This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

The authors have nothing to disclose.

절대 정량 단백질은 바이오 마커 확인 및 신호 전달 경로와 같은 생의학 모델링 애플리케이션 매우 다양한 필수적이다. 최근 LC-SRM을 사용하여 타겟 단백질 체학은 펩타이드 표준 준비, HPLC, QQQ-MS 및 LC-SRM 데이터 분석 등 다양한 기술에 개선의 혜택을했다. 결과적으로, 면역에 강력한 대안이되고있다. 면역 분석 및 / 또는 의무하지 다중화 매우 민감하고 높은 처리량이 될 수 있지만, 면역 세포 / 조?...

질량 분석기 (MS)를 사용하여 실험을 프로테옴 비 타겟 (산탄) 또는 타겟팅 방법을 사용하도록 설계 될 수있다. 디스커버리는 일반적 프로테오믹스 전통적인 데이터 의존적 획득 모드를 사용하여, 또는 (예를 들어, MS E, SWATH) 최근에 개발 된 데이터 독립 기술 중 하나를 사용하여 1,2- 어느 상향식 산탄 MS에 의존한다. 샷건 단백질 체학은 높은 처리량 펩타이드 식별 및 상대 정량을위한 강력한 도구이지만, 절대 정량 또는 단백질의 작은 정의 세트 (~ 수십) 대상에 대한 일반적으로 적합하지 않다. 가장 자주 사용되는 표적 단백질 체학 MS 방법이 높기 때문에 감도, 속도 및 동적 범위 3-5 반응 모니터링 (SRM)을 선택한다. SRM 대안 고해상도 풀 스캔 MS 6 활용 병렬 반응 모니터링을 포함한다. SRM은 대개 나노 유동 되돌리기를 사용하여 수행SED 상계 고속 액체 크로마토 그래피 (RP-나노 LC) 나노 - 전기 분사 이온화 결합 악기 삼중 사중 극 질량 분석 장치 (QQQ-MS)에 부착 (나노 ESI) 이온 소스. 전형적인 실험에서, 단백질 시료는 단백질 분 해적으로 분해하고, 생성 된 펩티드는 크로마토 그래피 분리하고, 탈착 및 이온화된다. 얻어진 전구체 이온 m / 제 중극 (Q1)에 의해 필터링 Z와 충돌 가스로 충돌에 의해 제 2 중극 (Q2)에서 조각난. 생성 된 단편 이온은 m / z 필터링 셋째 중극 (Q3) 및 다이 노드에 의해 정량화. 각각의 전구체 및 단편 이온 쌍 천이로 지칭되고, 각각의 전이는 지정된 기간 (전환 시간 전형적으로 2-50 밀리 초)에 대해 모니터링한다. LC-SRM 동안 전환을 통해 미리 정의 된 목록 QQQ-MS 사이클 (듀티 사이클은 통상적 ≤3 초이다), 각 전환의 크로마토 그램이 생성된다. 대체 전략에서단백질 정량 이거는 일반적으로 도트 말, 서양 오 점, ELISA를, 항체 마이크로 어레이, 역상 단백질 마이크로 어레이, 미세 유체 면역, 디지털 ELISA를, 그리고 마이크로 스피어 기반의 면역 7로 면역을 사용합니다. 최상의 면역은 LC-SRM보다 훨씬 더 민감 할 수 있으며, 면역 샘플 처리량 LC-SRM 5보다 상당히 높을 수있다. 그러나, 현상 면역 비용이 될 수 및 / 또는 시간 소모적, 생성 분석법은 세포 / 조직 용해 / 균질화 방법과 호환, 교차 반응성 및 / 또는 간섭에 취약 할 수 있으며, 및 / 또는 의무하지 5,8-를 멀티플렉싱. 이러한 문제의 일부는 항체와 MS 기반 기술을 결합함으로써 해결 될 수있다. 예를 들면, 표적 단백질 및 단백질 분해 전에 LC-9-12에 SRM을 사용하여 면역 침강 농축 될 수있다. 대안 적으로, 기술은 SISCAPA 펩티드 LEVE에서 단백질 분해에 후속 면역 침전을 채용L (13, 14). 또한 전략 immunoenrichment하는 높은 풍부 단백질은 분석 immunodepletion 15,16 coeluting하여 간섭을 감소함으로써 LC-SRM 감도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. MS 기반 단백질 정량은 라벨이없는 안정 동위 원소 라벨 (예를 들어, 신진 대사 라벨, 화학 라벨, 무거운 표지 단백질과 펩티드 내부 기준)으로도 상대 및 절대 정량으로 구분 될 수있다. 라벨이없는 기술은 상대적으로 단백질 정량에 유용 할 수 있지만, 정확한 절대 정량에 적합하다 할 수 있습니다. 