Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) ve kendi laboratuvarında hücre döngüsü araştırma fonu için Kanada Kanser Derneği Enstitüleri teşekkür etmek istiyorum. MJC MD / Doktora burs CIHR bir alıcı. MJC ve MA CaRTT eğitim programının üyeleri.

1. Etiketleme ve hücre sabitleme <ol><li> Hücre Çoğalması Etiketleme Reaktif (BrdU) başına ml (1 1000 seyreltme) 1 saat hücre kültürü orta hasat öncesi 1 mcL ekleyin. Etiketleme dönemi yavaş büyüyen hücreler için uzatılmış gerekebilir. </li><li> Hasat hücrelere aspirat kültür ortamı ve fosfat ile iyice yıkayın tamponlu salin (PBS). Orta iyice izlerini silmek için tekrarlayın. </li><li> PBS 3mm EDTA içeren hızlı bir şekilde üçüncü kez kültürlerin yıkayın ve iyice aspire. </li><li> Her çanak 3mm EDTA içeren PBS küçük hacimli, 0.5 ml 6 cm çanak için idealdir. 22 ° C hücreleri ayırmak için yaklaşık 5 dakika inkübe edin. 15 ml konik boru transfer. </li><li> Santrifüj hücreleri, pelet için 5 dakika için 500 xg&#39;de süpernatant kaldırmak ve iyice PBS 100 mcL tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 ml,% 95 EtOH, damla damla ekleyerek karıştırın ise hücreleri saptamak. Bu aşamada, hücreler için en az 4 ° C&#39;de saklanıray. </li></ol> 2. BrdU ve DNA denatüre ve boyama <ol><li> Pelet hücreler 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve% 95 EtOH çıkarın. 1 ml 2N HCl ve% 0.5 Tx-100 vorteks ederken bir damla bilge moda ekleyerek yeniden süspanse edin. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bölüm 2.1 &#39;de daha önce olduğu gibi santrifüj ve hücrelerin bu aşamada çok gevşek bir granüle beri dikkatle supernatant aspire. 0.1M NAB 4 O 7 (pH 8.5) 1 mL yavaşça tekrar süspansiyon ve en az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe. </li><li> Yukarıda bölüm 2.1 ve 0.5 mL (PBS% 1 BSA ve% 0.2 Tween-20 içeren) fare anti-BrdU antikorlar ile antikor çözüm olarak tekrar süspansiyon Pelet hücreleri 50 1 sulandırılmış. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Pelet hücreleri tekrar FITC için konjuge tavşan anti-fare sekonder antikor antikor çözüm içeren 50 ml içinde tekrar süspansiyon 25 1 sulandırılmış. 30 dakika boyunca inkübeMasaüstü ve ışıktan korumak. </li><li> Santrifüj hücreleri son kez tekrar süspansiyon propidium iyodür ve RNaz solüsyonu (% 1 BSA ile PI-RNAse çözümü, PBS, 10 mg / ml propidium iyodür, 0.25 mg / ml RNaz A) 0,5 mL ve 37 karanlıkta inkübe ° 30 dakika C Alternatif RNA gece 4 sindirilemez ° C karanlıkta. </li><li> Agrega kaldırmak ve akış sitometresinin örnek alımı için uygun bir tüp içinde tek hücre toplamak için çözüm bir hücre süzgecinden geçirin. Yine örnekleri gün ışığına doğrudan maruz korunmalıdır. </li></ol> 3. Flow sitometri analizi <ol><li> Hücreler propidium iyodür ve FITC için uygun algılama yeteneğine sahip çiftlerin (biri olarak akış hücresi geçmesi iki hücre) karşı ayrımcılık yapan, standart bir akış sitometresinde analiz edilmelidir. Tek hücreleri forward scatter ve yan dağılım pop dayalı etkinlikler için bu akış sitometri uygulaması gating ile tespit edilebilirulations ve propidium iyodür DNA boyama özelliklerini kullanarak. Giyilen erkek yeleği ayrımcı bir nokta komplo görünümünü akış sitometrelerinde propidium iyodür boyama özelliklerini dayanır arasında değişir, giyilen erkek yeleği discriminator analizi kurma hakkında bilgi için yerel flow sitometri tesisi bakın. Genel