Name: live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Hayvan kullanımı için prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Bakım ve Kullanımı Kılavuzu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönergelerine uygun olarak Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuvar Hayvanları. 1. Beyin Ekstraksiyon, Kesit ve Doku Hazırlama <ol><li> Derin 5 dakika için CO2 ile boğularak ile ötenazi yabani-tip fare soyu C57BL / 6 Kurban. Servikal dislokasyon ile ölüm emin olunuz. </li><li> % 70 etanol ile fare kafasını temizleyin. </li><li> İlk kafatası açığa çıkarmak için başın üstünden başlayarak, kapalı cilt çekerek steril makas ve forseps kullanarak kraniyektomi. </li><li> Sonra, kafatası maruz kaldığında, kemik parçası-by-parça soyma arka tarafında başlayan ve ön tarafına doğru hareket ettirerek kafatası çıkarın. Beyin ventriküllerin yok etmek değil dikkatli olun. </li><li>Tüm beyin toplayın. </li><li> Penisilin 10,000 ünite / ml ve streptomisin ve önceden ısıtılmış 10,000 ug / ml ihtiva eden% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek glikoz ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu içeren bir 100 mm Petri kabındaki beyin yerleştirin 37 ° C arasındadır. </li><li> Keskin bir bıçak ile elle medyan sagital düzlemde beyin dilimleyin ve bir vibratome kullanarak her yarısından itibaren ilk 100-200 mm bölümünü edinin. </li><li> Önceden ısıtılmış 37 ° C, fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) çözeltisi ile beyin dokusu durulayın. </li><li> Hemen, DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış beyin bölümü yerleştirin. </li></ol> 2. Canlı Görüntüleme Yapılandırma ve Kurulum <ol><li> DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 1 ml içeren 30 mm cam alt kültür tabaklarında beyin dokusu kesitleri yerleştirin. % 95 /% 5 O2 / CO2 içeriği 37 ° C, (Şekil 1 &#39;e mikroskop Kapalı bir odanın ortam ayarlama </strong&gt;). </li><li> 60X objektif immersiyon yağı lens kullanarak, ilk 60X objektif lens üzerinde bir yağ damla yerleştirme ve düzenli DIC ile hücrelerin odaklanarak ependimal hücre / kirpikler görüntüleri toplamak ışık iletti. </li><li> Silier dayak alanında kabarcık hareketinin bir tür oluşturmak Sonra, hareketli ependim kirpikler konumu için bir rehber olarak DMEM kabarcık hareket yönünü takip edin. DIC filtresi kullanılarak beynin lateral ventrikül içinde hareketli kirpikler ile sağlıklı hücreleri içeren bir alan seçin. Ependim kirpikler bulunduktan sonra, ışık ayarı ve tatmin edici bir görüntü elde etmek odaklanır. </li><li> Metamorph görüntüleme yazılımı kullanarak belirli bir amaç doğrultusunda canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Mevcut gösteri, objektif 60X ve 5-10 msn maruz kalma süresi ile birlikte, 1 x 1 kamera binning seti ile yirmidört-bit görüntüleri kazanır. </li><li> Asgari exp olması için optimal düzeye mikroskop diyafram açarak DIC görüntüleri toplayınosure zaman. Gecikmeden hızlı ve anında görüntü alımını sağlamak için kameraya canlı görüntüleri akışı gözlemleyin. Yeterli görüntü kontrastını elde etmek için en az pozlama süreleri gereksinimi dayalı kirpikler dayak hızını hesaplayınız. </li></ol> 3. Veri Görselleştirme ve Analiz <ol><li> 1 dakika içinde dayak sayısını sayarak kirpikler dayak sayısını hesaplayın. Video hızını azaltarak ve hücre sayacı veya benzeri bir alet kullanarak vuruş sayısını sayarak bunu yapın. </li><li> Dayak sıklığını hesaplamak için, video sn numarasını almak için edinilen kare ya da time-lapse görüntü sayısına göre kaydedilen hangi pozlama süresini çarpın. (Örnek: pozlama süresi 5 msn 200 kare = 1,000 milisaniye veya 1 sn). </li><li> Tek saniyede yenerek sayısı olarak ifade edilir frekansı elde etmek için bir saniye içinde dayak sayısını hesaplayın. Tek ikinci kez Inter, üzerinde kirpikler dayak sayısına bölünmesiyle yapınval (Örnek: kirpikler = 1 sn 5 