kullanarak ayrı koloni ayırmak ve onları şamandıra izin. </li><li> Bir kullanınYüzen koloniler aspire ve taze, sıcak MEF plaka üzerine sevketmek 1 ml şırınga. Yeni çanak hücrelerin yaklaşık olarak dörtte biri aktarın. 37 ° C&#39;de inkübe edin </li><li> Taze HES orta günlük hücreleri besleyin. </li></ol> Farklılaşma için hPSCs 2. Kaplama Not: hPSCs (Şekil 1B bakınız) bölmek veya kaplama farklılaşması için koloniler büyük olduğunda, ama yine de kendi sınırları mümkün ayırt hücreleri olduğunca az ile keskin kenarlara sahip olmalıdır. Hücreler manuel Pasajlanması kullanılarak korunur zaman koloniler kolayca gözle görülemeyecek kadar büyük olmalıdır. Bu zaman noktası için doğru fikir almak için bir pasaj olmadan iki hafta için ayrı hPSC çanak korumak ve hücreler ulaşmak izlemek ve onları ayırt / geçiş için ideal bir zaman noktasını geçebilir. <ol><li> Farklılaşmasını başlamadan önce matrigel 1 saat ile 10 cm yemekler hazırlayın. Başarılı matrigel kaplama olabilir,4x büyütme doğrulandı. </li><li> HPSCs bölünmüş hazır olduğunda, ortam aspire ve hücreler% 0.05 tripsin-EDTA 4 ml. </li><li> Tek hücreler mikroskop altında plaka kaldırma gibi MEFS görebilirsiniz kuvvetlice kadar 2 dakika boyunca yatay çanak çalkalayın. HPSC koloniler koloniler olarak takılı kalır. </li><li> Hemen ve iyice tripsin aspire ve plaka, 2-4 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Plakasına HES-orta 2 ml ilave edilir ve P1000 pipet kullanılarak, hücreleri ayırmak. Not: hücreler kolayca yüzeyden kaldırılabilir edilemiyorsa, plaka, bir 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırılır, boş olabilir. </li><li> 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye 8 ml HES-ortamına hücreleri aktarın. </li><li> Önceden hazırlanan, 10 cm çanağından aspire Matrigel. Matrigel plaka üzerine (10 cm tabak ikinci Hücreler iki 10 cm çanaklara bölünmüş, örneğin), 1:1 veya 1:02 oranında hücreleri Plate. 37 ° C de inkübeGece boyunca C. Not: Bu kaplama yaklaşık olarak 100,000 hücre / cm 2 sonuçlanmalıdır. </li></ol> Nöral Farklılaşma 3. İndüksiyon Not: hücreler,% 90-100 sıklıkta (Şekil 1C bakınız), genellikle aşağıdaki gün zaman farklılaşması (gün 0) başlatılabilir. Doğru confluency henüz ulaşılamadığı takdirde onlar farklılaşması için hazır olana kadar, hücreler HES-orta günlük beslenebilir. Alternatif olarak, kaplama hücrelerinin ilk sayısı arttırılabilir. <ol><li> 3 0. günde, 0.1 uM ve 10 uM LDN193189 SB431542 içeren KSR farklılaşma orta çanağı 10 ml/10 cm günlük hücreleri besleme. </li><li> Gün 4 ve 5 yem% 75 KSR-farklılaşma orta ve% 25 N2-farklılaşma orta hücreler LDN193189 ve SB431542 içeren hem de. </li><li> 6 ve 7 gün besleme üzerinde% 50 KSR-farklılaştırma ortamının ve% 50 N2-farklılaşma ortamı ile hücreler LDN193189 ve SB4 ihtiva eden hem de31542. </li><li> Gün 8 ve 9 yem% 25 KSR-farklılaşma orta ve% 75 N2-farklılaşma orta hücreler LDN193189 ve SB431542 içeren hem de. </li><li> 11. günde hücre şarjı için 1.2.2 belirtildiği gibi günde 9 ve 10, PO / Lam / FN yemekler hazırlamak. </li><li> Günde N2-farklılaştırma ortamının 10 besleme hücreleri LDN193189 ve SB431542 ihtiva etmektedir. </li></ol> NC Şartname damlacıklar 4. Replating <ol><li> Gün 11 aspirat Lam / FN önceden hazırlanmış plakalardan ve 1.2.2 de açıklandığı gibi bunları, 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Ayırt hücreleri orta çıkarın, 1x PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve 8 ml accutase/10 cm çanak eklemek. 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe </li><li> Hücre kaldırıcı kullanarak, hücreleri ayırmak ve bir 5 ml pipetle Accutase bunları tekrar süspansiyon. Bir 15 ml tüp süspansiyon aktarın. </li><li> 1x PBS içinde 5 ml ilave edilir ve 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri döndürün. </li><li> 10 ml 1 hücrelerin tekrarx PBS. