The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells).">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector.">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li><li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune,+a+non-integrating+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li><li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA.">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li><li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li><li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells,+hair+keratinocytes,+and+skin+fibroblasts.">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li><li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs.">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells.">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li><li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells.">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li><li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood.">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults:+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li><li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors,+cell-cell+fusion,+and+cytoplast+fusion.">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565 (2010).</li><li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance.">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li><li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties.">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li><li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents.">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li><li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy.">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li><li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis.">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration.">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4/Arf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming.">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus:+mechanistic+insights+into+efficient,+licensed,+extrachromosomal+replication+in+human+cells.">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

No passado, a única forma de obter células-tronco pluripotentes humanas portadores de uma mutação genética particular foi recrutar pais submetidos a um diagnóstico genético pré-implantação e gerar células-tronco embrionárias a partir de suas blastocistos descartados 31,32. Usando uma abordagem de reprogramação, os pesquisadores podem agora gerar iPSCs de pacientes portadores de virtualmente qualquer genótipo. A possibilidade de iniciar a partir de uma linha de células específica para cada pac...

Em 2006, o grupo de Shinya Yamanaka 1 demonstraram pela primeira vez que as células somáticas de ratos e seres humanos adultos pode ser convertido para um estado pluripotente pela expressão ectópica de quatro factores de reprogramação (Oct-4, Sox-2, 4-Klf, e c-Myc), gerando as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 2. IPSCs específica para cada paciente se assemelham células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em termos de morfologia, proliferação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células germinativas (três mesoderme, endoderme e da ectoderme), enquanto falta as preocupações de ordem ética associados à utilização de hESCs e ignorando possível rejeição imunológica 3. Assim, iPSCs aparecer como uma das mais importantes fontes de células específicas do paciente para a pesquisa básica, a seleção da droga, modelagem de doença, avaliação de toxicidade e efeitos de medicina regenerativa 4. Várias abordagens têm sido utilizadas para a geração de iPSC: vectores de integração virais(Retrovírus 5, lentivírus 6), viral não-integração de vetores (adenovírus 7), Sendai-vírus 8, 9 BAC transposons, vetores epissomais 10, proteínas 11 ou 12 RNA entrega. Embora o uso de métodos mediada por vírus pode levar a uma alta eficiência de reprogramação, os vectores virais integrar-se no genoma das células hospedeiras e, por conseguinte, mutagénese de inserção aleatória potencial, alteração permanente da expressão do gene, e reactivação de transgenes silenciados durante a diferenciação não pode ser excluído 13. Para fazer iPSCs mais seguro para a medicina regenerativa, foram feitos esforços para derivar iPSCs sem a integração de DNA exógeno em genomas celulares. Embora os vectores virais ele sujeitos e transposões foram desenvolvidos, ainda não é claro se as sequências de vector, o que inevitavelmente curtas permanecem nas células transduzidas após excisão, e expressão de transposase, poderia induzir alteração na célulaular funcionar 13. Apesar da sua alta eficiência de reprogramação, vírus Sendai representa uma abordagem caro e preocupações atingem-through de licenciamento com a empresa que desenvolveu este sistema tem o potencial de limitar a sua aplicação em estudos translacionais. Além disso, a necessidade de introdução directa de proteínas e RNA requer entrega múltiplo de reprogramação moléculas com as limitações técnicas inerentes Isso introduz e eficiência global de reprogramação é muito baixa 14. De nota, métodos virais livres e não-integração eficaz em termos de custos com base no uso de plasmídeos epissómicos têm sido relatadas com sucesso para a reprogramação de fibroblastos da pele 15. Especificamente, no presente trabalho, decidimos usar plasmídeos epissomais livre de integração disponíveis comerciais, conforme relatado anteriormente 10,15. Até à data, os fibroblastos da pele representam o mais popular tipo de célula doadora 5. No entanto, outras fontes de células foram successfully reprogramado em iPSCs incluindo queratinócitos 16, medula óssea células-tronco mesenquimais, células do estroma 17 adiposo 18, 19 folículos pilosos e as células da Polpa Dentária 20. O isolamento destas células requer procedimentos cirúrgicos, e várias semanas são necessários para a expansão in vitro de células, a fim de estabelecer uma cultura de células primárias. Neste contexto, a selecção do tipo de células de partida é crítica e é igualmente importante ser capaz de produzir a partir de tecidos iPSCs facilmente acessíveis e menos invasivas, tais como sangue. Ambas as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMNCs 21,22) e células mononucleares de sangue periférico (14,22-24) PBMNCs representam fontes adequadas de células para a derivação de iPSCs. Embora a eficiência do adulto PBMNC reprogramação é 20-50 vezes mais baixa do que a de CBMNCs 22, eles continuam a ser o tipo de célula mais conveniente para efeitos de amostragem. Emfato, a amostragem PBMNC tem a vantagem de ser minimamente invasivo, e, além disso, estas células não necessitam de grande expansão in vitro antes de experiências de reprogramação. Até à data, os protocolos diferentes têm relatado que PBMNCs após separação por gradiente de densidade pode ser congelado e descongelado dias a vários meses após a congelação e expandido por poucos dias antes de reprogramação em iPSCs 22,23. No entanto, tanto quanto nós estamos cientes há relatos têm descrito a reprogramação da PBMNCs de crostas inflamatórias congelados. Importante, cremes leucocitários congelados recolhidos sem separação por gradiente de densidade representam as amostras de sangue mais comuns armazenadas em bancos de recursos biológicos de grande escala a partir de estudos populacionais, representando, assim, uma piscina facilmente acessível de material para a produção iPSC que evita ainda a coleta de amostras. Aqui nós relatamos pela primeira vez a geração de iPSCs virais-livre de cremes leucocitários humanos congelados, com base em um protocolo previamente descrito 22. EmAdicionalmente, foram gerados a partir iPSCs PBMNCs congelados obtidos após separação por gradiente de densidade, tal como um protocolo de controlo para os resultados PBMNC gradiente de densidade não-purificadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>VF-054SBCS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>0.5 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Polysucrose solution for density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21056-023</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056&#160;</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>Final Concentration at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>100 ng/ml (Stock:100 &#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td>40 ng/ml (Stock: 40 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>2 U/ml (Stock: 50 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#956;M (Stock: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Holo-Transferrin</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>2914-HT</td>
			<td>100 &#956;g/ml (Stock: 20 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium for cytogenetic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Medium for iPSC feeder-free culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>0.1 mM (Stock: 50 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>0.25 mM (Stock: 0.5 M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic, 145 aa&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503&#160;</td>
			<td>10 &#181;M (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Defined Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH 30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA Laboratories GmbH</td>
			<td>L11-007</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)</td>
			<td>Global Stem</td>
			<td>GSC-6201G</td>
			<td>1*106 cells/6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27077</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27078</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27080</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-EGFP</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27082</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Staining Kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9081</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-33759</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Troponin I Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15368</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7732</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuronal Class III &#223;-Tubulin (TUJ1) Antibody</td>
			<td>Covance Research Products Inc&#160;</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>657012</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596-018&#160;</td>
			<td>reagent for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11754050</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>185-5195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>700-7000</td>
			<td>Instrument to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion RNA Highsense Analysis kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007105</td>
			<td>Reagent kit to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeonTransfection System 100 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK10025</td>
			<td>Reagent kit for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Instrument used for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Instrument for DNA/RNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids

