This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

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Quantificação absoluta de proteína é essencial para uma gama muito diversificada de aplicações biomédicas tais como validação de biomarcadores e modelagem via de transdução de sinal. Recentemente, proteômica direcionados utilizando LC-SRM beneficiou de melhorias para várias tecnologias, incluindo a preparação de péptidos padrão, HPLC, qq-MS, e análise de dados LC-SRM. Por conseguinte, tornou-se uma alternativa poderosa para imunoensaios. Imunoensaios podem ser extremamente sensíveis e de alto rendimen...

Experimentos de proteômica que usam a espectrometria de massa (MS) pode ser projetado para usar um não-alvo (espingarda) ou métodos direcionados. Proteómica descoberta baseia-se na espingarda geralmente de baixo para cima MS, usando um modo de aquisição dependente dos dados tradicional, ou utilizando uma das técnicas independentes de dados desenvolvidas recentemente (por exemplo, MS E, SWATH) 1,2. Proteómica espingarda é uma ferramenta poderosa para a identificação de alto rendimento péptido e quantificação relativa, mas é geralmente inadequada para a quantificação absoluta ou para o direccionamento pequenos conjuntos, definidos ~ (RTE) de proteínas. O método MS mais frequentemente usado para proteômica alvejados é selecionado monitoramento de reação (SRM) por causa de sua alta sensibilidade, velocidade e alcance dinâmico 3-5. Alternativas a SRM incluem monitoramento de reação paralela, que tira proveito de alta resolução, completa varredura MS 6. SRM é geralmente realizada utilizando um fluxo de rever nano-sed cromatografia em fase líquida de alta eficiência (nano-RP-LC) acoplado a um instrumento de ionização por electropulverização de nano-(nano-ESI) ligado a fonte de iões de um espectrómetro de massa triplo quadrupolo (QQQ-MS). Numa experiência típica, as proteínas da amostra são proteoliticamente digeridos, e os peptídeos resultantes foram separados cromatograficamente, dessorvido, e ionizado. Os iões resultantes são precursoras m / z filtrada por o primeiro quadrupolo (Q1) e fragmentada no segundo quadrupolo (Q2) por colidir com um gás de colisão. Os iões resultantes são fragmento m / no terceiro quadrupolo (Q3) e quantificada por um dínodo filtrou-z. Cada par de iões fragmento precursor e é referido como uma transição, e cada transição é monitorizado por um período determinado de tempo (tempo de espera, tipicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, os ciclos QQQ-MS por meio de uma lista pré-definida de transição (o ciclo de serviço é tipicamente ≤3 seg), e um cromatograma de cada transição é produzido. Strateg alternativas para a quantificação de proteínas normalmente utilizam imunoensaios tais como borrões ponto, manchas de Western, ELISAs, microarrays de anticorpos, microarrays de proteínas de fase reversa, imunoensaios microfluídicos, ELISAs digitais e imunoensaios à base de microesferas 7. Os melhores imunoensaios podem ser significativamente mais sensíveis do que os LC-SRM, e o manuseamento das amostras de imunoensaios podem ser significativamente mais elevada do que a da LC-5 SRM. No entanto, imunoensaios em desenvolvimento pode ser caro e / ou demorado, e os ensaios resultantes podem estar vulneráveis ​​a reactividade cruzada e / ou interferências, incompatível com células / tecido de lise / métodos de homogeneização, e / ou não passíveis de multiplexagem 5,8. Algumas dessas questões podem ser abordadas por acoplamento técnicas anticorpo-e baseado no MS. Por exemplo, as proteínas alvo podem ser enriquecidas utilizando imunoprecipitação prévia à proteólise e LC-SRM 9-12. Alternativamente, a técnica emprega SISCAPA imunoprecipitação subsequente à proteólise no leve peptídeol 13,14. Além immunoenrichment estratégias, imunodepleção de proteínas de alta abundância pode ser empregue para aumentar a sensibilidade de LC-SRM, reduzindo a interferência por coeluting analitos 15,16. Quantificação de proteína baseada em MS pode ser dividido em quantificação relativa e absoluta, e também para rotulagem isótopo estável e livre de marcador (por exemplo, a etiquetagem metabólica, marcação química, e pesada da proteína marcada com padrões internos e peptídicos). Técnicas livre de marcador pode ser útil para a quantificação relativa de proteína, mas não são adequados para a quantificação exacta absoluta. Por comparação, técnicas de marcação já reduzida de erro associado com a preparação da amostra e da variância MS, e são muitas vezes utilizados para a quantificação relativa de proteína 17. Por exemplo, os padrões de isótopos estáveis ​​proteoma marcado (SILAP) preparado utilizando uma linha de células humanas de cultura permitiu a quantificação relativa de biomarcadores potenciais através de LC-SRM de soro humano 18. Accurate quantificação absoluta de proteína por MS requer que as normas internas purificada, quantificado, proteínas isotopicamente marcada ou peptídeo ser cravado-em amostras biológicas antes de MS. A incorporação de padrões internos marcados com isótopos pesados ​​em um fluxo de trabalho LC-SRM permite a