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak 40 mikron hücre süzgecinden filtre ve Hemasitometre veya eşdeğer tekniği kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Aşağı hücreleri Spin ve 100,000 &#39;lik bir konsantrasyonda 200 uM askorbik asit (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren N2-farklılaştırma ortamı içine yeniden süspanse -150000 cells/10 ul. </li><li> Onları kurutulmuş PO / Lam / FN 15 cm yemekleri üzerine dokunmadan birbirine yakın bir tekrar-pipet, plaka 10 ul damlacıkları kullanarak. Not: farklılaşmış hücrelerin biri 10 cm çanak normalde yaklaşık 2-3 kez 15 cm yemekleri ya da yaklaşık olarak 100 x 10 ul droplets/15 cm çanak sonuçlanır. </li><li> Damlacıklar N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ml ekleyin ve 37 ° C de inkübe edilir (damlacıkları rahatsız olan) çok dikkatli bir şekilde, daha sonra, 20-30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin </li><li> 12. günde, dikkatli bir şekilde 20 mL/15 cm tabak N2/AA/BDNF/FGF8/SHH ile hücrelerin beslenir. </li><li> Da &#39;dany 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8 her ikinci veya üçüncü gün hücreleri beslemek. </li><li> Günde 16 ve 17 FACS sıralama sonra NC hücreleri replate PO / Lam / FN plakaları hazırlamak. </li></ol> 5. Floresan Aktive Hücre NC hücre sınıflandırması (FACS) Not: FACS için hücrelerin hazırlanması, yaklaşık olarak 2 saat gerektirir. <ol><li> Gün 18 remove ortamı üzerinde, çanak 1x bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler 12 mi Accutase ekleyin. 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri </li><li> Bir hücre hırsızı kullanarak, yüzey hücreleri ayırmak ve onları şamandıra izin. 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer ve 1 x PBS, 30 ml ekleme, 5 ml pipet kullanılarak bir süspansiyon içine hücreleri Pipet. 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri dönerler. </li><li> P1000 bir pipet kullanarak, 1 ml% 2 FBS / HBSS (HBSS, 15 mM HEPES ihtiva etmektedir) içinde tekrar süspansiyon hücreleri. % 2 FBS / HBSS 19 ml ilave edilir ve tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri filtre. 15 dakika daha buz üzerinde hücrelerin inkübeantikor engelleme için ve daha sonra Hemasitometre kullanarak onları saymak. </li><li> Aşağı hücreleri Spin ve% 2 FBS / HBSS içinde 10000000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon bunları. </li><li> Yalnızca kontrol (APC okunur ve 488 için) FACS lekeli boyanmamış, tek lekeli (HNK-1, sadece ve sadece p75) ve ikincil antikor 1000000 hücreleri kenara her ayarlayın. </li><li> Uygun örnekler 1 ml süspansiyon içinde 10000000 hücre başına p75 birincil antikor HNK-1 ile 5 ul 5 ul eklenir ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 ml 1 x PBS (114 x g hızında santrifüj 5 dakika) hücreler yıkanır ve 1 ml% 2 FBS / HBSS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Uygun örnekler 1 ml süspansiyon içinde APC 2 ul ve 10000000 hücre başına 488 ikincil antikor ilave edin ve 1 ul karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. Not: APC ve 488, sırasıyla, HNK-1 ve p75 boyanması için burada kullanılan ikincil antikorlardır. </li><li> 10 ml 1 x PBS, hücreleri iki kere yıkayın, 500 ul 10000000 hücreleri tekrar süspansiyonDAPI (0.5 ng / ml) ya da, FACS analizi ölü hücreleri çıkarmak için uygun bir alternatif, canlı hücre lekesi içeren% 2 FBS / HBSS. </li><li> FACS tüpler uygun örnekleri aktarın. </li><li> Hücre toplanması için 0.5 ml% 2 FBS / HBSS FACS tüpleri hazırlayın. Not: Hücreler ve toplama tüpleri sıralama süre boyunca karanlıkta buz üzerinde tutulur. </li><li> DAPI, APC ve 488 çeşit DAPI-/HNK-1 + / P75 + çift pozitif hücrelerini tespit edebilen lazer ile bir hücre sıralama makinesi kullanarak. Not: Bu hücreler sıralanmış popülasyonundan hariç olmak için Hazırlama Süresi ve hücrelerin ele hücre ölümü küçük bir yüzdesi neden olur, ölü hücreler DAPI lekeler olduğu ve bu nedenle izin verir. Herhangi bir alternatif