Yazarlar NINDS / NIH, R00-NS064197 ve NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS hem de) fon kabul.

Medya 1. Hazırlanması (Şekil 1, Aşama 1) <ol><li> Dilim Kültür Ortamı <ol><li> Dilim kültür ortamı içinde 25 mi, oyuk başına 2 ile 5 dilim cam alt yemekler hazırlamak için yeterlidir. </li><li> 50 ml konik bir tüp içinde, bir N2 100x çözeltisi 250 ul ve A vitamini 22,5 ml &#39;lik bir hacme kadar DMEM/F12 ekle olmayan bir 50x B27 çözeltisi 500 ul ekleyin. </li><li> Filtre solüsyonu sterilize etmek ve daha sonra ısı ile inaktive edilmiş at serumu 1.25 ml ve fetal inek serumu, 1.25 ml. </li><li> Dilimlerinin hazırlanması süresince 37 ° C&#39;de bir su banyosunda solüsyon inkübe edin. </li><li> Büyüme faktörleri (FGF ve EGF, 10 nihai konsantrasyona ekleme ng / ml ve 20 hemen önce kültür başına), sırasıyla, ng / ml. Bu ortamın bir bileşim kültürde hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için ve sinir progenitörlerin proliferasyonunu oranını artırmak için optimize edilmiştir. Bu, böylece için olasılık maksimize edecekdilim mitotik hücreler görüyoruz. </li></ol></li><li> Tam HBSS Diseksiyon Çözüm <ol><li> , 0.9 M NaHCO 3 2.2 ml 1 M Hepes, 1.25 ml (pH 7.4, 2.5 mM FC), 2.5 M D-Glukoz 6 ml (FC 30 mM) HBSS 10x, 50 ml ilave etmek suretiyle, tam HBSS 500 ml hazırlayın 500 ml&#39;lik nihai hacme kadar diH 2 O otoklav (FC 4 mM) ve. </li><li> Gebe fare rahim boynuzları koleksiyonu kadar 4 ° C&#39;de sterilize çözüm ve mağaza. Bu çözelti hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Bütün diseksiyon prosedür sırasında buz üzerinde HBSS tutun. </li></ol></li><li> Çözüm gömme <ol><li> 4 embriyonik beyinlerin gömme için, tam HBSS çözeltisi içinde% 3 düşük erime noktalı agarozun 30 ml hazırlar. 50 ml konik tüp, 30 ml düşük erime noktalı agaroz ve tam HBSS 0.9 g. </li><li> , Bir girdaplı karıştırıcı ile çözüm karıştırın ve tüp duran ve kapak açık olan bir mikrodalga içinde eritin. </li><li> Mikrodalgada, p çözüm izlemek daAşırı kaynama nedeniyle Revent taşması. Başlar kaynarken, mikrodalga durdurmak ve çözüm vorteks. </li><li> Tüm agaroz eriyene kadar bu adımları tekrarlayın. </li><li> 42 ° C&#39;de bir su banyosu içinde tüpü saklayın </li></ol></li></ol> Embriyoların 2. Diseksiyonu (Şekil 1, Adım 2) <ol><li> Hamile fare dikkatli ötenazi sonra, rahim boynuzları toplamak ve soğuk dolu 1x HBSS içeren 10 cm 2 Petri kabı içine aktarabilirsiniz. Embriyonun yaşı çalışmaya bağlı olarak değişebilir. Bu protokol E17.5 embriyonik gün E12.5 beyin dilimleri kültürlemek için başarıyla kullanılmaktadır. Onların büyüklüğü nedeniyle, genç beyinleri ile çalışmak daha zor olma eğilimindedir. </li><li> Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare 26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Bu olabilir,tüm beyinleri edilene kadar oda sıcaklığında tutulması. </li><li> Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare 26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Tüm beyinleri edilmiştir kadar bu, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li></ol> 3.. Embriyonik Brain gömülmesi (Şekil 1, Adım 3) <ol><li> Bir kova içeren buz olarak, gömme kalıp içine eklemek için buz içinde bir delik oluşturmak. </li><li> Plastik bir kalıba% 3 agaroz orta dökün ve buz içinde hazırlanan delik kalıp içine yerleştirin. </li><li> Sıcaklık 35 ° C&#39;ye ulaşana kadar dijital bir termometre ucu ile agaroz orta karıştırın </li><li> Derhal gömme ortamı içine beyin aktarın. </li><li> Kritik Basamak: dikkatli bir şekilde, beyin ve agaroz arasındaki ara yüzeyde fazla HBSS kaldırmak için tekrar tekrar ve yavaşça / beyin döndürme çamaşırforseps ile gömme çözeltide. </li><li> Agaroz jel bir yastık buz ile temas kalıbın altındaki oluşturacaktır. Beyin karıştırılırken yastık forseps ucu ile hissedilebilir kez, dorsal yüzü yukarı ile beyin yerleştirin. Beyin kalıp çok dibine batırmak olmamalıdır. </li></ol> Agaroz Blok 4. Hazırlama (Şekil 1, Adım 4) <ol><li> Agaroz en az 5 dakika boyunca buz içinde sertleşmeye olsun. </li><li> Bir tıraş bıçağı kullanarak, bölüm kalıbın köşelerinde. </li><li> Dikkatli bir jilet kullanarak beyin çevresinde bir agaroz blok bölmek. Gömülü beyin karışmasını önlemek için kesim sayısını en aza indirmek için deneyin. </li><li> Kesit kaide üzerinde bloğun kararlılığını arttırmak için (Şekil 1, Adım: 4, rostral bölge karşı) blok beynin kaudal bölgede daha büyük bir yüzey alanına sahip olduğundan emin olun. </li><li> Son kesim beynin kaudal tarafında biri olmalıdır;Bu kesim Vibratome ile doğru kesit düzlemini tanımlamak olacaktır. </li><li> Beyin rostro-kaudal ekseni ve agaroz bloğuna dik olarak bıçağın bunu. Caudally rostro-kaudal ekseni boyunca bıçak aşağı kaydırın ve yaklaşık 5 mm uzakta beynin en kaudal bölgeden son kesim yapmak. </li><li> Kenara agaroz / beyin bloğu ayarlayın ve diğer beyinleri gömülmesini tekrarlayın. </li></ol> Vibratome Tepsi içine gömülü Brain 5. Transferi (Şekil 1, Adım 5) <ol><li> Vibratome tepsinin dibine üzerine tutkal bir damla ekleyin. Agaroz blok titreşimli kanadın ulaşılabilecek yerleştirilmiş olacak, böylece yapıştırıcı yerleştirin. </li><li> Spatula kenarı üzerinde blok devrilme yaklaşık% 50 ile, spatula kenarında agaroz / beyin blok kaudal tarafı aşağı yerleştirin. </li><li> Tutkal agaroz blok kaudal yüzünü uygulayın ve s ile tepsinin altına agaroz blok bakımı, uzakta spatula kaydırıncımbız bir çift houlder. Spatula doğrudan tutkal temasa izin vermeyin. </li><li> Tutkal 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya olsun. </li></ol> Gömülü Brain 6. Kesit (Şekil 1, Adım 6) <ol><li> HBSS ile vibratome tepsiyi doldurun. </li><li> Vibratome bıçak başlangıç ​​ve bitiş pozisyonları tanımlayın. </li><li> 250 mikron dilimleri - 200 oluşturun. - 4, frekans 8 hız 2: VT1000S Vibratome ile, aşağıdaki parametreleri kullanın. </li><li> Onlar kesilir gibi dikkatle Vibratome gelen dilim çıkarın. Tam HBSS ile dolu 12 iyi yemekleri içine bir spatula ve cımbız arka ucu ile dilimleri aktarın. Alternatif olarak bazı araştırmacılar, cımbız yerine bir fırça kullanmış Anahtar nokta:. Transferi sırasında, beyin dilimleri çevreleyen agaroz takılı kalması dikkat. </li></ol> Dilimler 7. Syto11 lekelenmesi (Şekil 1, Adım 7) <ol><li> Bir son konsantrasyon için Syto11 seyreltin0,5 - Dilim kültür ortamı içinde 1 uM büyüme faktörleri ile takviye edilmiştir. </li><li> Bir 12-yuvalı plaka oyuğuna olarak, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca boyama çözeltisinin 2.5 ml bir beyin dilimleri inkübe </li><li> 20 dakika boyunca solüsyon lekelemeden dilim kültür ortamına 2.5 ml dilimleri yıkayın. </li></ol> 8. A Glass Bottom Bulaşık Dilimleri Montaj (Şekil 1, Adım 8, 9) <ol><li> Dilim başına kollajen çözüm gömme 15 ul hazırlayın. 