0315741 : 우리는 본 연구는 교육 및 연구 (BMBF) 프로젝트 가상 간의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다 그림 1의 생성에서의 지원 지아 리 리우에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 모든 세포가 기본 또는 보조 간 종양 부분 간 절제술 후 남아 절제된 비 종 양성 인간의 간 조직에서 분리 하였다. Universitätsmedizin 베를린 - 환자의 동의는 샤리 테의 윤리적 지침에 따라 얻었다. 재료 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 분리 과정 중에 박테리아 오염을 방지하기 위해 미리 모든 장비 및 재료 멸균. </li><li> 갓 제조 소화 용액 제외 간 조직 샘플 간세포 비 실질 간세포의 단리 공정 및 표 1 및 2에 따른 차 인간 간세포의 배양 관류에 필요한 용액을 준비 사용 전에. 모든 솔루션은 4 ° C에 저장할 수 있습니다 준비 후 4 주 이내에 사용할 것을 권장합니다. </li><li> 소독하다0.22 μm의 병 상단 필터를 사용하여 모든 솔루션을 제공합니다. </li></ol> 관류 장비 2. 준비 <ol><li> 도 1a에 도시 된 바와 같이 간 조직 샘플의 관류 및 소화 장치를 설정한다. </li><li> 관류 및 소화하는 동안 최적의 콜라게나 P 활동을 보장하기 위해 39 ° C의 물 목욕 온도를 조정합니다. </li></ol> 간 조직 샘플 3. 관류 및 소화 (1.5 시간) <ol><li> 절제 간 조직에서 그대로 Glisson의 캡슐과 조직 샘플을 선택합니다. 조직 샘플을 절단하는 경우, 좋은 가시 용기와 작은 절단면을 수득보십시오. 수송 및 관류 때까지 얼음에 간 조직 샘플을 처리하여 따뜻한 허혈 시간을 피하십시오. </li><li> 무균 조건 하에서 조직의 무게를 가지고 층류 공기 흐름에 페트리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 재로부터 무균 압축과 조직 샘플의 표면을 청소피를 maining 모든 정맥이 투과되었는지 확인하기 위해 1 배 관류-솔루션 I을 사용하여 정맥 세트를 세척합니다. </li><li> 일부 큰 혈관의 캐 뉼러의 올리브를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용합니다. 간 조직 샘플의 크기 및 표면의 혈관의 수에 따라 3 내지 8 뉼러 설정 캐뉼라를 사용한다. 관류를 테스트하고 누출을 확인합니다. 조직 접착제 맑은 1 배 관류-솔루션 I를, 누출 모든 닫기 혈관,. </li><li> 그 구멍 필터 디스크 (그림 1A)의 흡인 여과기로 유관 간 조직 샘플을 놓습니다. </li><li> 7.5 ㎖ / 분으로 이용 캐 뉼러의 수 및 간 조직의 저항에 따라 14.6 ml / 분의 연동 펌프의 유량을 설정한다. 현재 그러나 느린 관류가되도록 유량 매번 조정한다. 전혈은 플러시하지만 20 분 이상까지 조직을 관류. 좋은 perfusi와 지역에 밝은 될 조직을 관찰에. 주 : 일부 경우에, 플라스틱 클램프와 캐 뉼러 중 하나를 고정 할 필요가있을 수도 있고, 관류 최적화 간 캡슐 대하여 주걱으로 부드럽게 눌러 영역의 내부 압력을 증가시키기 위해. 밝은 갈색 컬러에 밝은 노란색에 전체 색상 변경은 좋은 관류를 나타냅니다. </li><li> 콜라게나 제 P (표 1)를 포함 소화-솔루션으로 관류 액을 변경합니다. </li><li> 소화 단계의 설치 (그림 1A)를 재 배열. 따라서 최대 15 분 동안 그림 1B에 따라 소화 - 솔루션의 순환 흐름을 수행합니다. 주 : 간 조직 샘플을 충분히 분해 할 때 즉시 재관류 중단하는 것이 중요하다. 좋은 소화가 주걱으로 밀어 경우, 캡슐 변형의 유지 보수에 의해 평가로 조직 탄성의 흔적을 보여줍니다 때, 관찰 할 수있다. </li></ol> 간세포 4. 단열 (1 시간) <ol><li> 티오프 연동 펌프를 항아리와 유리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 차가운 얼음 스톱 솔루션 (표 1)과 조직 샘플의 외부를 헹군다. 간 조직 샘플에서 캐 뉼러를 제거합니다. 캐뉼라가 부착 된 영역의 중앙에 절개하여 간 조직 샘플을 열 메스를 사용한다. Glisson&#39;s 캡슐은 그대로 유지 치료를 유지합니다. </li><li> 조직 샘플의 내부를 씻어 후 차가운 얼음 스톱 솔루션을 통해 전체 조직 샘플을 커버합니다. 조직에서 세포를 분리 부드럽게 조직을 흔들어. </li><li> 세포 현탁액을 수집하고 50 ML의 플라스틱 튜브로 시선 깔때기 (가제 압축 늘어서 플라스틱 깔때기)를 통해 필터링합니다. 