ölü / canlı leke bu amaç için eşit derecede iyi çalışır. DAPI kendisi canlı hücre popülasyonunda sitotoksisiteye neden olmaz. </li></ol> 6.. SÄ Hücrelerinin replating, Kuzey Bakım ve Genişleme Not: FACS sıralanmış hücreler el olmalıOptimum hayatta kalmasını sağlamak için özel bakım ile açtı. Onları replating kadar buz üzerinde tutun. Vorteks veya sert onları pipetle etmeyin. Hücreler tüp hafifçe vurarak yeniden süspanse edilebilir. <ol><li> FACS sıralama sonra, onları aşağı spin sonra, NC hücrelerin sayısı ve N2-farklılaşma ortamda tekrar süspansiyon 30.000 hücrelerin onları replate uygun hacminde 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ve 10 mcM Y-27632 dihidroklorüre ile desteklenmiş / 10 ul damlacıklar. </li><li> Iyice kuru önce PO / Lam / FN plakaları ve 10 cm çanak plaka başına yaklaşık 50-70 damlacıkları hazırlanmıştır. Yemekler 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Çok dikkatli damlacıklarını bozmadan N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm çanak eklemek. 37 ° C de inkübe hücreleri </li><li> N2/FGF2/EGF her 2-3 günde bir hücreleri besleyin. Not: damlacıkların içindeki yığmaya başladığınızda NC hücreleri genişletilmiş veya pasajlandığında yaklaşık olarak her 4-5 günde bir veya edilir. </li><li> Geçide NC hücreler, orta, wa kaldırmaksh, hücreler bir defa PBS ile ve 1x cm tabak accutase/10 8 ml. 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak plaka kapalı hücreleri pipet ve bir 15 ml tüp aktarın. PBS 1x 6 ml ekleyin. </li><li> 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri dönerler. </li><li> Damlacık ul 20000 cells/10 elde etmek için 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ve 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye N2-farklılaştırma ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Kurutuldu, PO / Lam / FN plakalar üzerine 10 ul damlalar hücreleri Replate. Yemekler 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Dikkatle N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm çanak eklemek. 37 ° C&#39;de inkübe edin Not: NC hücreleri tutulan ya da nispeten homojen bir ata nüfus olarak 2 hafta boyunca genişletilebilir. Uzun kültür çeşitli döl hücre tipleri ayırt etmek için onları neden olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease.">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat Methods. 7, 25-27 (2010).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression.">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li><li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells.">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Dev Biol. 366, 83-95 (2012).</li><li>McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease:+a+developmental+disorder+of+the+enteric+nervous+system.">Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).</li><li>Slaugenhaupt, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+a+splicing+mutation+in+the+IKBKAP+gene+causes+familial+dysautonomia.">Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia.</a> Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).</li><li>Cheung, N. K., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+establishment+of+hemopoietic+supportive+stromal+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow.</a> Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+of+fertilization+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells+and+application+in+parkinsonian+mice.">Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice.</a> Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).</li><li>Elkabetz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi-1+dependence+distinguishes+neural+stem+cell+self-renewal+from+progenitor+proliferation.">Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.</a> Nature. 425, 962-967 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek hiçbir çatışan çıkarları var.