10x DMEM, 1 M NaOH 9.4 ul ve H 2 290 ul O&#39;dan 75 ul ile 3 mg / ml tip I kolajen çözeltisi 375 ul karıştırılarak bir 1.5 mg / ml kolajen çözeltisi hazırlayın Buz üzerinde saklayın. </li><li> 35 mm bir cam taban Microwell Bulaşık altındaki kolajen çözeltisi, 15 ul damla yerleştirin. Dilimin büyüklüğüne uygun bir pipet ucu ile yayıldı. </li><li> Cımbız, bir spatula ve çift kollajen düşüş içine dilim aktarın Anahtar nokta:. Farklı birden çok dilim Montajent yemekler görüntüleme için uygun dilimleri elde etmek için olasılığını arttırır. Ekran farklı dilimlerde ve en iyi &quot;Temsilcisi Sonuçlar&quot; bölümünde, aşağıda açıklanan kriterlere uygun olanları seçin. </li><li> Dilimleri% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine transfer etmeden önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 20 dakika sonra, cam alt Microwell çanağı içine dilim kültür ortamı, 1.2 ml. Bir seferde ortamın 600 ul ilave edin ve bir pipet ucu ile yayıldı. </li><li> Dilim anatomik seviyesini ve bütünlüğünü kaydetmek için beyin dilim düşük bir büyütme görüntü yakalayın. </li></ol> Dilimleri 9. Canlı Görüntüleme (Şekil 1, 10, 11 Steps) <ol><li> Dilimleri canlı görüntüleme önce,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de en az 1 saat ve 30 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde geri olsun. </li><li> Syto11 Photobleaching çok eğilimli olduğunu göz önünde tutarak seçim mikroskop ile görüntü dilimleri. Bir inver Buradated dönen disk konfokal mikroskop (Andor XD devrim dönen disk konfokal mikroskop) kullanılır. Alternatif olarak, bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılabilir. Aşağıdaki parametreler dönen disk mikroskop set-up için vardır. </li><li> Bütün canlı görüntüleme oturumu sırasında, 37 ° C, mikroskop bağlı bir inkübasyon odası içinde nemlendirilmiş% 5 CO2 de dilim korumak. </li><li> 300 mikron bir çalışma mesafesi ile 60X silikon yağı objektif ve 1.3 bir sayısal diyafram ile Görüntü hücreler (örnekler Şekil 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B için bkz). 130 um&#39;lik bir çalışma mesafesi ve 1.4 &#39;lük bir sayısal açıklığı olan bir 100X yağ amacı, (örneğin, Şekil 4C bakınız) de kullanılabilir. Kameranın çözünürlüğü 512 x 512 olduğunu. </li><li> Yaklaşık 40 um dilim yüzeyinin altında yer alan z-yığınının merkezi ile bir 30 um-z yığını, Görüntü hücreler. Doku içine daha derin görüntü çalışırken amaç eklemek neden olabilirdilim mekanik basınç. Bu beyin dilim bütünlüğünü etkileyebilir. Planlama hücrelerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için ise, artık mikron 2 den bir z-aralığı kullanınız. </li><li> Photobleaching sınırlamak için lazer güç ve maruz kalma sürelerini ayarlayın. 30 ila Syto11 sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak 200 ms arasında değişen maruz bırakma sürelerinin kullanılması. </li><li> , Bir motorlu kaide ile, birden fazla görüntü dilimleri üzerinde birden fazla pozisyon 1 kabına monte edilmiştir. 1 tek tabak 4 farklı dilimlere dağılmış 20 pozisyonları Örneğin, görüntü yukarı. </li><li> Canlı görüntüleme için, mitoz farklı aşamalarının belirlenmesini sağlamak için en az 5 dakika bir zamansal çözünürlük kullanın. Syto11 ve / veya histon H2B-EGFP kullanılarak, 4 - canlı görüntüleme 5 saat mitotik hücre önemli sayıda gözlemlemek için yeterlidir. Görüntüleme seyrek (örneğin utero elektroporasyon elde gibi) mitotik hücreleri etiketli Ancak, daha sonra uzun bir görüntüleme parametresi (gece) uygun olduğunu ve biz