quantificação absoluta de que foi mostrado ser altamente reprodutível e transferível entre laboratórios 16,19. Rotulados padrões internos de isótopos estáveis ​​para a quantificação absoluta de proteína por MS incluem padrões de peptídeos preparados usando a síntese em fase sólida 20, proteínas compostas de padrões de peptídeos protease clivável concatenadas 21, e padrões de proteína de comprimento total 22. Alvo modificação covalente de proteínas e preparação de amostras incompletas (por exemplo, a lise da amostra incompleta e homogeneização, e solubilização de proteínas incompletas, a desnaturação, a alquilação, e a proteólise) pode prejudicar a quantificação precisa. P Internonormas rotein são os menos susceptíveis de serem afectadas pela maioria desses problemas potenciais, mas eles geralmente são os mais difíceis de preparar. Uma alternativa é a de analisar cada proteína alvo utilizando vários padrões peptídicos internos que são concebidos para incluir os resíduos de flanqueamento nativos amino e carboxi-terminais. Independentemente de qual o tipo de padrão interno é utilizado, ele deve ser cravado-os em amostras biológicas, o mais a altura durante a preparação da amostra quanto possível. Além disso, técnicas de preparação de amostras múltiplas (por exemplo, as diferentes condições de desnaturação) deve ser testado. O uso de várias técnicas experimentais ortogonais (de validação cruzada experimental) é uma estratégia viável para a superação de mais quantificação potencial desafia 23-25. LC-SRM quantificação de proteínas é uma técnica altamente flexível, que foi utilizado numa ampla variedade de aplicações. Notavelmente, tem sido utilizada para estudar peptídicos e proteicos biomarcadores dentroamostras clínicas, tais como soro, biópsias, e punção aspirativa por agulha fina 5. LC-SRM também tem sido utilizado para medir a estequiometria de complexos de proteínas 5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas 27, para quantificar dinâmica de fosforilação de proteína dentro de vias de sinalização 5, e para quantificar as alterações na conformação da proteína 28. Nosso laboratório está usando LC-SRM para quantificar as proteínas sinalizadoras que medeiam a quimiotaxia de macrófagos para apoiar o desenvolvimento de simulações via quimiotaxia. O esquema geral do protocolo (Figura 1) começa com o ranking dos peptídeos alvo provisórias. Subsequentemente, padrões externos de péptidos em bruto são sintetizados e utilizados para desenvolver testes de LC-SRM para análises qualitativas de amostras biológicas. Se o péptido alvo biológico derivado de amostra é detectada, padrões peptídicos internos pesados ​​marcado purificados são preparados por LC-quantitativa SRM. Este protocolo pode ser utilizado para accurately quantificar proteínas a partir de uma grande variedade de amostras biológicas, e para apoiar as investigações de uma grande variedade de alvos de proteína.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture EDTA, 500mM, pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto T4 disposable counting chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, LC-MS grade, ampules</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-10X1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>0640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M, pH 7.2</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3028-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Magic C18AQ, 5&#181;m, 200&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM5/61200/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Halo ES-C18, 2.7&#181;m, 160&#8491;, loose media</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td>PM3/93100/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC coated silica capillary, 50&#181;m id</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>200-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone</td>
			<td>SUN SRI</td>
			<td>500-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase, from Photinus pyralis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9506-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516481-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>9586-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SPD111V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube decapper for Micronic tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1765-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

O desenvolvimento de modelos computacionais preditivos de vias de transdução de sinal é um dos objectivos fundamentais da Biologia de Sistemas 53. Infelizmente, mesmo para as vias de sinalização que têm sido estudados extensivamente e têm um elevado significado clínico, que ainda não é geralmente possível prever o comportamento quantitativamente via em resposta a perturbações (por exemplo, isto é verdadeiro para a MAPK / ERK 54). Recentemente, uma investigação empregada pro...

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Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K visualizações.  National Institutes of Health. This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.