This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

The authors have nothing to disclose.

Mutlak Protein ölçümü bu biyobelirteç doğrulama ve sinyal iletim yolu modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir çok farklı aralık için gereklidir. Son zamanlarda, LC-SRM kullanılarak hedeflenen proteomik peptid standart hazırlama, HPLC, qqq-MS ve LC-SRM veri analizi de dahil olmak üzere çok sayıda teknolojilere iyileştirmeler yararlanmıştır. Sonuç olarak, bağışıklık karşı güçlü bir alternatif haline gelmiştir. Immünoanalizler ve / veya uygun değildir multiplekslemesi için, son derece...

Kütle spektrometrisi (MS) kullanmak proteomik deneyler hedefli olmayan (av tüfeği) veya hedeflenen yöntemleri ya kullanmak için dizayn edilebilir. Keşif proteomik genellikle geleneksel veri bağımlı toplama modunu kullanarak, ya da (örneğin, MS E, SWATH) son zamanlarda geliştirilen veri bağımsız tekniklerden birini 1,2 kullanarak, ya aşağıdan yukarıya av tüfeği MS dayanır. Shotgun proteomik yüksek verimli peptit tanımlama ve nispi ölçümü için güçlü bir araçtır, ama mutlak ölçümü için veya proteinlerin küçük tanımlanan setler (~ onlarca) hedefleme için genellikle uygun değildir. En sık hedeflenen proteomik için kullanılan MS yöntemi nedeniyle yüksek hassasiyet, hız ve dinamik aralık 3-5 tepkisini izleme (SRM) seçilir. SRM alternatifleri yüksek çözünürlüklü, tam MS tarama 6 yararlanır paralel reaksiyon izleme içerir. SRM genellikle nano-akış Rever kullanılarak gerçekleştirilirSED-fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi (nano RP-LC) nano-elektrosprey iyonizasyon bağlanmış cihaz üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (qqq-MS) takılmış bir (daha nano-ESI) iyon kaynağı. Tipik bir deneyde, örnek proteinler proteolitik olarak sindirilir ve elde edilen peptitler, kromatografik ayrıldı, desorbe ve iyonize edilebilir. Elde edilen öncül iyonları m / ilk kuadruple (Q1) tarafından filtre z ve çarpışma gazı ile çarpışarak tarafından ikinci kuadropol (q2) parçalanmış bulunmaktadır. Elde edilen fragman, iyonlarıdır m / z-süzüldü üçüncü dört kutuplu (Q3) ve bir dynode ile nicelendirildi. Her bir ön-madde ve fragman iyon çifti bir geçiş olarak ifade edilir ve her bir geçiş belirli bir süre (kalma süresi tipik olarak 2-50 msn) izlenir. LC-SRM sırasında geçişler önceden tanımlanmış bir liste üzerinden qqq-MS döngüleri (görev döngüsü genellikle ≤3 sn olan) ve her bir geçiş kromatogram üretilir. Alternatif strategProtein ölçümü için ler, tipik olarak bu nokta, blotlar, Western blotlar, ELISA antikor mikrodizileri, ters fazlı protein mikrodizilerinin, mikroakışkan bağışıklık dijital ELISA ve mikroküre bazlı bağışıklık 7 olarak immün kullanımı. En iyi immünodeneyler LC-ARM önemli ölçüde daha fazla duyarlı olabilir ve bağışıklık örnek hacmi LC-SRM 5 önemli ölçüde daha yüksek olabilir. Ancak, gelişmekte olan immünoanalizler pahalı olabilir ve / veya zaman alıcı ve elde edilen analizler hücrenin / doku lizis / homojenizasyon yöntemleri ile uyumsuz, çapraz reaksiyon ve / veya müdahale savunmasız olabilir ve / veya uygun olmayan 5.8 multiplekslemesi için. Bu sorunlardan bazıları antikor ve MS tabanlı teknikler birleştirilmesi ele alınabilir. Örneğin, hedef proteinleri önce proteoliz ve LC-SRM 9-12 immunoprecipitation kullanılarak zenginleştirilebilir. Seçenek olarak ise, SISCAPA tekniği peptid leve de proteolize sonra imüno kullanmaktadırl 13,14. Buna ek olarak stratejiler immunoenrichment için, yüksek bolluk proteinlerin bağışıklık sistemine analitleri 15,16 elüsyona alarak paraziti azaltarak LC-SRM duyarlılığını artırmak için istihdam edilebilir. MS-bazlı protein ölçümü etiket özgür ve izotop etiketleme (örneğin, metabolik etiketleme, etiketleme kimyasal ve ağır etiketli protein ve peptid iç standartlar) içine de göreli ve mutlak ölçümü ayrılır ve yapılabilir. Etiket serbest teknikler göreli protein ölçümü için yararlı olabilir, ancak kesin mutlak