This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

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Proteina assoluta quantificazione è essenziale per una gamma molto diversificata di applicazioni biomediche, come la convalida biomarker e trasduzione del segnale modellazione via. Recentemente, la proteomica mirati utilizzando LC-SRM ha beneficiato di miglioramenti a numerose tecnologie, tra cui il peptide preparazione standard HPLC, QQQ-MS e LC-SRM analisi dei dati. Di conseguenza, è diventato un potente alternativa a immunodosaggi. Immunoassays possono essere estremamente sensibili e high-throughput, ma lo sviluppo...

Esperimenti di proteomica che utilizzano la spettrometria di massa (MS) possono essere progettati per utilizzare non mirati (shotgun) o metodi mirati. Proteomica Discovery genere si basa su fucile bottom-up MS, sia utilizzando una tradizionale modalità di acquisizione dati dipendente, oppure utilizzando una delle tecniche di dati indipendenti recentemente sviluppati (ad esempio, MS E, SWATH) 1,2. Proteomica Shotgun è un potente strumento per l&#39;identificazione peptide high-throughput e relativa quantificazione, ma è generalmente adatto per la quantificazione assoluta o per il targeting piccoli insiemi definiti (~ decine) di proteine. Il metodo MS più spesso utilizzato per proteomica mirati è selezionato monitoraggio reazione (SRM) a causa della sua elevata sensibilità, velocità e gamma dinamica 3-5. Alternative al SRM comprendono il monitoraggio reazione parallela, che sfrutta ad alta risoluzione, scansione MS pieno 6. SRM è di solito eseguita con un rever nano-flowsed fase cromatografia liquida ad alte prestazioni (nano-RP-LC) strumento accoppiato ad un ionizzazione nano-elettrospray (nano-ESI) sorgente di ioni collegato a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ-MS). In un esperimento tipico, proteine ​​del campione sono proteolytically digeriti, e peptidi risultanti vengono cromatograficamente separati, desorbiti e ionizzati. Gli ioni precursori risultanti sono m / z filtrato dal primo quadrupolo (Q1) e frammentata nel secondo quadrupolo (q2) da loro collisione con un gas di collisione. Gli ioni frammento risultante sono m / z filtrata nel terzo quadrupolo (Q3) e quantificata da un dinodi. Ogni coppia precursore e frammento di ioni viene indicato come una transizione, e ogni transizione viene monitorato per un determinato periodo di tempo (il tempo di sosta, in genere 2-50 msec). Durante LC-SRM, i cicli QQQ-MS tramite un elenco predefinito di transizioni (duty cycle è tipicamente ≤3 sec), e un cromatogramma di ogni transizione è prodotto. Strateg Alternativei per le proteine ​​quantificazione utilizzano in genere saggi immunologici, come macchie di punti, macchie occidentali, ELISA, microarrays dell&#39;anticorpo, di microarrays della proteina di fase inversa, immunodosaggi microfluidica, ELISA digitali e immunologici basati microsfere-7. I migliori immunodosaggi possono essere significativamente più sensibile LC-SRM, e la produttività del campione di immunodosaggi possono essere significativamente superiore a quello di LC-SRM 5. Tuttavia, immunodosaggi sviluppo possono essere costosi e / o di tempo, e le analisi risultanti possono essere vulnerabile a cross-reattività e / o interferenze, compatibile con la cellula / tessuto lisi / metodi di omogeneizzazione, e / o non suscettibili di multiplexing 5,8. Alcuni di questi problemi possono essere affrontati con l&#39;accoppiamento di tecniche anticorpo-e basate su MS. Per esempio, le proteine ​​bersaglio possono essere arricchiti con immunoprecipitazione prima proteolisi e LC-SRM 9-12. In alternativa, la tecnica SISCAPA impiega immunoprecipitazione successiva alla proteolisi al leve peptidel 13,14. Oltre a immunoenrichment strategie, immunodeplezione di proteine ​​elevate abbondanza può essere impiegato per aumentare la sensibilità LC-SRM riducendo interferenze da coeluiscono analiti 15,16. Proteina quantificazione basata su MS può essere diviso in quantificazione relativa e assoluta, e anche in etichettatura isotopo stabile e priva di etichetta (ad esempio, in materia di etichettatura del metabolismo, l&#39;etichettatura chimica, e proteine ​​pesante marcati e peptide standard interni). Tecniche senza etichetta può essere utile per la proteina relativa quantificazione, ma non sono adatti per un accurato quantificazione assoluta. In