이와 비교하여, 라벨링 기술 샘플 준비 및 MS 차이와 연관된 에러를 감소하고, 상대적으로 자주 단백질 정량화 (17)에 사용된다. 예를 들어, 안정 동위 원소 표지 프로테옴 (SILAP) 표준은 인간 혈청 (18)의 LC-SRM을 통해 잠재적 인 바이오 마커의 상대 정량을 활성화 배양 된 인간 세포 라인을 사용하여 제조. MS에 의해 정확한 절대 단백질 정량은 정제, 정량화, 동위 원소 표지 단백질 또는 펩티드 내부 표준 아군-로하는 것이 MS에 앞서 생체 시료이 필요합니다. LC-SRM 워크 플로우에 무거운 동위 원소 표지 내부 표준의 통합은 높은 재현성과 실험실 16, 19 사이의 양도로 나타났다 절대 정량 할 수 있습니다. MS에 의해 절대 단백질 정량 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준 펩타이드 표준 고체상 합성 (20) 연접 프로테아제 절단 펩티드 표준 21 이루어지는 단백질, 및 전장 단백질 22 표준을 사용하여 제조 포함한다. 대상 단백질 공유 수정 및 불완전한 샘플 준비 (즉, 불완전한 샘플 용해 및 균질화, 불완전 단백질의 가용화, 변성, 알킬화, 및 단백질 분해는) 정확한 정량을 훼손 할 수 있습니다. 내부 Protein 표준은 이러한 잠재적 인 문제의 대부분에 의해 영향을받을 가능성이있는 이상, 그러나 일반적으로 제조하기가 가장 어렵다. 대안은 아미노 - 및 카르복시 말단 측면 네이티브 잔기를 포함하도록 설계된 여러 펩티드 내부 표준을 사용하여 각각의 표적 단백질을 분석하는 것이다. 에 관계없이 내부 표준의 유형이 사용되는의, 그것은 아군-로한다 생물학적 시료 이른 시점에서 가능한 한 샘플 준비 중. 또한, 다수의 시료 전처리 기법 (예를 들어, 다른 변성 조건) 시험해야한다. 다수의 직교 실험 기술 (실험 교차 유효성 검사)의 사용은 23 ~ 25 도전 가장 가능성 정량을 극복하기위한 실행 가능한 전략이다. 단백질의 LC-SRM 정량은 광범위한 응용 분야에서 사용 된 매우 유연한 방법이다. 특히, 이는 내 펩티드 및 단백질 바이오 마커를 연구하는 데 사용 된혈청, 핵심 조직 검사, 미세 침 흡인 (5) 임상 샘플. LC-SRM은 또한, 보툴리눔 신경 독소 (27)를 검출하는 신호 전달 경로 (5) 내에 단백질 인산화 역학 정량화, 단백질 입체 구조 (28)의 변화를 정량화하기 위해, 단백질 복합체 5,26의 화학량 론을 측정하는 데 사용되어왔다. 본 연구실은 화성 경로 시뮬레이션의 개발을 지원하는 대 식세포 주 화성을 매개하는 신호 전달 단백질을 정량화하는 LC-SRM을 사용한다. 프로토콜의 전체 계획 (그림 1) 임시 목표 펩티드를 순위로 시작합니다. 그 후, 원유 외부 펩타이드 기준은 합성 및 생체 시료의 정성 분석을위한 LC-SRM 분석을 개발하는 데 사용됩니다. 생물학적 샘플 유래의 대상 펩티드가 검출되는 경우, 정제 된 무거운 표지 된 펩티드 내부 표준 정량적 LC-SRM을 위해 준비된다. 이 프로토콜은 AC에 사용될 수있다curately 생물학적 시료의 다양한 단백질 정량화, 단백질 표적의 다양한 연구를 지원한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

신호 전달 경로의 예측 계산 모델의 개발은 시스템 생물학 (53)의 기본적인 목적 중 하나이다. 불행히도, 심지어는 광범위하게 연구하고 높은 임상 적 의의를 가지고있다 신호 전달 경로를 들어, 정량적 섭동에 응답 통로 거동을 예측하는 것은 일반적으로 여전히 불가능하다 (예를 들면,이 MAPK / ERK 경로 (54)도 마찬가지이다). 최근 조사 경로 (56) 신호 마우스 대 식세?...

Watch this Scientific Journal Video about Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification at JoVE.com

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K 조회수.  National Institutes of Health. This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.