ölçümü için uygun değildir olabilir. Karşılaştırma olarak, etiketleme teknikleri numune hazırlama ve MS varyans ile ilişkili hata azaltmıştır, ve çoğu zaman görece protein miktarının 17 kullanılmaktadır. Örneğin, izotop etiketli proteome (SILAP) standartları, insan serumu 18 LC-ARM üzerinden olası biyolojik belirteçler nispi miktarını etkin kültürlenmiş insan hücre hattı kullanılarak hazırlandı. MS ile Doğru mutlak protein ölçümü saflaştırılmış, sayısal, izotopik olarak etiketlenmiş protein ya da peptid iç standartlar çivili-içine olması MS öncesinde biyolojik örnekler gerektirir. LC-SRM iş akışına ağır izotop etiketli dahili standartların dahil son derece tekrarlanabilir ve laboratuarlar 16,19 arasında transfer olduğu gösterilmiştir mutlak kantifikasyonunu sağlar. MS ile saf protein ölçümü için izotop etiketli dahili standartlar peptid standartları, katı faz sentezi 20, birleştirilmiş proteaz klivaj peptid standartları 21 oluşan proteinler, ve tam uzunluktaki protein standartlarını 22 kullanılarak hazırlandı bulunmaktadır. Hedef protein kovalent modifikasyon ve eksik numune hazırlama (yani eksik örnek parçalama ve homojenizasyon ve eksik protein solübilizasyon, denatürasyonu, alkilasyon ve proteoliz) doğru kantifikasyon sarsar. İç protein standartlar bu potansiyel sorunların en etkilenecek en az olasıdır, ancak genellikle hazırlamak için en zor bulunmaktadır. Alternatif bir amino- ve karboksi-terminal ana kuşatan kalıntılarını içerecek şekilde tasarlanan çok sayıda dahili peptid standartları kullanılarak her bir hedef protein analiz etmektir. Ne olursa olsun, iç standart türü kullanıldığında bunlar, bu katkılı halinde gereken biyolojik örnekler gibi erken bir noktada mümkün olduğu numune hazırlama sırasında. Ayrıca, birden çok örnek hazırlama teknikleri (örneğin, farklı bir denatürasyon koşulları) test edilmelidir. Birden dik deneysel teknikler (deneysel çapraz doğrulama) kullanımı 23-25 ​​zorluklar çoğu potansiyel kantifikasyon üstesinden gelmek için uygun bir stratejidir. Proteinlerin LC-SRM miktar geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir olan son derece esnek bir tekniktir. Özellikle, bu içindeki peptid ve protein biyolojik işaretleri incelemek için kullanılmıştırBöyle serum, çekirdek biyopsiler ve ince iğne aspiratları 5 klinik örnekler. LC-SRM ayrıca, botulinum nörotoksinlerinin 27 tespit etmek için sinyal yolları 5 içinde protein fosforilasyon dinamikleri ölçmek için ve protein konformasyonuna 28 değişiklikleri ölçmek için, protein kompleksleri 5,26 stokiyometri ölçmek için kullanılmıştır. Laboratuvarımız kemotaksis yolu simülasyonları gelişimini desteklemek için makrofaj kemotaksisini arabuluculuk sinyal proteinleri ölçmek için LC-SRM kullanıyor. protokol genel şeması (Şekil 1) kesin olmayan hedef peptidleri sıralaması ile başlar. Daha sonra, ham dış peptid standartları sentezlendi ve biyolojik numunelerin nitel analiz için LC-SRM tahlilleri geliştirmek için kullanılır. Biyolojik numune türetilen hedef peptid tespit edilirse, saflaştırılmış ağır etiketli dahili peptid standartları niceliksel LC-ARM hazırlanır. Bu protokol, ac için kullanılabilircurately biyolojik örneklerin çeşitli proteinleri ölçmek ve protein hedeflerinin çok çeşitli araştırmalar desteklemek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

sinyal iletim yollarının tahmini hesaplama modellerinin geliştirilmesi sistem biyolojisi 53 temel hedeflerinden biridir. Ne yazık ki, hatta yoğun çalışılan ve yüksek klinik öneme sahip olan sinyal yolları için, bu nicel tedirginlikler cevaben yolu davranışlarını tahmin etmek için genellikle hala mümkün değildir (örn bu MAPK / ERK yolu 54 için geçerlidir). Son zamanlarda, bir soruşturma yolunun 56 sinyal fare makrofaj kemotaksisini çalışmak için hedef...

Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Görüntüleme.  National Institutes of Health. This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.