işlerill. Not: Bu protokolü kullanarak, biz genellikle pozisyon başına ortalama 10 mitotik hücreler üzerinde gözlemlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, görüntüleme birden çok dilim monte başarılı bir deney sahip olasılığını artırır. Bu yaklaşım ile, tipik haliyle Syto11 ya da histon H2B-EGFP ile yapılan hemen hemen tüm deneylerde, hücreler mitotik belirlemek. </li></ol> 10. Mitoz Post-satın alma Analizi (Şekil 2) Bu bölümdeki tüm işlemler bu ücretsiz açık kaynak kodlu bir yazılım olduğu için avantajlıdır Fiji (İmageJ), optimize edilmiştir. Diğer yazılım çözümleri gibi Metamorph, Imaris ve Amira gibi aynı görevleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. <ol><li> Mitotik tanımlanması Fiji Rakamlar <ol><li> Bir &quot;hyperstack&quot; gibi bir pozisyon için veri kümesini açtıktan sonra, doku ve hücrelerin sağlıklı bakmak yere (tartışma bölümünde Kriterler) (kaydırma çubuğunun konumu için Şekil 2A) bir z-düzlem seçin.Bu tanımlamak için en kolay mitotik faz olarak, Anafazda geçiyor hücreleri tanımlamak için zamansal boyutu boyunca ilerleyin. </li><li> Hücre mitoz (DNA yoğunlaşması) girdiği zaman noktasını belirlemek için zamanda geriye gidin. Hücre z-düzlemleri üzerinde hareket edebilir, ama zamansal çözünürlük ve daha önce açıklanan z-yığın parametreleri bu süreci sağlamak için optimize edilmiştir. </li><li> Bir elektronik olarak, mitoz girerken (Fiji arayüzünde bu rakamların yerini görselleştirmek için Şekil 2A, X, Y, Z ve zaman) 4D hyperstack hücrenin koordinatlarını kaydetmek. Bu koordinatlarını bilerek aynı hücreye birkaç kez sayım önleyecektir. </li><li> Zaman içinde ilerlemek ve hücre bir fazdan diğerine ilerledikçe zamanı kaydedecektir. Bir belirli bir hücre için, her bir mitotik fazının süresini belge. </li><li> Tam bir veri kümesi üzerinde diğer hücreler, (içinde ve konumlarındaki birden hücreler) ile devam edin. </li></ol></li><li> 3D Yeniden İnşaHücreler iyon ve metafaz sırasında dönme kantitasyonu (Haydar et al, 2003 &#39;den uyarlanmıştır) (Şekil 2B). <ol><li> Metafaz başına kadar birden mitoz hücre tespit ettikten sonra, bir hücrenin koordinatlarını kullanmak ve zaman içinde ilerleyin. </li><li> Ventriküler sınır (&quot;Resim / Transform / Döndür ...&quot; komutunu kullanarak) düzlemsel böylece tüm &quot;hyperstack&quot; döndürün. Bu dönüş için başvuruda açısını belirlemek için &quot;açı&quot; aracını kullanın. </li><li> Ilgi hücre en görünür olduğu z-düzlemi tanımlayın. Bu düzlemde, tüm hücreyi içeren bir seçim çizmek için &quot;dikdörtgen seçim&quot; aracını kullanın. </li><li> Ilgi konusu hücre, z-uçakları belirlenmesi. Bir &quot;alt-yığını&quot; yaratmak için &quot;Image / Kopyala&quot; komutunu kullanın. Iletişim kutusunda, kontrol &quot;Duplicate hyperstack&quot; bırakın. &quot;Dilimler (z)&quot; parametresi de dahil olmak üzere bütün ce z-düzlemlerine karşılıkll, ve &quot;Çerçeve (t)&quot; parametresi, geçerli zaman noktasına karşılık gelir. </li><li> Çözünürlük kötü ise, &quot;Resim / ayarla / Boyutu ...&quot; komutunu kullanarak &quot;alt yığın&quot; boyutunu artırır. </li><li> &quot;Image/Stacks/3D projesini ...