Bu araştırma Mükemmellik Programı kendi Araştırma Merkezi kapsamında Eğitim Singapur Ulusal Araştırma Vakfı ve Bakanlık tarafından desteklenen, Başlangıç ​​Hibeler Nanyang Technological University (M4330002.C70) ve AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) Milli Eğitim Bakanlığı, Singapur. Yazarlar bu protokolün gösteriye katılmak için Joey Yam Kuok Hoong teşekkür ederiz.

1. Biyofilm Yetiştiriciliği <ol><li> Bakteriyel Suşlarının hazırlanması <ol><li> 1 gün önce biyofilm ekimi, dondurulmuş bakteri kültüründen uygun büyüme ortamı 2 ml aşılayarak planktonik bakteri kültürleri hazırlamak. Mukoid P. Luria Broth-ortamı (10 g L-1 NaCl, 10 g L-1 maya özütü ve 10 g L-1 tripton) kullanarak aeruginosa ve Δ pel ve Δ psl hatalı mutantları. 37 ° C ve 200 rpm&#39;de çalkalanarak koşullarında bir gece boyunca inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanılarak OD 0.40 600 gecede kültürleri sulandırınız. </li><li> Tercihen sökülmeden akış hücresi görüntülenmesinde mikroskop odasına getirilebilir bir mobil istasyon ya da arabası üzerinde, daha önce 14 tarif edilmiştir akış hücresi kurulumu, birleştirin. </li><li> 2 L veya her bir akış hücresi için 5 L şişelerde steril büyüme ortamı hazırlayın. Minimal ortam M9 (48 mM Na-2 HPO 4, 22 mM kullanınKH 2 PO 4, 19 mM NH4CI, 9 mM NaCI, 2 mM MgSO 4 ve P.% 0.04 glukoz (ağırlık / hacim) ve% 0.2 (ağırlık / hacim) kasamino asitleri) ile desteklenmiş 0.1 mM CaCl2) aeruginosa hücre biyofilm akış. </li><li> Mikrosantrifüj tüpleri içine kısım flüoresan mikrosferleri ve 9,391.2 g santrifüj içinde 5 dakika boyunca 2 O steril H aşağı dönerler. Önceki 2 L veya 5 L ortamı şişelerde büyüme ortamına ilave sodyum azid (dezenfektan) kaldırmak için 1 ml büyüme ortamında supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. NOT: mikroküreler Farklı boyutlarda farklı konsantrasyonlarda gelir ve talimatlara uygun şekilde seyreltilmiş edilmelidir. Örneğin, 2.18 x 10 6 mikro ml -1 her parçacık boyutu elde 1,0 mikron çapında mikrokürelerin 120 ul, 0.5 mikron çapında mikrosferler 15 ul ve büyüme ortamı 2 L&#39;lik 0.2 mikron çapında mikro-0,96 ul dağıtılır. </li><li> Upst orta şişe takınAkış hücresinin ream ve büyüme ortamı tüm kurulum akmasına izin verin. Akışını durdurmak ve akış hücresi odalarına seyreltilmiş gecede kültürleri enjekte edilir. Bakteriler, yaklaşık 5.5 x 10 m -3 sn -1 veya bir peristaltik pompa ile 8 rpm&#39;lik bir akış oranında büyüme ortamının akışı devam etmeden önce 1 saat süre ile lamel alt tabakası eklemek için izin verir. Not: Biyofilmler, genellikle 3-7 gün boyunca oda sıcaklığında (25 ° C) yetiştirilir. </li><li> Seçenek olarak ise, statik kültürü kurulumu için, partiküller ile 1 ml büyüme ortamına, gece boyunca kültürün 10 ul ekleyerek, gece boyuncaki kültürleri mikrosantrifüj tüplerinde 100 kat seyreltilir. Akış biyofilm için kullanılana kıyasla yaklaşık 500 kat statik kültürü için büyüme ortamında partikül konsantrasyonu artırmak (örneğin, yıkama ve büyüme ortamına, 10 ml 1,0 um çapında küre 600 ul tekrar süspansiyon) sürekli ile takviye edilir akış hücresi olarak biyofilm parçacıklar ancak statik kültürler değildir. <ol><li> 200 ekle1; 8 kuyu slaytlar odalarına parçacıkları ile seyreltilmiş gecede kültür l. Statik koşullar altında 37 ° C&#39;de inkübe edin. Biyofilmler, genellikle 1 gün için büyütülür. Biyofilm fazla 1 gün yetiştirilir