Bu yöntem hücre döngüsüne bağımlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesine olanak sağlar. Bu yöntem, çift iplikçik frag tanıma ve onarımı, hücre döngüsü etkileri ve apoptoz ile nihai hücre ölümü gibi DNA hasar tepkisinden önemli uç noktaları kapsamlı bir analizde birleştirir. Bu tekniği daha çok klinik onkolojide radyokemoterapötik tedavilerin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini araştırmak için kullandık.
Bu çalışma radyobiyoloji ve radyoterapi alanlarında ki korelasyon çalışmaları için çok yararlıdır, ancak onkolojinin çeşitli alanlarına da uygulanabilir. Standart hücre toplama prosedürlerine göre kültürden hücreleri topladıktan sonra, PBS bir mililitre pelet resuspend. Ve hücreleri bir başlıktaki iki mililitre fiksasyon çözeltisine aktarın.
Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka dan sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant decant. Hücreleri tek bir hücre süspansiyonu olarak sabitlemek ve tüm numuneler için fiksasyon süresini sabit tutmak önemlidir. Yapışık hücrelere, analiz için güzelce yuvarlatılmış hücreler elde etmek için ayırmak için yeterli zaman verin.
Sonra dokunarak pelet gevşetin ve% 70 etanol üç mililitre hücreleri yeniden askıya. Boyama dan önce hücreleri yıkamak için, santrifüj ile hücreleri tortu ve dokunarak pelet gevşetin. Daha sonra üç mililitre yıkama çözeltisi ve bir mililitre yıkama çözeltisi ile bir yıkama çözeltisi ile iki ardışık yıkama ile hücreleri yeniden askıya alın.
Her yıkama arasında supernatant atma. Son yıkamadan sonra, pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatant aspire ve ilgi antikor kokteyl 100 mikrolitre lucent pelet resuspend. Oda sıcaklığında bir saat sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle pelet rahatsız etmeden supernatant aspire.
Daha sonra, 100 ila 250 mikrolitre DNA boyama çözeltisi içinde gevşetilmiş pelet ifini yeniden askıya alın ve hücreleri 35 mikrometre lik örgü gözenek boyutuna sahip bir numune tüpünün hücre süzgeci kapağından geçirin. Akış sitometrisi ile hücreleri analiz etmek için, sitometre penceresindeki parametreler sekmesini açın ve tabloda belirtildiği gibi parametreleri seçin. Ardından, çalışma sayfası penceresini açın ve belirtildiği gibi çizimler oluşturun.
Kontrol örneğini sitometreye yükleyin ve çalıştır düğmesine basın. Tarayıcı penceresindeki ilk tüpü seçin ve tüp adını tıklatın. Denetçi penceresinin parametreler sekmesinde ileri ve yan dağılım ve DAPI için dedektör voltajlarını ayarlayın.
Yazılımdaki çalışma sayfası kurulumuna devam etmek için bekleme düğmesine basın. Yan dağılım alanı çizimine karşı ileri dağılım alanındaki hücrelerin popülasyonunu tanımlamak için çokgen geçit aracını kullanın ve DAPI'deki tek hücre popülasyonuna karşı DAPI alanı çizimini tanımlamak için dikdörtgen geçit aracını kullanın. Popülasyon hiyerarşisini göstermek için G denetimine basın ve bunları yeniden adlandırmak için varsayılan kapı adlarını tıklatın.
Daha sonra, bağlam menüsünden popülasyonları ve tek hücreleri göstermek için tüm histogramların tümüne sağ tıklayın. Sinyalin tam dinamik aralığını kapsayacak şekilde antikor-coupled floroforlar için dedektör gerilimleri optimize etmek için kontrol ve tedavi örnekleri edinin. Örnekleri ölçmek için sitometredeki çalıştır düğmesine basın ve örnekleri ölçmek için yazılımdaki edinme panosunu kullanın.