olarak, bir hücre eşzamansız hızla çoğalan nüfus, tek hücreler genellikle elektronların ikili ayrımcı arsa içinde en bol bulunan iki tepeler (2N ve 4N DNA) ve bir kapı çevrelerindeki çizilmelidir. Bu, aşağıdaki tüm sonraki analiz için kullanılan tek hücreli olayları seçin. </li><li> Ilk numune analiz edilecek boyama ve akış sitometresi set-up için pozitif bir kontrol olarak hizmet veren bir eşzamansız prolifere kültür olmalıdır. Tekli hücrelerin 2N ve 4N doruklarına X ekseni üzerinde 200 ve 400 (keyfi birimleri) merkezli olduğunu propidium iyodür boyama photomultiplier tüplerin hassasiyetini ayarlayın. Biz genellikle bol s lekeBu örnek kullanmadan akış sitometresinin tüm parametreleri uygun şekilde ayarlanmış olması sağlamak için bu hücrelerin upply. Bu pozitif kontrol yeni kullanıcılar akış sitometresinin operasyon daha aşina olmak için de yararlı olur. </li><li> G1 ve G2 / M popülasyonları arka plan üstünde olduğunu FITC tespiti için photomultiplier tüp hassasiyetini ayarlayın. BrdU pozitif hücrelerin yaklaşık 10 kat daha parlak ve Y ekseni logaritmik bir ölçek olarak gösterilmesi gereken yapılmalıdır. Bu olumlu boyanan hücreler açıkça ayırt BrdU boyama için bir negatif kontrol (non-spesifik IgG ile anti-BrdU antikorlar yukarıda 2.3 adımda değiştirerek) dahil etmek için bazen yararlı olabilir. </li><li> Alt G1 akış sitometresinin formu, bir at nalı şeklinde yay tarafından yakalanan tek olaylar S-faz kadar sol ve aşağı G2 / M için sağ alt propidium iyodür ve FITC arasındaki tazminat ayarlayın Derinlik dis daha fazla bilgi için aşağıdaki referans bakınızorada özel uygulamalar için 2 flow sitometri ve referanslar ilkeleri ve kullanım cussion. </li></ol> 4. Veri analizi <ol><li> 5 000 10 000 DNA içeriği istenen aralık tek bir hücre olayları hücre kültürü nüfus iyice örneklenmiş olduğunu güven için, her bir örnek için alınmalıdır. </li><li> Hücreleri G1, S veya G2 / M aşamalarında atanmış olması gerekir propidium iyodür ve BrdU içerik için ölçülmüştür. Yaklaşık 200 ve 400 (sırasıyla G1 ve G2 / M) merkezli iki BrdU negatif popülasyonları kapıları çizerek bunu yapın. S-faz (Şekil 1A) ölçen bir tek kapısı bu kutuları üzerinde her şey dahil edilmelidir. Her kapı hücrelerin yüzdesi G1, S ve G2 / M (Şekil 1B) hücrelerin göreli sayısını temsil eder. </li></ol> 5. Alternatif, hücrelerden oluşan bir karışık bir nüfus hücre döngüsü analizi için protokol <ol><li> Bu alternatif bir protokoldüren yararlı zaman hücre saf bir nüfusu belirlemek için ilaç tedavisi pratik ifade vektörlerin transfeksiyon rutin ilgi gen ürünü eksprese eden hücrelerin düşük bir yüzde ile sonuçlanır. Büyük bir nüfus ile kontamine olan ilgi hücreleri nispeten küçük bir oranı bu sonuçlar hücreleri untransduced. Bu durumda, gen ya da ilgi shRNA ifade CD19 4 veya GFP 3 demirlemiş bir zar gibi flow sitometri, veya yabancı bir hücre yüzey işaretleyici transfekte hücreler tespit için bir işaretleyici ifade eden bir plazmid ile birlikte eş-transfect plazmid CD20 5. </li><li> Bu protokolün amaçları için bir örnek olarak CD20 boyama Ancak, CD19 için boyama özünde aynıdır. CD20 ile transfeksiyon durumunda, BrdU etikete gerek yoktur, sadece 20 mcL FITC konjuge anti-CD20 antikorları i hücreler ekleyerek yukarıdaki adımları 1.2 1.5 açıklanan ve leke gibi hasat hücrelerice için 20 dakika karanlık. Adım 1.6 &#39;da açıklandığı gibi hücreler Fix. Hücreler tekrar 4 en az bir ay boyunca saklanabilir ° C karanlıkta. GFP tespiti için, bu adımı ve düzeltmek antikor boyama atlarsanız açıklandığı gibi hücreleri saklamak. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüj pelet ve 5 ml PBS% 1 BSA içeren resuspending Re-hidrat hücreleri. </li><li> Propidium iyodür ve RNaz çözüm bölüm 2,5 yukarıda açıklandığı gibi 0,5 mL 5 dakika tekrar süspansiyon hücreleri için 500 xg&#39;de Re-pelet hücreleri. </li><li> 3.1 ve 3.2 &#39;de 2.6 ve analiz talimatları hücre hazırlama talimatları izlemeye devam edin. </li><li> Photomultiplier tüp lekesiz hücrelerin arka plan üstünde olduğunu FITC algılama hassasiyetini ayarlayın. İdeal olarak, CD20-FITC pozitif hücrelerin arka plan daha 100X daha yoğun lekeli 10X olacak ve bu komplo Y ekseni logaritmik ölçek olarak gösterilir (Şekil 2A) olmalıdır. Backg daha 10X parlak CD20 pozitif hücrelerinŞekil olarak yuvarlak (200 ve 400 yılları arasında propidium iyodür boyama) histogram propidium iyodür karşı hücre sayıları görüntülemek için seçilmiş olmalıdır. 2C. CD20 pozitif cut-off kolayca 10X planda olmalıdır (100X arka plan yukarıda yani 10X) parlak lekeli belirteçler ifade hücre hatları için. Ilgi genin de bu hücrelerin zayıf bir ifade, çünkü zayıf boyama hücrelerinin alınması, muhtemelen bu deneyler değişkenlik artar. Sadece zayıf lekeli CD20 pozitif (10X arka plan daha az yani), verim hücre hatları kesti belirlenmesi CD20 lekeli, untransfected hücreleri oluşan bir negatif kontrol kullanılarak yapılmalıdır. </li><li> En az 1000 CD20 pozitif olayların, her bir numune için alınmalıdır. 1000 olaylarının daha az olduğu deneyler yüksek değişkenlik üretecektir. ModFit LT (Verity Yazılımı), Çoklu Çevrim AV (Phoenix Akış Sistemleri) ve Akış Jo (Ağaç Star) gibi yazılım paketleri matematiksel tahminleriŞekil gibi histogramlar eğrinin şekline katkıda bulunan G1, S ve G2 / M popülasyonları. 2B ve C </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Biz üç örnek yaklaşımlar kullanılarak deneysel hücre döngüsü analizleri sunuyoruz. Ilk fare embriyonik fibroblastlar siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27KIP1 retroviral bir ifade kullanır. Viral enfeksiyon için ilaç seçimi tam yirmi dört saat sonra, hücreler, bir saat için nabız BrdU ile etiketli. Bu deneyde inhibitörü ektopik ifade hücrelerin yayılması (Şekil 3A ve B) tutuklamak için kullanılır. Şekil. 3B küçük BrdU pozitif olayların p27 yanıt S-faz kapı açıktır. Aynı şekilde, Şekil diagramed olarak p27 ifade hücreler için S-faz hücre yüzdesi oldukça düşüktür. 3C. Bu tip analizler g çeşitli suşları türetilmiş hücre hücre döngüsü kontrol kusurları karakterize çok etkili olmuşturfarelerin 6, 7, 8 ene hedefli. İkinci deneyde, 24 saat boyunca büyüme faktörü beta (TGF-β1) dönüştürerek, araştırıcıların bulgularıyla meme epitel hücreleri (MCF10A) büyüme inhibitör sitokin ile tedavi edildi. Hücreler dört saat boyunca hemen önce hasat BrdU ile etiketlenmiş. Şekil. TGF-β1 sinyal S-faz hücreleri (4) BrdU etiketleme büyük ölçüde azalır, bizim boyamanın özgüllüğü de IgG negatif kontrol (Şekil 4C) ile doğrulanır. Hücre döngüsünün farklı aşamalarında Niceleme bu TGF-β1, öncelikle bu aşamada bir birikimine yol açan hücre siklusunun G1 fazında proliferasyonunu inhibe onaylar. En son örnek, pRB eksik Saos-2 hücrelerinin CMV CD20 ekspresyon vektörü ve CMV-RB veya kontrol olarak CMV-β-Gal ya transfekte. Transfeksiyon hücreleri izleyen üç gün, hasat, lekeli, ve fikse edildi. Bu hücre Flow sitometri analiziŞekil. 