Células somáticas pode ser reprogramada em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), forçando a expressão de quatro fatores de transcrição (Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-Myc), normalmente expressa por células-tronco embrionárias humanas (hESCs) . Devido à sua semelhança com hESCs, iPSCs tornaram-se uma ferramenta importante para o potencial de medicina regenerativa específica para cada paciente, evitando questões éticas associadas com hESCs. De modo a obter células adequadas para a aplicação clínica, iPSCs livre de transgenes precisam de ser gerado para evitar a reactivação do transgene, a expressão do gene alterada e diferenciação errada. Além disso, um método de reprogramação altamente eficiente e de baixo custo é necessário derivar iPSCs suficientes para fins terapêuticos. Tendo em conta esta necessidade, uma abordagem eficiente não-integração episomal plasmídeo é a melhor escolha para iPSC derivação. Actualmente, o tipo celular mais comum utilizado para fins de reprogramação são fibroblastos, o que requer o isolamento de biopsia de tecido, um invasive procedimento cirúrgico para o paciente. Portanto, sangue periférico humano representa o tecido mais acessível e menos invasivo para a geração da IPSC. Neste estudo, um protocolo eficaz e viral livre usando não integrando plasmídeos epissomais é relatado para a geração de iPSCs a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e sem separação de gradiente de densidade.

Neste estudo, um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs-virais livre por reprogramação da PBMNCs isoladas a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e comparação com a reprogramação da PBMNCs obtidos após separação por gradiente de densidade é relatado. A Figura 1A mostra uma representação esquemática de o protocolo detalhado. Após a descongelação, os PBMNCs isolado, que mostram uma forma típica arredondada, são expandidas em mei...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K visualizações.  European Academy Bozen/Bolzano (EURAC).  Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais. 