500 ml의 최종 부피가 소모 될 때까지 간 조직 샘플 더 스톱 용액을 첨가. </li><li> 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 나중에 비 실질 세포 분리를위한 뜨는을 수집합니다. PBS (그림 2와 세포 펠렛을 씻으십시오A). </li><li> 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 간세포 배양 배지에서 펠렛 (표 2, 그림 2B)를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 트리 판 블루 염색을 이용하여 생성 된 세포 현탁액 중의 세포 수 및 생존력을 결정한다. 노이 바 우어 계산 실에서 산 자와 죽은 세포를 계산합니다. 아래의 공식을 사용 PHH의 세포 수, 생존 능력 및 수율을 계산합니다. 세포 현탁액 (ML)의 수율 (세포 계수) = 카운트 셀 X 희석 인자 X 부피는 10,000 X 수율 (간세포 / (g 간 조직 샘플)) = (세포 현탁액 (ML)의 수율 (간세포 / (ML 매체)) × 양) / (간 조직 샘플의 중량 (g)) 생존율 (%) = 100 % × (생균 수) / (전체 세포 수) </li></ol> 간세포 5. 정제 (1 시간) 참고 : 생존 경우 정제 단계가 좋습니다70 %보다 낮다. <ol><li> 얼음의 모든 단계를 수행합니다. 5 ㎖ 밀도 구배 용액의 밀도 구배 원심 분리는 15 mL의 PBS을 혼합하여 25 %의 농도 구배를 준비한다. </li><li> 양 층의 명확한 분리 (도 2C)을 확보하기 위해 25 %의 농도 구배 층의 상부에 조심스럽게 천천히 간세포 풍부한 세포 현탁액에서 총 50 미오 셀의 최대 넣는다. 1250 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2D)에서 원심 분리기 원심 분리기로 조심스럽게 튜브를 넣습니다. </li><li> 나머지 세포 현탁액 및 계면에있는 죽은 세포를 대기음. 지방 함량 하나에 따라 또한 밀도 구배-솔루션을 대기음 수 있습니다. 주 : PHH 낮은 지질 함량은 치밀한 펠릿 및 밀도 구배가 완전히 흡입 수를 형성한다. 높은 지질 함량 PHH 펠릿 위 밀도 구배 용액에 남아있을 수보다 확산 펠릿 생세포 많이 형성한다. </li><li>50 XG, 5 분, 4 ° C에서 다시 PBS와 원심 분리기와 간세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 펠릿 수영장, PBS로 다시 씻어 ​​간세포 배양 배지에서 정제 PHH 다시 일시 중지합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다. </li></ol> 간세포의 6 재배 <ol><li> 예 래트 꼬리 콜라겐 (콜라겐 타입 I)를 들면, 세포 외 기질로 코팅함으로써 PHH의 시딩을위한 세포 배양 접시를 준비한다. 라잔 등에 의해 설립 된 프로토콜에 따라 쥐의 꼬리 콜라겐을 준비합니다. (17) </li><li> 쥐의 꼬리 콜라겐 원액 1을 희석 : (200)을 PBS에. 표면 전체가 포함 된 배양 접시에 전송 100 μL / ㎠ 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션, 돌보는. 실온에서 20 분 동안 세포 배양 플라스틱 인큐베이션. 나머지 쥐의 꼬리 콜라겐 솔루션을 대기음. </li><li> 문화 dishe에 간세포 배양 배지에서 종자 15 × 104 간세포 / cm 2쥐의 꼬리 콜라겐으로 코팅 s의. 적어도 4 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 세포를 배양. 4 시간 후, 간세포 부착하고 배지를 변경할 수있다. </li><li> 실험 설정에 따라 조사를 수행합니다. 48 시간의 배양 시간은 세포 분리 과정에서 복구 할 것을 권장한다. </li></ol> 비 실질 간 세포의 7 격리 (1.5 시간) <ol><li> 원심 분리기 (72) XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 4.5 및 4.6) 남은 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층 액을 수영장과 두 개의 세포 펠렛을 얻기 위해 두 번을 원심 분리기 : 300 XG, 5 분, HSC, LEC 부분적 KC 650 XG, 7 분, 나머지 KC의 침강 4 ° C의 침강 4 ° C를. </li><li> 풀 펠릿 모두 HBSS에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. 25 % 및 밀도 구배 centrif 믹싱 밀도 구배 용액 및 PBS에 의해 50 %의 농도 구배를 준비ugation (25 % 밀도 구배 용액 5 ml의 밀도 구배 용액을 15 ml의 PBS 50 % 밀도 구배 용액을 10 ml의 밀도 구배 용액 10 ㎖ PBS,도 2 참조). 