Ardından, verileri nokta FCS dosyaları olarak kaydetmek için iletişim kutusunda dizin dışa aktarmayı seçmek için dosya, dışa aktarma ve denemeleri seçin. Verileri değerlendirmek için nokta FCS dosyalarını akış sitometrik analiz yazılımının örnek tarayıcısına sürükleyin ve bırakın. Ve çokgen aracını kullanarak hücrelerin popülasyonunu ileri ve yan dağılım alanı çiziminde tanımlayın ve enkazı analizden hariç tonuyla dışla.
DAPI alan çizimine karşı DAPI'de, tek hücre popülasyonunu tanımlamak ve çözümlemeden herhangi bir hücre çiftveya kümelenmesini dışlamak için dikdörtgen aracını kullanın. DAPI alan histogramında, normal DNA içeriği olan tek hücreleri bozulmuş DNA'lı apoptotik hücrelerden ayırt etmek için iki sektörlü aracı kullanın. Hücre döngüsü modelleme aracını açmak için takım biyolojisi ve hücre döngüsünü seçin ve G bir S ve G iki M evresindeki hücrelerin sıklığını tahmin etmek için Dean-Jett Fox'u seçin.
Hücre döngüsüne özgü gama H iki A X ölçümü sağlamak için hücre döngüsü popülasyonunun DAPI alanı çizimine karşı DAPI ile DAPI'de G bir S ve G iki ve M faz kapıları oluşturun. Hücre döngüsü popülasyonunun Alexa 555 alan histogramındaki üç pozitif ve negatif hücreyi ayırmak ve tek hücre popülasyonunun Alexa 647 alan histogramındaki CAS baz üç pozitif ve negatif hücresini ayırt etmek için iki sektörel aracı kullanın. Tablo düzenleyicisini açmak ve tabloyu belirtildiği gibi yapılandırmak için Denetim T tuşuna basın.
Ardından, menü şeridinin çıktı bölümündeki biçimi ve hedefi ayarlamak ve verileri bir elektronik sayfaya aktarmak için Dosyaya'yı seçin. Karbon iyonları glioblastoma hücrelerinde daha yavaş azalmak ve aynı fiziksel dozda foton radyasyonu ile karşılaştırıldığında 24 ila 48 saat içinde önemli ölçüde yüksek kalır yüksek gama H iki AX pik düzeyleri indükler. Hem karbon iyonları hem de foton radyasyonu için gama H iki AX seviyesi G bir fazlı hücrelerde en yüksekti çünkü DNA çift iplikçik kırma onarımı hücre döngüsünde bu aşamada homojen olmayan son birleştirme yolu ile sınırlıdır.
Yüksek çift iplikçik kopma indüksiyon hızı ve daha yavaş onarım kinetik doğrultusunda, karbon iyonları G iki fazve fotonlar daha apoptosis daha yüksek bir oranda daha güçlü ve daha uzun süreli hücre döngüsü arrest neden. Tedavi etkisinin gücüne bağlı olarak, farklı hücre döngüsü aşamalarının çözünürlüğü zor olabilir. Bazı hücre hatlarında, DAPI konsantrasyonu hücre döngüsü profilinin kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir ve ayarlanması gerekir.
Gama H iki AX foci'nin sayısını, boyutunu ve şeklini değerlendirmek ve odak ve parnükleer gama H iki AX boyamasını ayırt etmek için akış sitometrisinden sonra kalan örneklerden slaytlar hazırlanabilir. Metodumuzu kullanarak, mezenkimal kök hücrelerin iyonlaştırıcı radyasyonlara ve topoizosentezine karşı nispeten dirençli olduğunu ancak gliomiasin e karşı hassas olduğunu gösterebiliriz. PFA dumanları toksik olduğundan, fiksasyon çözeltisini hazırlarken ve fiksasyon adımı sırasında her zaman bir duman başlığı kullanın.
AYRıCA DAPI kullanırken eldiven giymeyi unutmayın.