msn yani 5 msn x 200 kare pozlama süresi kaydedilen 200 kare video 50 kez yendi, şimdi 1 sn = 50 Hz ile 50 atım bölmek). </li><li> Her iki güç ve kurtarma vuruş sırasında ependim kirpikler tarafından alınan yolu değerlendirerek siliyer dayak açısını hesaplayın. Küçük değişikliklerle 11, daha önce tarif edilen yönteme uygun olarak, bu gerçekleştirme. Bireysel kirpikler kesin hareketi tam yendi döngüsü sırasında görülmektedir. </li><li> Monitörün üzerine yerleştirilen bir asetat sayfasında, ependimal kenarı ve güç inme başlangıcında kirpikler orta hat pozisyonuna yoluyla dikey bir çizgi boyunca yatay bir çizgi çizin. </li><li> Güç inme sırasında ileri hareket ederken kare cilium çerçevenin kesin konumunu çiziniz. Benzer bir tarzda, geri stroku esnasında Sil hareketi çizilir. </li><li> T sırasında orta hattan cilium maksimum sapma gelen siliyer dayak açısını hesaplamakgüç inme yanı sıra kurtarma inme o. </li></ol> 4. Kalsiyum sinyal kayıt <ol><li> Beyin dilimleme sonra, kısa bir süre için 1 x PBS veya Dulbecco PBS (pH 7.0), beyin dilim yıkayın. Floresanlık sönmesini önlemek için ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, taze Fluo-2 hazırlayın. </li><li> , Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde Fluo-2 çözeltisi, 1 mM stok çözelti hazırlayın karıştırmak ve Fluo-2 homojen DMSO içinde eritildi sağlamak için, en az 5 dakika boyunca çözeltiden vorteks. </li><li> % 2 B27 ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 500 ml Fluo-2 stok solüsyonu ile seyreltilir, 20 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar 37 ° C&#39;ye kadar ön-ısıtılır. NOT: B-27 vitamini, antioksidan kokteyli ve hipokampus ve diğer merkezi sinir sistemi nöronlarının kısa veya uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan insülin içeren optimize edilmiş serum serbest ekidir. </li><li> Hemen bir cam alt plaka 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile 20 mg / ml Fluo-2 beyin dilim inkübe edin. </li><li> Kalsiyum fluorofor Flu-2 optimal yükleme konsantrasyonunu belirlemek için ve ATP ile kalsiyum boya hücre toksisite, meydan hücreleri önlemek için, ve ATP cevaben zaman ders ve kalsiyum sinyallerinin tepe büyüklüğünü belirleyerek hücre canlılığı kontrol ediniz. </li><li> 488 nm ve 515 nm, sırasıyla, (Film 2) eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile, 1 saniye (sn 200 kare) bir en az 5 msn bir yakalama oranında kalsiyum salınım için video kaydedin. </li><li> Otofloresans veya hareket eserler arasından Flu-2 kalsiyum sinyalini ayırt etmek, 515 nm yayılan şiddetleri ayrı izlenir emin olun. Not: Flu-2 hücre içi kalsiyum ölçmek için uygun bir kalsiyum fluoremetric değildir. Bununla birlikte, örneğin kalsiyum salınımları hızlı kalsiyum değişiklikleri tespit etmek için mükemmel bir dinamik kalsiyum boyadır. Daha doğru bir kalsiyum ölçümü için, Fura-2 tavsiye edilir. Bununla birlikte, Fura-2&#39;nin dinamik değişimler de rasyometrik ile sınırlıdırboya doğası. </li><li> Tam serbest hücre içi kalsiyum değerlerini hesaplamak için üretici tarafından sağlanan formüller izleyin. Örnek [Ca 2 +] = Kd × (R - R dk) / (R max - R). Kd serbest kalsiyum boyanın ayrışma sabiti olduğu durumlarda, R, 488 ölçülen floresans olduğu, ve R &#39;ve R max dakika minimum ve maksimum iyon konsantrasyonu 12 floresan oranlarıdır. </li></ol> 5. İmmünofloresan Mikroskopi <ol><li> % 4 paraformaldehit (PFA) ile 10 dakika süre ile,% 2 sukroz ihtiva eden fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile beyin bölümleri sabitleyin. Seçenek olarak ise, bir kriyostat kullanarak 50 mm bölüme% 4 daha sonra PFA ve bölüm ile bütün beyin sabitleyin. </li><li> 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın. </li><li> Bir soluti beyin dilim inkübe5 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X ile, daha sonra 5 dakika, her seferinde 1 x PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında (RT) ya da bir saat boyunca 1 x PBS içinde% 10 FBS içinde 5000: fare primer antikor ile beyin dilim inkübe 1 bir seyreltmede kullanılan a-tubulin, antiacetylated. </li><li> 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın. </li><li> Sekonder antikor beyin dilim inkübe 1 bir seyreltme floresein anti-fare IgG: oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1 x PBS çözeltisi içinde 500,% 10 FBS. </li><li> 5 dakika çekirdeği (veya DNA) 13 leke 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölüm counterstain bir floresan mikroskobu altında gözlem, önce. Mümkün olan minimum pozlama süresi ile bölümler hemen photobleaching, görüntüyü en aza indirmek için. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı görüntüleme ve beyin ventriküller içinde ependim kirpikler hızlı ve duyarlı bir yakın gözlem sağlayan floresan mikroskopi hem fare beyin dokusu hazırlanması için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu teknik sadece lateral ventrikül ile sınırlı değildir; diğer beyin ventriküllerde kirpikler gözlemlemek için yararlanılabilir. Bu görüntüleme tekniği bir ex vivo ortamda siliyer dayak ile BOS hareketine benzer bir canlı akışı sağlar. Ayrıca, kirpikler yönlü hareketin a...

Silyum hücre dışı ortama hücre yüzeyinden uzanan duyu mikrotübül tabanlı organellerdir. &quot;9 + 0&quot; ya da &quot;9 + 2&quot; - kendi mikrotübül Kuruluşunuza bağlı olarak, kirpikler iki tip olarak kategorize edilebilir. Fonksiyonel, onların hareketliliği dayanarak, bu hareketli veya non-motil kirpikler 1 olarak kabul edilebilir. Birincil kirpikler genellikle &quot;9 + 0&quot; non-motil kirpikler belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bunlar (&#39;9&#39; ile gösterilir), dokuz paralel çifti mikrotübülleri ve mikrotübüller merkezi çifti (&#39;0&#39; ile gösterilir), merkezi kılıf içinde yoktur. Ancak, embriyo lateraliteyi düzenleyen gibi düğüm kirpikler gibi bazı &quot;9 + 0&quot; kirpikler, 2 hareketli vardır. Diğer yandan, hareketli silia mikrotübül çifti, bir ilave merkezi çift dokuz paralel mikrotübül çifti ek olarak karakterize edilmiştir ve motilite kolaylaştırmak için dinein motor protein ile bağlantılı. Buna ek olarak, bazı &quot;9Böyle koku cilia olarak +2 &quot;kirpikler 3 olmayan hareketli vardır. Beyin ventriküller ve omuriliğin merkezi kanal döşeyen hücreler ependimal beyin ventriküller 4 boyunca beyin omurilik sıvısı (BOS) itmek hareketli kirpikler ile karakterizedir. Bu yöntemin genel amacı kirpikler dinamikleri ve yapısal anomaliler hareketli okuyan kolaylaştırmaktır. Beynin sağlığı ve gelişimi ağır beyin ventriküllerin içinde BOS etkin dolaşımı bağlıdır. Örneğin, normal bir BOS akım ve sıvı dengesi normale dayak ve sırayla nöronal hücrelerin yönlü hareketini düzenleyen kritik rol oynayan ve hücre göçü 7 kök fonksiyonel ependim kirpikler 5,6 gerektirir. Böyle anormal ependim kirpikler işlevi veya hidrosefali ile ilişkili anormal BOS akışına yol açabilir yapısı, tıbbi bir durum olduğu b ventrikül BOS anormal birikimi varYağmur. Bu sonuç kafa içi basınç ve baş, konvülziyon, tünel görme ilerici genişleme ve zihinsel engelli 8 arttı neden olabilir. Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin avantajları üç farklı ependim hücre tiplerini bildirmek için ilk kez izin olduğunu: Ben, onların eşsiz siliyer dayak sıklığı ve açı yenerek dayanan II ve III. Bu ependimal hücreler beyin ventriküllerinde belli bölgeler içinde lokalize. Ayrıca, yaş ve alkol ve ependim hücre tiplerini veya lokalizasyonu değiştirerek üzerinde silostazolün olarak farmakolojik ajanların etkileri ependimal hücrelerin bu sınıflandırmaya önce mümkün değildi, ispat edilebilir. Silostazol, fosfodiesteraz-3 inhibitörü, AMP cAMP&#39;yi metabolize eden bir enzimdir ve bu, aynı zamanda, hücre içi kalsiyum 9 düzenler. Yüksek hızlı floresan görüntüleme analizi kullanılarak eşsiz