confronto, le tecniche di etichettatura hanno ridotto errore associato con la preparazione del campione e MS varianza, e sono spesso utilizzati per la proteina relativa quantificazione 17. Ad esempio, gli standard degli isotopi stabili proteoma marcati (SILAP) preparati con una linea di cellule umane in coltura permesso quantificazione relativa dei potenziali biomarcatori tramite LC-SRM di siero umano 18. Accurate proteina quantificazione assoluta da MS è necessario che le norme interne purificato, quantificato, proteine ​​o peptidi isotopi marcati venire addizionate-in campioni biologici prima della SM. L&#39;incorporazione di isotopo pesante standard interni marcati in un flusso di lavoro LC-SRM consente una quantificazione assoluta che ha dimostrato di essere altamente riproducibile e trasferibili tra i laboratori 16,19. Isotopo stabile etichettati standard interni per le proteine ​​quantificazione assoluta da MS sono gli standard di peptide preparati con solida sintesi in fase 20, proteine ​​composte da concatenati standard peptide proteasi cleavable 21, e full-length standard proteina 22. Obiettivo modifica proteine ​​covalente e preparazione dei campioni incompleti (vale a dire, la lisi incompleta del campione e l&#39;omogeneizzazione, e incompleta delle proteine ​​solubilizzazione, denaturazione, alchilazione e proteolisi) può minare la quantificazione accurata. P internonorme rotein sono i meno probabilità di essere colpiti dalla maggior parte di questi potenziali problemi, ma di solito sono le più difficili da preparare. Un&#39;alternativa è quella di analizzare ogni proteina bersaglio utilizzando più standard peptide interni che sono progettati per includere i residui di nativi di accompagnamento amino e carbossi-terminale. Indipendentemente da quale è impiegato il tipo di standard interno, occorre spillo-nei campioni biologici fin dalle prime punto durante la preparazione del campione possibile. Inoltre, le tecniche di preparazione dei campioni multipli (ad esempio, diverse condizioni di denaturazione) devono essere testati. L&#39;uso di molteplici tecniche sperimentali ortogonali (cross-validazione sperimentale) è una strategia praticabile per superare più potenziale quantificazione sfide 23-25. LC-SRM quantificazione delle proteine ​​è una tecnica estremamente flessibile che è stato utilizzato in un&#39;ampia varietà di applicazioni. In particolare, è stato utilizzato per studiare peptidi e proteine ​​biomarker all&#39;internocampioni clinici quali siero, biopsie, e aspirati con ago sottile 5. LC-SRM è stato utilizzato anche per misurare la stechiometria di complessi proteici 5,26, per rilevare neurotossine botuliniche 27, per quantificare la dinamica delle proteine ​​di fosforilazione in vie di segnalazione 5, e di quantificare i cambiamenti di conformazione proteica 28. Il nostro laboratorio sta usando LC-SRM per quantificare le proteine ​​di segnalazione che mediano la chemiotassi macrofagi per sostenere lo sviluppo di simulazioni chemiotassi pathway. Lo schema generale del protocollo (Figura 1) inizia con classifica i timidi peptidi di destinazione. Successivamente, gli standard di peptide esterni grezzi vengono sintetizzati e utilizzati per sviluppare test LC-SRM per le analisi qualitative dei campioni biologici. Se viene rilevato il biologico campione di derivazione bersaglio peptide, peptide norme interne pesanti marcato purificate sono preparati per quantitativa LC-SRM. Questo protocollo può essere utilizzato per acaccurata- quantificare proteine ​​da un&#39;ampia varietà di campioni biologici, e di agevolare le indagini di un&#39;ampia varietà di proteine ​​target.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

Lo sviluppo di modelli computazionali predittivi di trasduzione del segnale è uno degli obiettivi fondamentali della biologia dei sistemi 53. Purtroppo, anche per vie di segnalazione che sono stati studiati estesamente e hanno un alto significato clinico, non è ancora generalmente possibile predire quantitativamente il comportamento percorso in risposta a perturbazioni (ad esempio, questo è vero per la MAPK / ERK 54). Recentemente, una ricerca impiegato proteomica mirati, trascrittomica...

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Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  National Institutes of Health. This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.