5. Bu negatif kontrol transfekte hücreler (Şekil 5A) 72 saat pRB ifade dağılımı (Şekil 5B) ile karşılaştırıldığında, hücre döngüsü dağılımı göstermektedir. Çoklu Döngü yazılım tarafından eğri uydurma sonra, hücre döngüsü evreleri oranının doğrudan bir karşılaştırma Şekil. 5C. Bu, hücrelerin G1 aşağıdaki pRB ifade S ve G2 / M evreleri hücrelerinin birikimi ve göreli tükenmesi ortaya koymaktadır. Biz G1 tutuklama mekanizmalarının yaygın olarak 9, 10, 11, 12, 13 prob Bu testte kullanılan varyasyon var. Bu örnekler, hücre döngüsü kontrolü, çeşitli uyaranlar veya hücre manipülasyonlar yanıt nasıl ölçülebilir göstermektedir. Bu yaklaşım, bu nedenle kültür tip deneylerde hücre döngüsü pozisyonu ölçümü gerektiren pek çok uygulama için adapte edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Şekil 1. Quantithücre döngüsü aşamalarında kombine propidium iyodür ve BrdU boyama (PI-BrdU) tarafından ation. (A) Bu panel, üç boyutlu propidium iyodür ve BrdU boyanan hücrelerin flow sitometri görüntüler. 2N ve 4N DNA içeriği ile hücreleri propidium iyodür boyanması yoğunluğu için 200 ve 400 X ekseni ölçekte işaretleri üzerinden merkezli olduğunu unutmayın. BrdU boyanma yoğunluğu Y ekseni bir logaritmik ölçekte ölçülür. , Hücrelerin, hücre döngüsü G1, S ve G2 / M aşamalarında ölçmek için kullanılabilecek kapılarının konumu unutmayın. (B) A G1, S ve G2 / M kapılarının her hücre oranı bu grafik üzerinde gösterilmiştir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Şekil 2 propidium iyodür ve hücre yüzey belirteci CD20 kullanarak seçili hücrelerin hücre döngüsü evreleri kantitasyonu. (A) Bu panel propidium iyodür ve hücrelerden oluşan bir karışım için CD20 boyanma gösterir, bazıları ektopik CD20 ve pRB ifade. Not hücrelere2N ve 4N DNA (en bol bulunan nüfus) X ekseni üzerinde 200 ve 400 işaretleri üzerinden ortalanır. CD20 + kapısının konumu, arka planda en az 10 kat daha parlak bir lekeli hücreleri seçer. (B) propidium iyodür boyama karşı hücre sayıları bir grafik bir eşzamansız yaygınlaşması panel CD20 negatif hücreler için gösterilmiştir. (C) benzer bir grafik panelinden CD20 pozitif hücreler için gösterilen pRB ifade ile tutuklama öncelikle 2N DNA içeriği ile hücreleri içeren ve ikna edilmiştir. Bu tutuklandı alt nüfus bu boyama tekniği kullanarak bu kültürün diğer hücrelerden ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Şekil 3, p27KIP1 tarafından hücre proliferasyonu inhibisyonu . (A) PI-BrdU analizi, boş bir pBABE retroviral vecto transduced hücrelerin bir eşzamansız hızla çoğalan nüfus hücre döngüsü aşamaları ölçmek için kullanılanr. (B) hücrelerin benzer bir analizi pBABE-p27 ile transduced. S-faz ve G1 ve G2 / M kapıları olayların büyük yoğunluğu hücre olmadığına dikkat edin. (C) eşzamansız kontrolü ve p27 ifade hücreleri prolifere hücre döngüsü ilgili aşamalarında hücreler kantitasyonu. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Şekil 4, TGF-β1 hücre proliferasyonu inhibisyonu eşzamansız MCF10A hücreleri prolifere olan (A) PI-BrdU analizi . 24 saat boyunca 100 pM TGF-β1 ile muamele edilen hücreler (B) Analiz. Öncelikle hücre siklusunun G1 fazında hücre birikimi unutmayın. (C) eşzamansız hızla çoğalan hücreleri non-spesifik IgG kontrolü ile anti-BrdU primer antikor yerine BrdU boyama onaylanması. (D) Grafik ilgili hücre döngüsü aşamalarının kantitatif A ve B. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Şekil 5 pRB hücre proliferasyonu inhibisyonu. (A) CD20 propidium iyodür boyama ve ß-gal transfekte hücreler karşı Hücre sayıları gösterilmiştir. Transfekte alt nüfus için uygun olmayan bir kontrol olarak transfeksiyon kısmen untransfected nüfus (hücreler CD20) render, hücreleri senkronize olarak bu önemli bir kontrol. Transfekte hücreler diğer analog transfekte hücreleri ile karşılaştırıldığında gerekir. (B) Hücre sayımları karşı CD20 ve pRB propidium iyodür grafik hücreleri transfekte. 2N bir tepe neredeyse tek varlığı unutmayın. (C) Çoklu Döngü yazılım eğri uydurma yöntemleri kullanılarak A ve B hücre döngüsü faz oranlarda grafiksel gösterimi belirlenir.

<ol>
	<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+introduction.">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li><li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker,+Us9-GFP,+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li><li>Qin, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action.">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li><li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions.">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li><li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development.">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li><li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin.">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li><li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation.">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li><li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein.">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities.">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li><li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins.">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins.">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Deneyimlerimize göre, bu tekniklerin başarısı birkaç önemli kontrol ve deneysel koşullara bağlıdır. Bir bu deneylerde kullanılmak üzere bir eşzamansız prolifere kontrol kuruyor. Bu kontrol üç önemli amaca hizmet eder. Öncelikle, tüm deneysel numuneler için kullanılan kültür koşullarında tedavi yokluğunda sürekli çoğalması desteklemek için yeterli olmasını sağlar. Bu örnek, aynı zamanda ne zaman mevcut BrdU veya CD20 pozitif hücreler tespit edilebilir sağlamak için boyama metodolojisi için bir pozitif kontrol amacıyla hizmet vermektedir. Son olarak, bu örnek akış sitometresinin kalibre etmek için kullanılır. Bu kontrol numune sırasıyla 200 ve 400 2N ve 4N hücreleri algılamak için propidium iyodür boyama yoğunluğunu ayarlamak için kullanılabilir. Ayrıca, negatif ve pozitif sinyaller Şekil 1A ve 2A gösterilen merkezli böylece BrdU veya CD20 algılama hassasiyeti ayarlanabilir. Tüm örnekler PI-R hücrelerin benzer bir konsantrasyon varSonraki numunelerinin çalışılabilmesi Nase çözüm sitometresinin için birkaç ayarlama, daha sonra ihtiyaç vardır. Bu Şekil nedenlerden dolayı önemlidir. Güçlü G1 birikimi aslında G2 / M gibi yanlış anlaşılabilir tek bir G1 tepe oluşturur 4B ve 5B Temsilcisi deneyler de diğer önemli nokta olun. Her şeyden önce, onlar BrdU alımı ve etiketleme hücre türleri arasındaki farklılık