HESC / hiPSCs R-NC hücrelerinin başarılı farklılaşması için aşağıdaki noktalar göz önüne alınmalıdır. Bu her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için çok önemlidir. Özellikle, bu kirlenme başarılı engel farklılaşmasını çünkü, düzenli mikoplazma kontaminasyonu için hPSC kültürleri test etmek önemlidir, ancak kolayca hPSC kültürde görsel olarak tespit edilemez. R-NC farklılaşması% 90-100 hücre yoğunluğunda başlanmalıdır; düşük hücre yoğunluğu, hücre...

İnsan embriyonik kök hücreleri (HESC) ve insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) iyi hayvan modelleri ne birincil dokular ne mevcut olduğu için insan hastalıkların araştırılması ve gelecekteki tedavisi için özellikle, muazzam bir potansiyel göstermiştir. HESC / hiPSC tekniği Uygulama örnekleri aşağıdaki gibidir: Özellikle ilgi çekici hücreleri sınırsız miktar 1 de rejeneratif tıp için HESC / hiPSCs oluşturulabilir. Hücreler, belirli bir hastalık taşıyan hastaların üretilen ve vitro hastalık modellerinde 2,3 kurmak için kullanılabilir. Bu tür hastalık modelleri daha sonra yeni ilaç bileşikleri 4 arayışı hem de etkinlik ve toksisite 5 için mevcut ilaçların test büyük ölçekli ilaç taraması için kullanılabilecektir. In vitro hastalık modelleri, yeni hastalık mekanizmalarının tanımlanmasına yol açabilir. HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için spesifik ile çalışmak önemlidir, iyi tanımlamaksöz konusu hastalığın etkilenen d hücre türleri. Bu nedenle, katı ve tekrarlanabilir in vitro farklılaşma protokollerin kullanılabilirliği HESC / hiPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için çok önemlidir. Protokoller HESC / hiPSC hatları ve farklı araştırmacılar arasında en az değişkenlik, zaman gider, çaba, zorluk ve maliyet hem de maksimum tekrarlanabilirlik gösteriyor ki arzu edilir. Nöral krest (NC) hücreleri epidermis ve nöral epiteli arasında omurgalı nörülasyon sırasında ortaya çıkar. , Çoğaldıkları ve gelişen embriyonun boyunca göç eder ve yaygın olarak kemik / kıkırdak, kraniofasiyal iskelet, duyu sinirlerinin, Schwann hücreleri, melanositler, düz kas hücreleri, bağırsak, nöronlar, otonomik nöron, kromafin hücreleri de dahil olmak üzere, soy hücre tiplerinin etkileyici bir çeşitliliği doğuran , kalp septum hücreleri, diş ve adrenal / tiroid salgı bezi hücreleri 6. Bu durumda, hücreler, Kuzey Carolina çekici bir hücre alanı için kök hücre tipi ve için önemlidirBu tür Hirschsprung hastalığı 7, Ailevi Disotonomi 8 yanı sıra 9 gibi nöroblastoma kanser gibi hastalıkların, çeşitli modellenmesi. Dahası, in vitro insan embriyonik gelişim yönlerini incelemek için imkanı sunuyoruz. Şu anda mevcut ve yaygın olarak hESC 10,11 NC hücrelerinin türetilmesi için vitro farklılaşma protokolünde uygulanan farklılaşma 35 güne kadar sürer ve bu gibi MS5 stromal hücreleri gibi besleyici hücreleri üzerinde uyarılmasını sinir içerir ve bu nedenle yetersiz tanımlanmış koşullar altında gerçekleştirilir. Bu NC hücreleri büyük miktarlarda üretmek için ölçekli kadar olabilir, yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama 4 için gerekli olan, örneğin, bu iş ve maliyet yoğundur. Ayrıca, yeniden zor olabilir sinir rozet, elle pasajlanmasını da içerir ve bu HESC veya hiPSC büyük bir çeşitlilik uygulandığı zaman bu nedenle, özellikle genel olarak değişkenlik, tabidirçizgiler. Burada, besleyici hücre içermeyen bir 18 günlük protokolünde NC hücrelerin aşamalı türetme gösterilmiştir. Bu yöntem, şu anda kullanılan protokol daha kısa ve daha belirgin olduğunu. Ayrıca, farklı hiPSC hatları arasında NC hücreleri üreten çok sağlamdır. Önemlisi, bu iki protokol tarafından vermiştir NC hücreler nöral rozetler (bundan sonra adlandırılan rozet-NC ya da R-NC) sınırında ortaya olduğu gösterilmiştir. Iki protokolden birini kullanarak elde edilen hücreler aynı NC işaretleri ifade ve mikroarray analizi birlikte küme, morfolojik aynı görünüyor. Yeni protokolü (R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücreleri göç ve daha fazla nöronların içine ayırt olabilir böyle eski protokolü (MS5-R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücrelerine benzer, işlevseldir. Bu yüzden, hücreler, MS5-R-NC hücreleri ile eş zamanlı olarak kullanılabilir. HESC / iPSC NC hücrelerin derivasyon için R-NC hücre protokol NC soy içeren HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için faydalı olacaktır. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:897px;" width="897">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Regents</td>