&quot; komutunu kullanarak şimdiki zaman noktasında hücrenin bir 3D yeniden oluşturun. Bu komut için parametreler Şekil 2B&#39;de görüntülenir. &quot;Dilim aralık&quot; z-düzlemi görüntüleri (um) her biri arasındaki aralığa karşılık gelir. Önemli: alt yığın fiziksel boyutu (mikron) muhafaza edilmiş olduğundan emin olun. Eğer değilse, z boyutta piksel interpolasyon yanlış olacaktır ve 3D rekonstrüksiyonu yanlış olacaktır. </li><li> Metafaz plakasının kenar görülebilir, böylece kaydırma çubuğunu kullanarak, sonuçta elde edilen 3D yeniden döndürün. Çerçevenin sayısı, Şekil 3B&#39;de tarif edilen beta açıya karşılık gelir, bu numarayı kaydedin. Kullanma&quot;açı&quot; aracı ve &quot;Analiz / Tedbir ...&quot; komutu, yatay ve (Şekil 2B) dik metafaz plakayı ikiye ayıran bir çizgi arasındaki açıyı ölçmek. Bu açı alfa. </li><li> Ilgi konusu hücrenin tüm metafaz zaman noktaları için bu açıları kaydedin. Zaman noktalarında (t) ve (t-1) arasındaki dönme açısı (t-1), (T) bir açı ve bu açısı arasındaki farkın mutlak değerine eşittir. </li></ol></li><li> Yarılması Plane Yönünü Ölçme <ol><li> Metafaz plakaların 3D rekonstrüksiyon için açıklanan talimatları izleyerek Anafazda sırasında bir zaman noktasında bir ilgi hücreyi yeniden 3D. </li><li> Ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki levhanın kenarları görebilir kadar yeniden döndürün. </li><li> Yatay arasındaki açı (ventriküler kenar) ve bir ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki plakalara paralel bir çizgi ölçmek için açı aracını kullanarak. Bu yarılma düzleminin (Şekil 2C) açıdır. </li></ol></li><li> Film Üretimi <ol><li> Hücreler genellikle farklı z-düzlemleri üzerinde hareket olarak, canlı görüntüleme oturumu sırasında hücre tarafından işgal z uçakları tespit. &quot;Görüntü / Bacalar / Z projesi ...&quot; komutunu kullanarak bu z-uçaklık bir &quot;Maksimum yoğunluk projeksiyonu&quot; oluşturun. Bir &quot;. TIF&quot; dosyası olarak çıkan yığını kaydedin. </li><li> Fiji &quot;. Mov&quot; veya &quot;. Avi&quot; dosya nesil için istikrarlı bir eklenti içermez gibi ImageJ 1.45 sürümünde bu dosyayı açın. </li><li> Aşağı-akış uygulamaları ile uyumlu bir formatta bir film oluşturmak için ImageJ komuta &quot;... / olarak Dosya / Kaydet&quot; kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+morphological+heterogeneity+of+neural+precursors+in+the+mouse+neocortical+proliferative+zones.">Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones.</a> J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).</li><li>Konno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+progenitors+undergo+LGN-dependent+planar+divisions+to+maintain+self-renewability+during+mammalian+neurogenesis.">Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis.</a> Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).</li><li>LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+human+neocortex.">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146, 18-36 (2011).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409, 714-720 (2001).</li><li>Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).</li><li>Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+rotation+and+mode+of+cell+division+in+the+developing+telencephalon.">Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Pilaz, L. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+G1-phase+reduction+alters+mode+of+division,+neuron+number,+and+laminar+phenotype+in+the+cerebral+cortex.">Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+predicts+outer+radial+glial+cell+generation+in+human+neocortex.">Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex.</a> Nature Communications. 4, 1665 (2013).