göstermektedir. Bu nedenle ampirik nabız ve boyama koşullarına yeterince S-faz hücreleri algılamak için gerekli uzunluğunu belirlemek için önemlidir. Genel olarak, bir saat içinde 24 saat veya daha az kültür çift hücre tipleri BrdU ile etiketlenmiş olabilir. Yavaş büyüyen hücre tipleri antikor boyama koşulları ve süresi daha uzun bakliyat ve değişiklikler gerekebilir. MCF10A hücreleri, dört kat daha uzun süre için antikorların iki kez standart bir konsantrasyon ile dört saat ve lekeli BrdU ile etiketlenmiş olarak, bu konuda mükemmel bir örnek vardır. AraştırmacılarBrdU, bu yanlışlıkla S-faz nüfus G2 / M hücreleri dahil yol açabilir hatta çok yavaş büyüyen hücreleri ile etiketleme 6 saat aşmayacak şekilde dikkatli olmalıdır. İkincisi, TGF-β1 ile ifade p27KIP1 etkilerini karşılaştıran, TGF-β1 sinyalizasyon G1 tutuklama indükler p27 G1 veya G2 / M evreleri ya da bir birikimi neden olabilir açıktır. 3 H-timidin birleşme ve sintilasyon sayma gibi yayılması tespit geleneksel yöntemlerle bu olanakları ayırt etmek mümkün değildir. Bizim alternatif protokol hücrelerden oluşan bir alt-nüfus, büyük bir untransfected nüfus tespiti göstermektedir. Transfekte hücreleri tespit etmek için en uygun muhabiri ampirik olarak belirlemek için önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, bazı hücre tiplerinin ifade hücre yüzeyinde ya kötü belirteçleri veya plazma zarı düzgün trafik transfekte hücrelerini tespit etmek için bir yetersizlik değil. Likewise, tüm hücrelerin membran bağlı GFP formu tahammül edemez. Transfeksiyon muhabir verimliliği yanı sıra ifade untransfected kontroller ile karşılaştırıldığında göreli yoğunluğunu değerlendirerek, en uygun muhabiri seçimi yapılmalıdır. İdeal olan, bu moleküller heterolog ifade iyi tolere edilir ve bu belirteçler, hücre döngüsü dağıtım üzerinde hiçbir etkisi çok az olduğunu düşündüren olacaktır. Flow sitometri yaklaşımlar bu tür bir sınırlama sadece birbirlerine kıyasla göreceli hücre döngüsü evreleri bollukları kurmak mümkün olmasıdır. Bu nedenle, sadece S-faz göre bu aşamadan geçerek ilerlemesini yavaşlatır Şekil 3&#39;te ifade p27 gerçekten G1 ve G2 / M, bir tutuklama neden olur veya belirsizdir. Bu olasılıklar hücrelerin mitoz gibi nocodazole inhibitörü ya da aphidicolin gibi G1 / S inhibitörü ile paralel bir örnek tedavisinde daha fazla araştırılmalı. Bu ilaçların bir domina meydana getirdiğindennt tutuklama veya M-faz sırasıyla S-faz erken, yavaş hızla çoğalan hücreleri ilaca bağlı tutuklama noktada birikebilir. Kontrol hücreleri, M-faz 13 birikir G1 pRB ifadesi nedeniyle tutuklandı hücreleri nocodazole tedaviye rağmen G1 kalacaktır için . Birlikte ele alındığında, bu deneysel yaklaşımlar, memeli hücre döngüsü araştırma soruların geniş bir yelpazede uygulanabilen esnek bir yöntem sunar. Onlar kolayca hücre döngüsünün ilerlemesi değişikliklerini saptamak ve kontrol grubu ile karşılaştırıldığında farklılıklar ölçmek.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Hücre Çoğalması Etiketleme reaktif </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU Antikorlar </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse FITC konjuge Antikorlar </td><td> Vektör Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Gerinim Filtreler </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 antikorlar </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Çok döngülü yazılım </td><td> Phoenix Akış Sistemleri </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