50 % 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 25 % 밀도 구배 용액을 놓는다. </li><li> 양 층의 명확한 분리가 달성되는 방식으로 25 %의 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 천천히 NPC 현탁액을 넣어. </li><li> 원심 분리기 1800 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2.2)의 농도 구배에 세포 현탁액. </li><li> 대기음 사균과 최상층으로부터 세포 파편. 전인대는 25 %와 50 % 밀도 구배 층 (그림 2) 사이의 계면에 있습니다. HBSS와 원심 분리기와 상기 이중 원심 분리 단계 적용 세포 현탁액을 씻어 NPC를 수집한다 (단계 7.2.). </li></ol> 쿠퍼 세포의 분리 제 (준수분리 단계) (1 시간) <ol><li> 단계 4.6에 기재된 바와 같이 NPC 분획의 KC하는 세포 수를 수행한다. (현탁액 KC의 모양은 그림 (b) 참조). 원심 분리기 상기 이중 원심 분리 단계 (단계 7.2) 및 NPC 쿠퍼의 셀 시드 매체 (표 2)를 다시 일시 중지와 NPC의 일부. </li><li> 5 × 5 KC / ㎠의 밀도로 플라스틱 세포 배양 용기에 KC 함유 분획을 시드. 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 20 분 동안 KC 문화를 품어, 5 % CO 2. 기본 KC 단시간 (도 23) 내에서 세포 배양 플라스틱에 부착. </li><li> 주로 LEC와 HSC로 구성하지 부착 된 NPC를 포함하는 상층 액을 수집합니다. LEC 이후 분리를위한 상층 액을 풀 (섹션 9 참조) HSC는 (10 항 참조). HBSS로 부착 KC를 세척하고 37 ℃, 5 % CO에서 쿠퍼 세포 배양 배지 (표 2)에서 그들을 육성가습 인큐베이터에서 2. </li></ol> 내피 세포의 9 분리 (1.5 시간) <ol><li> 원심 분리기 300 XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 8.5.). PBS와 펠렛을 씻으십시오. 300 × g으로 5 분, 39 ° C를 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 세포를 다시 정지 단계 4.6에 기재된 바와 같이 나머지 모든 세포에 대한 세포 수를 수행 한 후 원심 분리. </li><li> immunolabeling의 MACS-KIT에서 솔루션을 차단 20 μL와 CD31 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 1 ml의 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 1 × 10 7 미오 셀을 다시 중단하고 4에서 15 분 동안 생성 된 현탁액을 품어 ° C 온도 (그림 2.4). </li><li> 자화 활성 세포 선별 시스템 MACS (그림 2.5)에 대한 제조자의 프로토콜에 설명 된대로 HSC에서 별도의 LEC. 자기 유지 CD31 양성 LEC을 용출 및 성상 C에서 그들을 중지엘 / 내피 세포 배양 배지 (표 2). </li><li> 단계 4.6에 설명 된대로 LEC에 대한 계산 셀을 수행합니다. 1.25 × 105 세포를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에서 / ㎠의 밀도 시드 LEC (단계 6.1 참조). 가습 인큐베이터에서 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포 배양. </li></ol> 성상 세포 (10) 분리 (0.5 시간) <ol><li> 레이블이없는 HSC는 MACS 과정에서 분리 컬럼을 전달합니다. HSC 분율 (그림 2.5 단계 9.5 참조)를 수집합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다. </li><li> 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에 5 × 104 세포 / ㎠의 밀도로 시드 HSC는 성상 세포 / 내피 세포 배양 배지 (표 2)에서 (단계 6.1 참조), 37 ° C, 5 %을 육성 가습 인큐베이터에서 CO 2. </li></ol><img alt= &quot;표 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot;/&gt; 표 1 : 관류 및 격리 솔루션입니다. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> 표 2 : 문화 절연 매체.