			<td style="width:219px;">company</td>
			<td style="width:160px;">cataloge number</td>
			<td style="width:165px;">comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicinlin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM minimum essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant human FGF basic (FGF2)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-001MG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 powder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APO human transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putriscine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L Ornithin hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse Laminin-I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase in Hank&#39;s Balanced Salt Solution 5U/ml</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>1563-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin (PBS without Mg/Ca)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td>
			<td>Advanced Targeting Systems</td>
			<td>AB-N07</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APC rat anti-mIgM</td>
			<td>BD Parmingen</td>
			<td>550676</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material/Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6105M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,&#160; pipetts, pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass hematocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture laminar flow hood with embedded microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture biosafety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell sorting machine, i.e. MoFlo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml TB syringe 27Gx1/2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell lifter Polyethylene</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) tabak içinde, insan hastalıklarının modellemek için hastalık veya kaza sonrası uygulamalarda rejeneratif transplante edilebilir hücre kaynağı olarak, insan embriyo gelişimini incelemek için büyük bir potansiyele sahiptir. Sinir tepe (NC)-hücreleri, periferik sinir sistemi ve glia, melanositler ve mezenkimal hücrelerden hücreler gibi yetişkin somatik hücre, büyük bir çeşitlilik için öncülerdir. Bunlar hücre kaderinin şartname ve göç dahil olmak üzere insan embriyonik gelişim, yönlerini incelemek için hücre değerli bir kaynaktır. Terminal olarak farklılaşmış hücre tipleri NC projenitör hücrelerin farklılaşma başka, in vitro olarak insan hastalıklarının Modele hastalık mekanizmalarını incelemek ve rejeneratif hücrelere ilaç üretmek için imkanı sunar. Bu makalede, hPSCs NC hücrelerinin türetilmesi için bir mevcut in vitro farklılaşma protokol adaptasyonu sunar. Bu yeni protokol sorumluluk yönün 18 gün gerektirirrentiation, besleyici-özgür insan embriyonik kök hücre (HESC) hatları gibi insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları arasında kolayca ölçeklenebilir ve yüksek tekrarlanabilir olduğunu. Hem eski hem de yeni protokoller eşit kimlik NC hücreleri verim.

MS5-R-NC protokolü üzerinde 11 R-NC protokolünün en önemli iki gelişmeler besleyici ücretsiz, tanımlanmış farklılaşma koşulları ve süre şartına genel kısalma vardır. MS5 besleyici hücreler 13 hESC 14 sinir farklılaşmasını desteklemek için gösterilmiştir fare kemik iliği stromal türetilmiş hücrelerdir. HESC böylece erken insan nöral gelişimi taklit eden, Kuzey Carolina hücreler 10 ortaya hangi periferinde, düşük yoğunluklu bir şekilde epi...

Watch this Scientific Journal Video about Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz adaptasyon<em&gt; In vitro</em&gt; HPSCs NC hücrelerin derivasyon için farklılaşma protokolü sunulmuştur.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz adaptasyon In vitro HPSCs NC hücrelerin derivasyon için farklılaşma protokolü sunulmuştur.

Video: Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Nörobilim

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

İnsan Saç köklerinin arasından Sinir Crest Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...