halinde parçacıklar ile, taze büyüme ortamı ile günlük olarak harcanan büyüme ortamını değiştirin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mikroskopi <ol><li> 3 gün ve 5, peristaltik pompanın akışını kapatın ve mikroskopi odasına akış hücresi kurulumu getir. Akış hücresi odalarının girişinde ya da çıkışında Kelepçe boru kayması akışından (ortamındaki değişikliklere göre sistematik bir hata nedeni) önlemek için. Dik bir mikroskop mikroskop sahneye akış hücresi yerleştirin. NOT: mikro görüntüleme için ters bir mikroskop kullanın. </li><li> Çeşitli yerlerde (mikrokoloniler ve düz farklılaşmamış katmanları) de biyofilm gömülü mikroküreli hareket videolar ve farklı günlerde (gün 3 ve 5) için almak 40X petrol amacı ile floresan mikroskopi kullanınzamansal ve uzamsal araştırmalar. Kısa zaman ölçeklerinde içinde meydana gelen olayları araştırmak için daha yüksek kare hızı ile kısa videolar çekin (örn 25-50 hızlı dinamikleri için saniye başına kare kare hızında 1.5-3 dakika video) ve daha düşük kare hızı ile daha uzun videolar uzun süre boyunca olayları araştırmak için terazi (2.5-5 kare / yavaş dinamikleri için sn kare hızında, örneğin 15-30 dakika videolar). NOT: Bir video genellikle 5-10 parçacıklar içerir ve dosya boyutu, genellikle 1,0-2,5 GB olduğunu. Büyük mikrokoloniler fazla parçacıkları tutabilir. Her kategori için 5-10 videolar (farklı mikrokoloniler ve düz farklılaşmamış katmanlarda farklı yerlerde örneğin 5-10 videoları) atın. Biyofilm mikrokoloniler, kanal, boşluklar ve düz farklılaşmamış tabakadan oluşabilir heterojen bir mimariye sahiptir. </li><li> Fiji / ImageJ tarafından okunabilir uygun biçimde videoları (örneğin Czi, tif) kaydedin. </li><li> Bitmiş vid gezinerek drift videoları kontroleo ve parçacıklar aynı anda aynı yönde hareket olmadığını gözlemleyerek. Drift z aşamalı hareket, akış hücresi akımlar, titreşim önleyici tablo, hava basıncı ya da sıcaklık değişimlerinden dengesizlik neden olabilir. Doğru minör genellikle mikroskop Yazılımla birlikte verilen post-işleme teknikleri kullanılarak sürüklenen. Sürüklenme düzeltilebilir olamaz, burada herhangi bir video atın. Parçacık Takip Analizi sırasında gerekli olan aşağıdaki parametreleri, kayıt: Çözünürlük (px / um), Çerçeveler sayısı, süresi. </li><li> Mikroskop sahneye gelen akış hücresini çıkarın ve biyofilm yetiştirilmesi devam peristaltik pompa yeniden başlatın. </li></ol> 3. Parçacık Takip Analizi <ol><li> Açık kaynak kodlu yazılım (ImageJ) &#39;de plug-in TrackMate kullanarak parçacık yörüngeleri edinin. En Fiji indirin <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Fiji ve Eklentiler menüsünün altında videoyu açın, İzleme ve TrackMate seçin. </li><li> Giriş veya th ayarlarıadım 2.4 kaydedilen video parametrelerini maç için ilk kalibrasyon ayarlarını düşündüren e penceresi. </li><li> ImageJ kullanılarak TrackMate partiküller algılar. <ol><li> (Örneğin 1000) &#39;LoG dedektörü&#39;, giriş parçacık çapına ve eşik değerini seçin. Mor çevreler videosu boyunca parçacıkları takip ettiğini kontrol etmek &#39;Preview&#39; butonuna tıklayarak ederken videonun ilerleyin. Gerekirse çap ve eşik değerlerini ayarlayın: mor çevreler boş uzayda görülüyorsa eşik değerini artırın. Yeterli parçacıklar tespit edilirse eşik değerini azaltın. Algılamasını parçacıkları tamamlamak için bir sonraki düğmesini tıklatın. </li><li> Eklemek veya &#39;İlk eşikleme&#39; tespit parçacıkların kaldırılması, &#39;bir görünüm seç&#39; ve ilk parçacık algılama tatmin edici olmadığını pencereler ayarlama yapmadan devam etmek için &#39;bir filtre seçin&#39; seçeneği ile sunulan bir sonraki düğmesini tıklayın. </li><li> Opti içinde &#39;Basit LAP tracker&#39; seçeneğiniparçacıkların nadir biyofilmdeki odak dışına taşımak ve kolayca izlenir olarak barda pencereyi &#39;Bir izci yöntemi seçin.