Hücre proliferasyonu yönetmelik, çok hücreli organizmaların gelişimi sırasında doku morfolojilerinden merkezi. Ayrıca, hücre proliferasyonunu kontrol kaybı, kanser gibi hastalıkların patolojisi temelini oluşturmaktadır. Bunun gibi, hücre proliferasyonu araştırmak ve hücre döngüsünün her aşamasında hücrelerin oranını ölçmek için edebilmek için büyük bir ihtiyaç vardır. Bu daha büyük bir nüfus içindeki DNA kopyalayan hücreleri ayırt edilemez tanımlamak için de hayati önem taşımaktadır. Prolifere hücre karar G1 fazında DNA sentezi, hücre döngüsünün geri kalanında başlatılması ve ilerleyen hemen önce yapılmış olduğundan, bu aşamada DNA sentezi tespiti, hücre kültürü, büyüme yönetmelik durumu kesin bir kararlılık sağlar deneyler. Hücrelerin DNA içeriği kolayca propidium iyodür, floresan DNA intercalating boya ile boyanmış hücreler flow sitometri quantitated olabilir.Benzer şekilde, aktif DNA sentezi, hücrelerin hasat ve asitte çözünmeyen fraksiyonu içine dahil radyoaktivite ölçüm radyoaktif timidin varlığı hücreleri kültür quantitated olabilir. Biz hücre döngüsü analizi ile önemli bir uzmanlığa sahip ve farklı bir yaklaşım önermektedir. Biz bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (sadece BrdU olarak kısaltılır) bu timin analogları yakın zamanda sentezlenmiş DNA&#39;sına eklenmesi algılar boyama kullanarak hücre çoğalması araştırın. Etiketleme ve boyama, flow sitometri 1 propidium iyodür ve analizi ile toplam DNA boyama ile birlikte BrdU hücreleri, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında hücrelerin en doğru önlem sunuyor . Propidium iyodür toplam DNA içeriği ile BrdU antikor bazlı boyama yoluyla, aktif DNA sentezi algılama birleştirir çünkü bizim tercih edilen bir yöntemdir. Bu erken S fazı hücreleri G1 net bir ayrım ya da geç S, G2 / M faz sağlarAyrıca, bu yaklaşım, bu farklı hücre döngüsü aşamalarında progresyon yönetmelik, birçok farklı hücre uyaranlara ve farmakolojik ajanların etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir. Bu yazıda kültür hücreleri yanı sıra, flow sitometri ile analiz, etiketleme ve boyama yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca bu yöntem, büyüme, TGF-β1 gibi sitokinleri inhibe edici sinyaller ve siklin bağımlı kinaz inhibitörü olan p27KIP1 gibi proliferatif inhibitörlerinin etkilerini ölçmek için nasıl kullanılabileceği deneysel örnekler içerir. Biz aynı zamanda, daha büyük bir kültür içinde 5 hücrelerin bir alt nüfus hücre döngüsü pozisyon analizi için olanak tanıyan alternatif bir protokol içerir. Bu durumda, biz büyük ölçüde aynı kültürü untransfected hücreleri tarafından sayıca az bile retinoblastom geni ile transfekte hücrelerinde hücre döngüsü tutuklama tespit etmek için nasıl göstermektedir. Bu örnekler, DNA boyama birçok yol göstermek veflow sitometri kullanılan ve memeli hücre döngüsü kontrol temel soruları araştırmak için adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

analysis-of-cell-cycle-position-in-mammalian-cells

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

59.8K Görüntüleme.  University of Western Ontario. , Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Video: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Biyoloji

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...