</li><li>Postiglione, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Inscuteable+Induces+Apical-Basal+Spindle+Orientation+to+Facilitate+Intermediate+Progenitor+Generation+in+the+Developing+Neocortex.">Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 72, 269-284 (2011).</li><li>Silver, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exon+junction+complex+component+Magoh+controls+brain+size+by+regulating+neural+stem+cell+division.">The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division.</a> Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).</li><li>Pulvers, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+mouse+Aspm+(abnormal+spindle-like+microcephaly+associated)+cause+not+only+microcephaly+but+also+major+defects+in+the+germline.">Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).</li><li>Feng, Y., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+regulation+by+Nde1+controls+cerebral+cortical+size.">Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size.</a> Neuron. 44, 279-293 (2004).</li><li>Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5rap2+exposes+the+centrosomal+root+of+microcephaly+syndromes.">Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes.</a> Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).</li><li>Bond, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+mechanism+involving+CDK5RAP2+and+CENPJ+controls+brain+size.">A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size.</a> Nat Genet. 37, 353-355 (2005).</li><li>Shu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doublecortin-like+kinase+controls+neurogenesis+by+regulating+mitotic+spindles+and+M+phase+progression.">Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression.</a> Neuron. 49, 25-39 (2006).</li><li>Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex:+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling.">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li><li>Hu, D. J. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells.">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li><li>Noctor, S. C., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li><li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis,+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li><li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain.">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains.">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors.">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li><li>Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice.">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li><li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells.">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis.">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li><li>Schenk, J., Wilsch-Br&#228;uninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors.">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Tarif ettiğimiz protokolün önemli bir avantajı sinir atalarıdır mitoz dinamik bir zamansal çözünürlük sağlamasıdır. Tipik olarak, gelişmekte olan beyinde mitoz görselleştirmek için deneyler, sabit bir doku bölümlerinin immünofloresan kullanılarak gerçekleştirilir. Ama bu yaklaşım sadece bir zaman noktasında mitoz bir anlık görüntüsünü sağlar. Beyin dilimleri mitoz görüntüleme için en kritik olan birkaç adım vardır: 1) beyin dilimleri transferi ve mont...