&#39; Önerilen veya düşük bağlantı ve boşluk kapama maksimum mesafe değerleri kullanın ve bir sonraki tıklayın. </li><li> Bu parçacık izleme parçacıkların TrackMate tarafından çizilen izleri takip ettiklerini ve hiçbir istenmeyen veya eksik parça olduğunu görmek için video aracılığıyla kaydırarak yeterli olup olmadığını kontrol edin. Çeşitli filtreleme adımları atlayın. &#39;Bir eylem seçin&#39; nihai penceresine gidin. Açılır menüden &#39;xml dosyasına İhracat parçaları seçin ve&#39; Yürütme &#39;düğmesine tıklayın. Parçaları kaydetmek için bir klasör seçin. NOT: parçacık yörüngeleri ve microrheology kullanımının analizi için kamusal alanda mevcut çeşitli programlar vardır. msdanalyzer ve TrackArt Matlab ortamında çalıştırmak parçacık izleme analiz programları örnekleridir. </li></ol></li><li> Menüsündeki seçerek xml dosyaları parçacık yörüngeleri almak için Matlab hazırlayınMatlab Dosya&gt; Set Yolu ... ve komut Fiji paketi ile mevcut klasörü ekleyin. </li><li> Msdanalyzer parçacık yörüngeleri analiz etmek, zip dosyası veya tar.gz dosya bağlantısını indir at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> msdanalyzer Klasörünü 15 Özü ve Matlab yoluna ait bir klasörde bırakın (örneğin C: Documents and Settings &lt;Kullanıcı adı&gt; Belgelerim Matlab). Matlab başlatın ve yazarak analizörü başlatmak: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;sek&#39;) um ve sek video fiziksel uzay ve zaman birimleri nerede. <ol><li> Yazarak parçacık yörüngeleri İthalat: [izler, md] = importTrackMateTracks (&#39;DosyaAdı.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;ScaleT&#39;) ma = ma.addAll (parça); burada &#39;Clipz&#39; z 2B video boyutu ve &#39;scaleT&#39; kaldırır. </li><li> Grafik kullanarak üzerine yörüngeleri Plot: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Kullanarak parçacıkların iskelet sistemi hesaplayın: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Her parçacığın iskelet sistemi çizilir: şekil ma.plotMSD </li><li> ) 3.5.1.4 ile 3.5.1.1 tekrarlayarak (günde 3 yabani tip mikrokoloniler gömülü örneğin parçacıkların) diğer aynı categery videoları partikül yörüngeleri birleştirin. </li><li> Topluluk ortalama veya tüm eğriler üzerindeki ortalama Plot: ma.plotMeanMSD Logaritmik ölçeğe lineer Y ve X-ekseni değiştirin. Uzun gecikme zamanlarda, MSD eğrileri nedeniyle uzun zaman ölçeklerinde yetersiz istatistiklerine gürültülü olur. MSD eğrileri nedeniyle de dinamik hata dik yükselebilir. Eğrinin bu bölgeler fırça aracını kullanarak kaldırılabilir&gt; eğrinin sonunu seçin ve seçme &#39;Fırçalama&#39; Araçlar menüsünden &#39;Unbrushed Kaldır&#39;. </li></ol></li><li> En Ezyfit indirin <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> ve Matlab yoluna ait bir klasöre Ezyfit ekleyin (örneğin C: Documents and Settings &lt;Kullanıcı adı&gt; Belgelerim Matlab). Efmenu yüklemek Matlab çalışma alanında yazarak Ezyfit menüsüne yükleyin. Şekil