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	<li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells.">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , (2014).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells.">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes,+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity,+cell+signaling+and+ADME.">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man:+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo.">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li><li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research.">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li><li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity.">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li><li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity.">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li><li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing.">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li><li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G., Santin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Holy+Grail+of+Hepatocyte+Culturing+and+Therapeutic+Use.">The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use.</a> Strategies in Regenerative Medicine. , 1-38 (2009).</li><li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes,+Kupffer+cells,+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan.">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li><li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver.">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li><li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells.">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li><li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver:+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture.">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li><li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo.">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver.">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li><li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells.">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).</li><li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody.">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li><li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation,+culture+and+characterization.">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis:+results+of+a+2-year+experience.">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver.">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

게시 된 프로토콜은 동시에 인간의 간 조직의 동일한 샘플에서 높은 품질과 순도, 순수 PHH 및 NPC, 즉 KC, HSC와 LEC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 간세포 아이솔레이션 다루는 문헌의 대부분은 인간 조직 수행 그 세포 집단 18-20 및 분리 절차들 중 하나 (21) (당국이 외. 검토) 희소 커버. 인간의 간을 동물 조직 (예를 들면, 쥐의 간) 설립 방법의 적응력 동물과 인간?...

인간의 간 조직은 매우 복잡하고 여러 개의 셀 엔티티 실질 세포 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성된다. 실질 간 세포는 간세포와 담관을 포함한다. 간세포는 전체 간세포의 60 ~ 70 %를 차지하며 대사성 간 기능의 대부분을 차지하고, 예를 들면, 담즙산 및 인자 합성, 생물 전환 및 에너지 대사 2,3- 보완. 작은 NPC 분획 총 간세포 30-40 %로 구성한다. NPC는 서로 다른 세포 집단, 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)를 포함한다. 이 이종의 세포 분획 간의 생리적 과정에서 중요한 역할을한다. 또한, NPC는 예를 들어, 약물 - 유도 간 손상 (딜리)뿐만 아니라 만성 간 손상, 간경화 4 급성 간 손상을 중재에 참여한다. 최근, H잃어버린 간 세포는 간 질환에 점점 더 중요한 연구 및 약물 검사, 약물 개발 및 새로운 생화학 적 경로의 식별 개발되고있다. 시험관 테스트를 위해 PHH의 단일 재배는 여전히 &quot;황금 표준&quot;으로 간주됩니다 5. 현재 동형 간 모델의 주요 제한은 수일 내에 4 탈분화 및 간세포의 기능의 상실이다. 3 차원 (3D) 배양 기술의 확립이 제한 4,6- 보상 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 현대 3D 배양 기술 액션 7 모두 간독성 모드를 표시 할 수 없다. 기존의 체외 모델에서 누락 NPC 인구는 생체 내 상황이 차이에 대한 가능한 이유로 설명합니다. 또한 pathophy의 다른 간세포 집단의 세포 간 통신 생리적 항상성에서 중심 역할을하는 것으로 밝혀졌다siologic 8을 처리합니다. 따라서 과학주의는 NPC 및 세포 - 세포 상호 작용에 점점 더 초점을 맞추고있다. 공동 문화 및 조직 설계 시스템에서 그들의 목적 사용 가능한 생체 내 상황에 가까운 있습니다 체외 간 모델 8,9의 높은 수요에 대한 해결책이 될 수 있습니다. 현재의 주요 과제는 PHH 및 NPC의 명확하게 정의 부분을 포함하는 표준화 된 인간 간 공동 배양 모델의 개발이다. 결과적으로, 매우 이종의 간 세포 분리 기술이 필요하고 그 순수한 세포 집단을 얻기 위해 최적화 될 필요가있다. PHH 격리를위한 표준화 된 프로토콜 10 존재하지만, 인간의 NPC의 표준화 분리는 아직 개발 중입니다. 대부분의 출판 NPC 분리 프로토콜은 비 - 인간 세포 11,12 실험에 기초한다. 불과 몇 간행물은 인간의 NPC의 분리 과정을 설명하고 대부분은 커버단일 세포의 분리 방법은 11 ~ 16을 입력합니다. 세포 분리 무력화 된 전지의 가장 중요한 특성은 크기, 밀도, 부착 거동 및 표면 단백질을 발현한다. 이러한 특성을 바탕으로 우리는 실험 생물학 및 의학 1 년 이전에 출판 된 PHH, KC, LEC와 HSC를 분리하는 간단한 프로토콜을 개발했다. 때문에이 기술의 광범위한 관심이 문서의 목적은보다 용이하게 재생 기술을 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 또한 수율과 생존의 평가뿐만 아니라 특정 immunostainings를 사용하여 식별 및 순도 평가를위한 품질 관리 방법을 포함한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">General Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PIPETBOY</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2-incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamin Air</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Varifuge 3.0R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urine Beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2041101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">perfusor syringe 50 ml</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>12F0482022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bottle Top Filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1058787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>533047</td>
			<td>24 well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">serological pipettes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357525, 357551, 357543</td>
			<td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td>
			<td>100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isolation Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">water bath</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peristaltic pump</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circulation thermostat</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Schott</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fine scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B&#252;chner funnel</td>
			<td>Haldenwanger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silicone tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cannulae with olive tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>12068760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>Optic Labor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell lifter</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Drape</td>
			<td>Charit&#233; Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td>A2013027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">compress</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>40013331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile surgical gloves</td>
			<td>Gammex PF</td>
			<td>1203441104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue glue</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13349524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll Separating Solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L6145</td>
			<td>Density 1.124 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s BSS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H00911-3938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15 - 002</td>
			<td>without Mg/Ca</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampuwa</td>
			<td>Plastipur&#160;</td>
			<td>13CKP151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Pufferan&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>133196836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Media Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-005</td>
			<td>Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1135546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15 - 039</td>
			<td>without L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1137663</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">William&#8217;s E&#160;&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>32551-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fortecortin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49367</td>
			<td>8 mg/2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human-Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td>100 I.E./ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment for Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD 68</td>
			<td>R&#38;D Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK 19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>D2309</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>K2105</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFAP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23.472-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse IgG1-PE</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>C0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>L0412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1104509006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 4%</td>
			<td>Herbeta Arzneimittel</td>
			<td>200-001-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells

실질 간세포 옆에, 간은 비 실질 세포 (NPC) 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)로 구성되어 있습니다. 차 인간 간세포 (PHH)의 두 차원 (2D) 문화는 여전히 약물 대사 및 간독성의 시험관 테스트를위한 &quot;골드 표준&quot;으로 간주됩니다. 그것은 PHH의 2 차원 단일 문화는 탈분화 및 기능의 상실을 앓고 것으로 잘 알려져있다. 최근이 간 NPC 간 (병리) 생리학의 중심 역할과 PHH 기능의 유지 보수를 재생 것으로 나타났다. 현재의 연구는 2 차원 단일 재배의 한계를 극복하기 위해 3D- 공동 배양 모델에 의해 생체 내 조직 구조의 복원에 초점을 맞추고있다. 이전에, 우리는 인간 간 세포를 분리하는 방법을 발간 실험 생물학 및 의학 1 세포 배양 물에서의 사용을위한 이들 세포의 적합성을 연구 하였다. 이 테의 폭 넓은 관심을 바탕으로이 문서의 목적을 chnique하는이 기술을 쉽게 재생 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 인간 간세포는 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 기술에 의해 수술 개입 인간의 간 조직 샘플로부터 분리 하였다. PHH 50 x g에서 초기 원심 NPC로부터 분리 하였다. 밀도 구배 원심 분리 단계 사균의 제거를 위해 사용 하였다. 개인 간 세포 집단은 특정 세포 성 및 세포 선별 방법을 사용하여 농축 된 NPC 분획으로부터 분리 하였다. PHH 격리 옆에 우리는 더 재배 KC, LEC와 HSC를 분리 할 수​​ 있었다. 함께, 제시된 프로토콜은 한 기증자의 조직 샘플에서 높은 품질과 수량에 PHH 및 NPC의 분리를 할 수 있습니다. 정제 간 세포 집단에 대한 접근은 인간의 리 같은 생체의 생성을 허용 할 수 있습니다버전 모델.

준수의 특성과 맥의 사용과 결합 정리 절차로 밀도 기울기 원심 분리를 이용하여 실질이 아닌 실질 부분에 분리는 성공 PHH 및 NPC 분리로 연결됩니다. PHH 및 NPC는 높은 품질과 수량에 고립 될 수있다. (1) 간 관류 및 소화 용 장비의 대표 설정을 보여줍니다. 프로테아제 단백질 분해 활성을 감소시키는 대가로 콜라게나 제 P 활성 안정화 용액 II - 10 % ...

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Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K 조회수.  Charité University Medicine Berlin. A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

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Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

연구

생물학

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...