Bu protokolün genel amacı embriyonik beyin dilimleri nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl tarif etmektir. Kültürde beyin dilimleri canlı görüntüleme kullanarak, bu protokol, bir in vivo ortamda yüksek oranda benzer bir ortamda sinir progenitörlerin mitoz yönlerine bir çok yönü tahlil için basit bir yöntem sağlamaktadır. It) utero elektroporasyon ile 1-5 manipüle edilmiş olan mutant hayvan ve / ya da beyin beyinlerine uygulanabilir. Bu teknik sadece kültür ortamına bir madde eklenmesi ile, sinir ön-&#39;mitoz ile ilgili farmakolojik maddelerin etkisini test etmek için de idealdir. Özetle, bu makalede nörogenezi okuyan bir teknik zorlu protokol erişilebilir hale getirecek. Nöron sırasında, farklı nöral progenitör popülasyonları sonunda 6-8 neokorteks yetişkin altı kortikal katmanları katkıda nöronlar oluşturmak için kesin bölünmeler tabi. Nöroepitel (NE) hücreler, kendini yenileme simetrik bölmek gibi erken kortikal geliştirme, nöral prekürsör havuzu genişler. NE hücreler daha sonra radyal glial hücreler (RGCs) dönüştürmek. Başlangıçta RGCs ancak nöron toplu sırasında, bölünme RGCs &#39;ana mod asimetrik olup, iki yeni RGCs üretmek için simetrik bölmek. Asimetrik bir bölümü olarak, 1 RGC yeni RGC ve ya bir post-mitotik nöron ya da daha özel bir progenitör (ya da kısa sinir öncü (SNP), bir dış radyal glia (ORG), ya da bir ara progenitör (INP) yol açar 2,3,7,9. INPS, SNP ve Orgs sonra alt ventrikül, ventriküler nöronların üretebilir, ve korteks bazal bölgeleri, sırasıyla. Dolayısıyla, atalarıdır hücre bölünmesi nöronları üretmek için temel bir süreçtir neokorteks. Çeşitli çalışmalar belirli mitoz RGCs özellikleri ve kızı hücrelerinin kaderi arasında bir korelasyon olduğuna işaret. Haydar et al. Ve Takahashi et al.RGC mitoz süresi ve nöron ilerledikçe hücre döngüsü uzunluğu artışı, bir bulgu çalışmalar 10-13 takip yankılandı olduğunu göstermiştir. Bir dizi çalışma ventriküle mitotik iğ yönlendirme göre, sırasıyla, beyinde üretilen nöronların türleri ve döl konumu, 3,10,14-16 içeren nöron ve kortikogenezin yönlerini etkileyen olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yarılma düzlemi yönlendirilmesi, doğrudan hücre kaderini etkiler tartışmalıdır, ama sonuç bu mitoz parametre etkiler nöron kalır. Daha fazla mitoz önemini vurgulayan mitoz mekaniği oynayan çok sayıda gen nöron ve uygun beyin gelişimi için 17-20 çok önemli olduğunu gözlemdir. Mitoz dinamik bir süreç, henüz bugüne kadar nöral progenitör mitoz ayrıntılı çalışmaların çoğu in vitro hücre kültürü yoluyla sabit doku bölümleri veya nöral atalarıdır görüntüleme analizini kullanmak. Böylece, mitoz değerlendirmek için genel yöntemleri sadece bu sürecin bir anlık sağlamak ve hücreler bir dokuda nasıl davrandığını ortaya çıkarmak için başarısız. Nöral progenitör mitoz Canlı görüntüleme giderek nöral progenitör işlevini anlamak için kritik bir araç haline gelmiştir. Örnekler için bu referanslar bakınız 4,8,10,21-25. Çeşitli seçkin protokoller hazırlanması ve beyin dilimleri 26,27 görüntülenmesi için yayınlanmıştır. Ancak bugüne kadar, görüntüleme ve mitoz analizi için geniş kapsamlı bir protokolü tarif edilmemiştir veya video gösterdi. Bu teknik, beyin bölümlerinin sabit analizi üzerinde çeşitli önemli avantajlar sunar. Beyin dilimleri Time-lapse analiz esnek bir şekilde analiz edilebilir ölçüde daha fazla veri noktaları nesil sağlar. İlk olarak, veri birkaç dakika veya birkaç saat boyunca ayrı zaman noktalarında toplanmıştır. Bir birey zaman noktaları (statik bir montaj oluşturmak için) ya da analiz edebilirsinizfilm içine farklı zaman noktaları birleştirebilirsiniz. İkincisi, dilim konfokal görüntüleme beyin dilimleri farklı Z bölümlerde veri nesil sağlar. Sonuç olarak, ayrı ayrı bölümler analiz edilebilir. Seçenek olarak ise, tek tek bölümlerin yığınları maksimum yoğunluk çıkıntı halinde birleştirilebilir. Üçüncü olarak, analiz hücreler komşu hücreler ve yapılarına göre bölmek ortaya koyarak, bir doku bağlamında yapılır. Dördüncü olarak, bu ideal mitotik kusurları bazı kanıtlar göstermektedir mutantların analizi için uygundur. Birlikte bu protokol, kendi laboratuarlarında nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme yürütmek isteyen araştırmacılara yardımcı olmak için önemli adımlar netleştirmeye yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:261px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X N2</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50X B27 without vitamin A</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated horse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1138-500ml</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat-inactivated calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>R&#38;D Sytems</td>