penceresinde Ezyfit menüsü ile MATLAB yeniden başlatın. Ezyfit menüsünden &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Güç&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; seçerek güç hukuka MSD eğrileri uygun n tahmini Pasif üs α olduğu idi. NOT: msdanalyzer MSD eğrilerinin takılması için Matlab Toolbox Montaj Eğrisi gerektirir. Ezyfit eğri uydurma gerçekleştirebilirsiniz alternatif ve ücretsiz bir yazılımdır. </li><li> Temizle akım parçacık yörüngeleri ve MSD&#39;ler diğer yerlerde veya zamanda yeni parçacık ve iskelet hesaplamak için: açık </li&gt; <li> Çeşitli ortalama MSD orta (kontrol) içindeki partiküllerin eğrileri ve mikrokoloniler ve çeşitli suşları farklılaşmamış alanlar, kopyalama ve karşılaştırma için tek bir grafikte içine eğrileri yapıştırmak hesaplandıktan sonra. Örnek sertliği ve alt MSD değerleri ile çapraz bağlama artar. Düz eğrileri düşük a&#39;yı ve örnek yüksek alfa ile dik eğrileri daha esnektir. </li><li> Eğri seçin ve medyan ve aralık gibi veri istatistiklerine bakmak için &quot;Araçlar&quot; gidin. Boncuk MSD bozulma uyumu ile orantılıdır, J boncuk ilişkiye göre gömülü olduğu malzemenin (t), <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> burada J = sürünme uyumu, d = partikül çapı, k B = Boltzman sabiti T = sıcaklık ve t = zaman. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms.">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li><li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides.">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li><li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li><li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation.">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa.">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li><li>Bokranz, W., Wang, X., Tsch&#228;pe, H., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract.">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li><li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms.">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li><li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+complex+fluids.">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells:+Principles+and+Applications.">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells.">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383 (2011).</li><li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures.">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li><li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms:+genetic+elements+and+molecular+mechanisms.">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms.">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science &amp; Technology. 43, 113-120 (2001).</li><li>J&#228;ger-Z&#252;rn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls.">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Microrheology gibi mikrobiyel filmlerin olarak heterojen sistemler, yerel reolojik ölçümler için yararlı bir araçtır. Birden fazla kez puan üzerinden aynı biyolojik numune içinde reolojik değişikliklerin gerçek zamanlı izleme sağlayan bir tahribatsız tekniktir. Bu protokolde, partikül izleme microrheology onlar elastikiyet ve biyofilm matrisi etkin çapraz bağlanmasını nasıl etkilediğini araştırmak için Pel ve PSL ekzopolisakkarit mutantlar uygulandı. Pel viskoelastik ve gevşek biyofilm yanad?...

Çoğu bakteri hücrelerinin hem planktonik (serbest yaşayan) ve büyümeye 1. yüzey bağlı (sesil) modları istihdam edebiliyoruz. Büyüme yüzeyi bağlı modunda, bakteri hücreleri salgılar ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) biyofilm oluşturmak için büyük miktarlarda kendilerini örten. EPS esas olarak protein, eksopolisakaritin, hücre dışı DNA&#39;dan oluşur ve biyofilm 2 için gereklidir. Bu bakteriler mekansal farklılaştırmak için kullanabileceğiniz ve zararlı çevresel koşullar ve ev sahibi yanıtlardan bakterileri korur hangi tarafından fiziksel bir iskele olarak hizmet vermektedir. EPS farklı bileşenleri dramatik biyofilm yapıları 4 pişmanlık olabilir EPS bileşenleri ifadesinde biyofilm oluşumu 3 ve değişiklikler farklı rollere sahiptir. EPS bileşenleri molekülleri 5 sinyal olarak işlev görebilir ve son çalışmalar onların göç ve biyofilm diff rehberlik mikrobiyal hücrelerin ile etkileşim bazı EPS bileşenleri göstermiştirerentiation 6-8. EPS Araştırma ölçüde EPS 9,10 belirli bir bileşeni kusurlu mutantlar tarafından üretilen biyofilm morfolojik analizler dayalı gelişmiş etmiştir. Buna ek olarak, EPS genellikle makro ölçekli (toplu karakterizasyonu) 11 de karakterize edilir. Morfolojik, ortalama değerleri döndürür biyofilm heterojenliğinden içinde var detay kaybeder nicel detay ve dökme karakterizasyonu, yoksun olabilir, ancak analiz eder. Mikro ölçekte EPS mekanik özelliklerinin gerçek zamanlı karakterizasyonu ilerleme artan bir eğilim artık yoktur. Bu protokol parçacık izleme microrheology Pseudomonas aeruginosa biyofilm 4 viskoelastisite ve etkin çapraz bağlanma üzerinde matris bileşenleri Pel uzaysal efektleri ve PSL eksopolisakaridleri belirlemek mümkün gösterilmiştir. Pasif microrheology basit ve ucuz bir rh olduğunugüncel 12,13 bir malzemenin uzaysal microrheological örnekleme yüksek verim sağlar eology yöntemi. Pasif microrheology, prob küreler örnek yerleştirilir ve termal enerji (k B-T) ile tahrik edilen kendi Brown hareketi, bir video mikroskobu ile takip edilir. Çeşitli parçacıklar aynı zamanda izlenebilir ve parçacıkların zamana bağlı koordinatları geleneksel bir rastgele yürüyüş izleyin. Bu nedenle, ortalama olarak, parçacıklar aynı konumda kalır. Ancak, yer değiştirmelerin standart sapma veya ortalama parçacıkların deplasman (MSD) karesine, sıfır değildir. Viskoz sıvılar akış beri zaman ilerledikçe, yapışkan bir sıvı içindeki parçacık MSD doğrusal büyür. Buna karşılık, polimerik çapraz viskoelastik bulunan veya elastik maddeler onları akışını karşı yardımcı olur ve partiküller MSD eğrisinin (Şekil 1A) yaylalara lider, kendi yerinden sınırlı olur. Bu gözlem, bir ilişki aşağıdaki MSDαt <sα maddenin elastik ve viskoz katkıları oranı ilgili Pasif üs a&gt; kadar. Viskoelastik maddelerin &lt;α &lt;1, ve elastik maddeler α 0 viskoz sıvılar içinde hareket eden parti kül α = 1 için, = 0 MSD aynı zamanda malzemenin eğilimi sürekli fazla deforme olan bozulma uyumu hesaplamak için kullanılabilir zaman ve nasıl kolayca malzeme yayılır tahmin ediyor. Parçacığın boyutu, yoğunluğu ve yüzey kimyası microrheological deney doğru bir şekilde uygulanması için kritik olan ve (bu durumda biyofilm matris polimerleri, Şekil 