hücre içi görüntüleme ve niceleme veriyorependim hücrelerin kalsiyum salınımı özellikleri. Örneğin, alkol ve silostazol hem anlamlı sırayla, ependim kirpikler 10 ile beyin omurilik sıvısı volüm replasmanı bir değişikliğe yol açabilecek ependim siliyer dayak frekansı yanı sıra hücre içi kalsiyum salınımlar özellikleri, değiştirilemez. Özet olarak bu teknik, farklı kalsiyum salınım özellikleri olan ependimal hücrelerinin üç farklı tip ilk kanıt sağlamak için önemli idi. Aşağıdaki bölümde, prosedürün ayrıntılı bir adım-adım genel doku hazırlanması ve kullanımdan yakından ilgilenerek, sağlanır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-2&amp;nbsp;</td><td>TEF Labs</td><td>#0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451&amp;nbsp;</td><td>clone 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse antibody</td><td>Vector Labs</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture plate</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Nikon TE2000</td><td>60X oil&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24 x 60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI filter cube</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated ependimal hücreler erişkin beyninde ventrikül sıralanıyor. Anormal işlevi veya ependim kirpikler yapısı çeşitli nörolojik defisitler ile ilişkilidir. hareketli ependim kirpikler tekniğinin ex vivo canlı görüntüleme mevcut birkaç adım takip siliyer dinamikleri ayrıntılı çalışma için izin verir. Bu adımlar şunlardır: farelere karbon dioksid ile ötenazi Toledo Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi protokollerine göre; bir vibratome veya keskin bıçak ile beyin kaldırma ve sagital beyin diseksiyonu ardından kraniektominin ependim kirpikler görüntülenmiştir beyin lateral ventriküller, üzerinden çok ince kesitler elde etmek. % 95 /% 5 O mevcudiyetinde 2 / CO2 karışımı, 37 ° C&#39;de Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) / Yüksek glikoz içeren özel bir cam alt plaka beynin dilimlerin Kuluçka canlı doku tutmak esastır sırasındadeney. Kirpikler dayak bir video daha sonra yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. video sonra siliyer dayak frekansı hesaplamak için kare kare analiz edilir. Bu onların siliyer dayak sıklığı ve açısına göre üç kategoriye veya tipe ependimal hücrelerin farklı sınıflandırma verir. Ayrıca, bu tekniğin ependimal hücrelerin özel hücre içi kalsiyum salınım özelliklerinin yanısıra, kalsiyum salınımlarına farmakolojik ajanların etkisi ve siliyer atan frekans karakterize etmek için yüksek hızlı flüoresan görüntüleme analizi kullanımına izin verir. Buna ek olarak, bu teknik, siliyer yapı ve siliyer protein lokalizasyonu çalışmaları için immünofloresan görüntüleme için uygundur. Bu hastalık teşhis ve fenotip çalışmalarında özellikle önemlidir. Beyin dokusu ölmek başladığında tekniğin ana sınırlama canlı hareketli kirpikler hareketinde azalma atfedilir.

Canlı fare beyninde ependim kirpikler fonksiyonu Ölçme Bu protokol açıklanan yöntem fare beyninin yanı sıra izleme ve kirpikler dayak frekansı incelemek için disseke taze dokuda ependim kirpikler işlev ve yapısını izlemek için kullanılır. Tam bir deney gerçekleştirmek için, ardından adım şematik bir akış şeması (Şekil 1) &#39;de tasvir edilmektedir. Oldukça deneme mümkün olduğunca aktif hareketli kirpikler tutmak için kısa bir zaman dilimi i...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Görüntüleme.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar. 

Video: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nörobilim

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Gelişmekte Olan Fare Beyninde Nöronal ve Glial Hücre Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

Yazar Spotlight: Gelişmekte Olan Beyinde Hücre Göçünü ve Gen Rollerini Keşfetmek

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi