Bu sıçan hepatosit izolasyon protokolü, sindirim yaklaşımından önce karaciğer rezeksiyonuna dayanmaktadır. Protokol, hücre izolasyonu için kompakt ve taşınabilir entegre bir perfüzyon sistemi sunar. Bu teknik, kollajenaz kullanım hacmini azaltan kollajenaz resirkülasyonunu içerir ve yüksek yerçekimi verimi ve hepatositlerin spesifik fonksiyonunu sağlarken sindirim süresinin uzatılmasında daha fazla esneklik sağlar.
Sıçanı kaputun içine koyun. Karın kaslarını kestikten sonra, bağırsakları kavisli forsepslerin arkasıyla sağa doğru itin. Safra kanalının altındaki zarı, dikişi portal ven ve safra kanalı etrafında ilmek için kavisli forsepslerin ucuyla kırın.
Portal venin etrafında, karaciğere yakın çok gevşek bir ligatür yapmak için, damar farklı karaciğer loblarına sola ve sağa dallanmadan hemen önce ipek bir cerrahi sütür kullanın. Gastrik ven portal venden ayrılmadan hemen önce, ilk ligatür yukarı doğru yaklaşık iki ila üç santimetre yukarı doğru dalar, portal venin altındaki dokudan iki çift kavisli forseps uçlarıyla bir delik oluşturur. Daha sonra kanülasyon sırasında portal damarı desteklemek için deliği gerin.
Dakikada yaklaşık üç mililitrelik bir akış hızı için pompa hızını dört RPM'ye düşürerek karaciğerde basınç birikmesini önleyin. Ve kalsiyum içermeyen tamponun intravenöz kateterden çıkışının yavaş bir damlamaya indirgendiğinden emin olun. Portal veni forseps ile nazikçe desteklerken, intravenöz kateteri iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde tutun.
Ve iğneyi portal damara 10 ila 20 derecelik bir açıyla yerleştirin. Sonra tüm eğim damarın içine girene kadar yavaşça ilerleyin. Doğru yerleştirme, karaciğer renginin ağartılmasına neden olmalıdır.
Kanülü iğnenin üzerine ilerletin ve kateteri baş parmak ve orta parmakla tutarken kanülü işaret parmağıyla geri çekerek iğneyi kanülün arkasına geri çekin. Portal damarı, perfüzyon akışının bozulmasını önlemek için portal damarın altındaki bir damar klipsi ve klipsi ile kateterin üzerine sabitleyin. Daha sonra, karaciğerde basınç birikmesini önlemek için infrahepatik inferior vena kavayı kesin ve doğru kesimi sağlamak için kan fışkırtma dürtülerini gözlemleyin.
Dakikada yaklaşık 33 mililitre akış hızı için pompa hızını 38 RPM'ye yükseltin. Ve infrahepatik inferior vena kavayı forseps ile iki ila üç saniye kapatarak karaciğeri üç kez yıkayın ve sonra tekrar açın. Tüm karaciğer loblarını perfüze etmek için, kanül ucunun pozisyonunu ayarlayın ve portal ven dallarından önce farklı karaciğer loblarına yerleştirildiğinden emin olun.
Daha sonra, portal venin etrafındaki gevşek bağı dallanma noktasının hafifçe yukarı doğru doğru sıkın ve sert iğnenin kanülü desteklediği noktada, eğim ve yan delik arasında üç düğüm yaparak tamponun geri akışını önlemek için kanülün portal damardaki konumunu sabitleyin. Karaciğer rezeksiyonundan sonra karaciğerin 12 dakika boyunca kalsiyum serbest tamponu ile perfüzyona girmesine izin verin. Daha sonra, kalsiyum içermeyen tamponun silindir kelepçesini sıkın ve perfüzyon tamponunu değiştirmek için kollajenaz tamponunun silindir kelepçesini gevşetin.
Kollajenaz tamponu karaciğere ulaştıktan sonra, suprahepatik inferior vena kavayı iki ila üç saniye kapatıp tekrar açarak karaciğeri üç kez yıkayın. Kateteri desteklerken diyaframı forseps ile tutarak, kazara ayrılmayı önlemek için kateteri çekmemeye özen göstererek karaciğeri kollajenaz tamponunun devridaimi için beherin üstündeki aşamaya dikkatlice hareket ettirin. Karaciğeri 12 dakika boyunca sindirin ve karaciğer pürüzsüz kahverengi dokusunu kaybettiğinde ve küflendiğinde perfüzyonu durdurun.
Gerekirse sindirim süresini uzatın. Karaciğerin sindiriminden sonra portal damar kesilerek kanülü dikkatlice çıkarın. Ve sonra hepatositleri izole etmek için karaciğeri soğuk DMEM'e aktarın.
Parıltı kapsülünü kırmak ve soymak için kavisli forsepslerin arka tarafını kullanarak karaciğere hafifçe dokunun. Ve hücreler medyada tamamen ayrışana kadar karaciğeri DMEM'de hafifçe sallayarak karaciğer hücrelerini serbest bırakın. Hepatositlerin yaşayabilirliği, gezi ve mavi sayımı ile belirlenen% 88 ila% 94.8 arasındaydı.
200 ila 300 gram ağırlığındaki sıçanlardan hepatositlerin verimi, izolasyon başına sekizinci hücrelere beş kat 10 kadardı. Temsili görüntüler saflaştırılmamış karaciğer hücresi süspansiyonunu ve saflaştırılmış hepatosit süspansiyonunu göstermektedir. İzole hepatositlerin saflığı yaklaşık% 96.8 idi ve albümin pozitif floresan boyalı hücrelerin hücre çekirdeğinin toplam sayısına göre sayılmasıyla ölçüldü.
Yanlış renkte gösterilen temsili görüntülerde, yeşil albümini temsil eder ve mavi, albüminli hücre çekirdeklerini gösterir. Albüminsiz hücre çekirdekleri kırmızı renkle vurgulanır. Sandviç kültüründeki hepatositler farklı safra kanalikülleri oluşturdu ve iyi hücre hücre temasına sahipti.
Albümin, üre ve sitokrom P450 tahlillerinde gösterildiği gibi, hepatositler yüksek üre ve albümin sekresyonu sergiledi. Üçüncü günde, hepatositler CYP1A2, CYP2B1 / 2 ve CYP3B2 için yüksek enzim aktiviteleri sergiledi. İğneyi portal damara sokmadan önce zihinsel olarak hazırlıklı olun.
Yerleştirildikten sonra, bir cerrahın IVC'yi kestikten sonra pompa hızı artana kadar nabız olmadan devam etmesi gerekecektir.