1B&#39;ye bakınız) ele sistemine göre seçilir. İlk olarak, partikül parçacık kendisinden çok daha küçük olan yapılarla maddenin reolojisini ölçer. Maddenin yapısı parçacığın, par hareketine benzer ölçek isenizTICLE münferit yapıların şekli ve yönelimi rahatsız edilir. Ancak partikülü saran yapıların daha küçük olması durumunda, bu etki, küçük olan ve parçacık (Şekil 1B) homojen bir ortamı gösteren, ortalama. İkincisi, parçacığın yoğunluğu sedimantasyon kaçınılması ve atalet kuvvetleri ihmal edilebilir, öyle ki (su bazlı ortamlar için 1.05 g ml -1) orta benzer olmalıdır. Polistren örgüleri olan çoğu parçacıklar yukarıdaki kriterleri karşılayan. Hareket maddesi yapıları ile termal enerji ve çarpışma ile tahrik rasgele ise, partikül MSD reolojik yorumlanması geçerlidir İdeal olarak, partikül biyofilm matris polimer ile etkileşmez. Bu prob partikül bağlamak veya bir ön yetişkin bir biyofilm yüzey öteye sıçrama eğiliminde olmaktadır olup olmadığının kontrol edilmesiyle görülmektedir. Ancak, biyofilm çekim olmamasına rağmen, parçacıkların matris içine dahil edilmesi gerekir.Buna ek olarak, biyofilm fizikokimyasal heterojenite Farklı parçacıklar biyofilm farklı bölgelerinde problar olarak daha uygun olan neden olabilir. Bu nedenle, farklı ebatlarda ve yüzey kimyası parçacıkları biyofilm uygulanmalıdır. Bunun gibi, parçacık MSD bileşenleri reolojisine katkıda bulunmak ve biyofilm yayılması ne kadar farklı hakkında yararlı bilgiler verebilmektedir. Ayrıca, farklı prob kullanımı, bir biyofilm mekansal fizikokimyasal heterojenite hakkında bilgi elde sağlar. Bu yöntem, biyofilm mekanik özellikleri başka bir türden getirilmesi değiştirilir araştırmak karışık türleri biyofilm biyofilm mekanik özellikleri üzerindeki etkisi antibiyotik tedavisi test etmek için kullanılır ya da uygulanabilir. Parçacık KİSH&#39;lerin biyofilm dağıtmasına karakterize etmek için yararlı olabilir. Bu tür çalışmalar bir potansiyel biyofilm tedavileri geliştirmek, biyofilm anlayışımızda yararlı olacaktıryararlı faaliyetler için biyofilmlerin nd mühendisliği.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Boşlukları (biyofilm üzerindeki orta), ovalar (hücrelerin farklılaşmamış düz tabaka) ve mikrokoloniler (Şekil 2A etiketleri bakınız) dahil biyofilm, farklı bölgelerindeki biyofilm yerel viskoelastik özellikleri incelenmiştir. Gün olgunlaşma esnasında biyofilm viskoelastik özellikleri zamansal değişimi 3 ila 5 de belirlenmiştir. Boşlukların içindeki parçacıkların MSD saf ortam içinde parçacıkların MSD için bir kontrol ve karşılaştırılabilir olarak kullanılmıştır...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Video: In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Biyomühendislik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı<em&gt; In situ</emBakteriyel biyofilm Fiziksel Özelliklerinin&gt; 3D Mapping

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Model Vocal Fold Polip'in Neden Olduğu Üç Boyutlu Akış Ayrımının Araştırılması

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Deniz sünger Spicules mekanik özelliklerini ölçmek için bir milimetre ölçek bükülme test sistemi

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...