			<td>3139-FB-025</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14065-056</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes Free Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;H4034</td>
			<td style="width:261px;">dilute to 1M (pH7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5M D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9M NaHC03</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-melting agarose</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 404 glue</td>
			<td>Loctite 404</td>
			<td>46551</td>
			<td style="width:261px;">keep at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syto11</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>S7573</td>
			<td style="width:261px;">Make 5&#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mg/ml collagen type I&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A1048301</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">digital thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to measure the temperature of the agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">alternative to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">dissecting out embryos</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">imaging microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex

Kısa süreli de, mitoz beyin de dahil olmak üzere organların gelişimi için temel karmaşık ve dinamik çok adımlı bir işlemdir. Gelişmekte olan serebral korteks, sinir atalarıdır anormal mitoz beyin büyüklüğü ve işlevi bozukluklara neden olabilir. Bu nedenle, nöral progenitör mitoz mekanizmalarını anlamak için araçlar için kritik bir ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde kortikal gelişim bu sürecin eğitim için olağanüstü bir modeldir. Nöral progenitör mitoz sık sabit beyin bölümlerinde incelenmiştir. Bu protokol ayrıntılı olarak ex vivo embriyonik beyin dilimleri mitoz canlı görüntüleme için bir yaklaşım anlatacağız. Beyin çıkarma, beyin gömme, beyin dilimleri Vibratome bölümlendirilmeleri, lekelenme ve dilimleri kültürlemenin ve time-lapse görüntüleme: Biz dahil olan bu işlem için kritik adımları anlatacağız. Biz o göstermek ve mitoz alım sonrası analizi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Biz temsili sonuçları fr dahilom hayati boya Syto11, transgenik fareler (histon H2B-EGFP ve merkezleme-EGFP) ve utero elektroporasyon (MCherry α-tubulin) kullanarak bu deneyi. Bu işlem en iyi optimize edilebilir nasıl ve mitoz genetik düzenleme çalışması için modifiye edilebilir nasıl tartışacağız. Beyin dilimleri mitoz Canlı görüntüleme kontrollü bir ortamda yaş, anatomi ve genetik pertürbasyonun etkisini değerlendirmek ve yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile veri büyük miktarda üretmek için esnek bir yaklaşımdır. Dolayısıyla bu protokol nöral progenitör mitoz analizi için mevcut araçları tamamlayacak.

Bu deneyde başarısı ve bir canlı görüntüleme oturumu sırasında birden fazla mitotik hücre gözlem büyük ölçüde bütünlüğü ve satın yapılır dilimin anatomik düzeyde hem bağlıdır. Aşağıda tartışıldığı gibi, bir dilim anatomik düzeyi önemli bir faktördür. Şekil 3A rostro-caudal gösterir ve medial-lateral biz en başarılı olmuştur yerleri. Bu konuda ek tartışma için Noctor 26 bakın. Dilimin bütünlüğü dilim farklı bölgelerinde değişiklik gö...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex at JoVE.com

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Görüntüleme.  Duke University Medical Center.  Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir. 

Video: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Nörobilim

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Gelişmekte olan beyin motor Cortex non-Invaziv modülasyon ve robotik haritalama

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...