The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

1. alta taxa de transferência de Determinação de Glicose rendimentos e xilose Seguindo enzimática Sacarificação 9,29 <ol><li> Preparação de Amostras (Grinding, De-starching, extracção, pré-tratamento) <ol><li> Moer, pelo menos, 300 mg de cada amostra de biomassa usando um moinho de facas, de modo a que as partículas passam através de uma malha 20 (850 um) de tela. Transferir para sacos zip-top anti-estáticos (normalmente com código de barra) e informações de exemplo registro no banco de dados de código de barras. </li><li> Adicionar cerca de 250 mg ou mais da biomassa aérea do saco anti-estática para uma numerada (com lápis, não use tinta ou marcador) tea-bag, cuidadosamente arregaçar as saquinhos de chá, certificando-se de dobrar as extremidades através da biomassa para evitar perda durante de-starching e extração. </li><li> Enrole o saquinho fechado com fio de cobre revestido de estanho. Registe o número do saquinho de chá para cada amostra de código de barras. </li><li> Preparar a solução de enzima-starching de enzimas comerciais (tipicamente, 0,25% (v / v) de glucoamilase (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) de alfa-amilase (~ 2.900 KNU-S / L) em acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomassa ou volume de 500 ml por 120 amostras do saquinho de chá. Nota: Cargas capazes de remover o amido a partir de biomassa no solo deve ser determinado empiricamente através de testes de amido após a digestão com uma gama de cargas de enzima e rácios. </li><li> Em um recipiente de plástico, adicionar 16 ml de solução de enzima-starching de por 1 g de biomassa chão grandes quantidades. Para um protocolo de-starching lote, adicionar 120 saquinhos para 500 ml da solução tampão de enzima. </li><li> Incubar em um agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para remover possível amido. </li><li> Após a incubação de-engomar, lavar e aproveitar a biomassa em vários litros de água deionizada por 30 min. Repetir este processo mais duas vezes para remover os sais do tampão que pode causar esbarrar (formação de bolhas de gás na solução que pode resultar em um aumento súbito e violento no nível da solução, fazendo com etanol quente para o líquido em cascatapara fora do vaso de reacção) durante a extracção. </li><li> Após a lavagem exaustiva da biomassa engomado-de, colocar os saquinhos para a coluna de extracção de Soxhlet para. Nenhuma dedal é necessário para este passo. </li><li> Configure o refluxo Soxhlet, utilizando 95% de etanol e extrair as amostras durante 24 horas. </li><li> Remover os saquinhos do reactor de Soxhlet e espalhado em uma única camada sobre um tabuleiro plano. </li><li> Permitir que as amostras para secar durante a noite à temperatura ambiente numa hotte. </li><li> Desenrole os saquinhos de chá e voltar a biomassa seca para originais sacos anti-estáticos com código de barras. Nota: Os sacos anti-estáticos são eficientes em reduzir a eletricidade estática na biomassa, melhorando as características de manipulação. Se forem utilizadas outras opções de armazenamento, a biomassa adicional pode ser necessário devido ao apego biomassa para o lado do recipiente de armazenamento. </li><li> Transferir, pelo menos, 50 mg de biomassa seca para um funil de código de barras (utilizando mais material é melhor para uma distribuição precisa). Spode barcodes de sacos anti-estáticos e da tremonha de recepção para garantir rastreamento amostra precisa. </li><li> Hoppers carga para pesagem sólidos robô, prestando muita atenção à ordem das amostras nos racks. Carregar placas reactor suficiente para conter todas as amostras e seleccionar o protocolo de distribuição com base no número de placas utilizadas. </li><li> Roboticamente pesar 5 mg das amostras secas (± 0,3 mg) em aço inoxidável de placas de 96 poços resistentes aos ácidos. Pesar 3 repetições de cada amostra distribuídos em torno da placa para minimizar quaisquer variações localizadas. </li><li> Incluir 8 amostras de biomassa controle de um material padrão de biomassa bem caracterizado, a fim de acompanhar o desempenho do ensaio. Para vários pratos, o uso de múltiplos funis de biomassa padrão irá minimizar o tamanho de partícula deriva causada por peneiração nos funis ao longo de ciclos repetidos de distribuição. Nota: Em cada placa, deve ser de 24 amostras com 3 repetições, 4 espaços em branco que consistem em água desionizada e a enzima, e 8 controLS, usando o padrão de biomassa previamente caracterizados. Os poços 3 canto de cada um dos 4 cantos da placa são reservados para os padrões de açúcar. </li><li> Cheque em branco e açúcar poços de padrão de partículas de biomassa errantes e remover se presente. </li><li> Adicionar 250 ul de água desionizada a cada cavidade, e selar as placas com politetrafluoroetileno adesivo de silicone de encosto (PTFE) de fita. </li><li> Usando um &quot;ponta do ferro de solda 08/01, perfurar a fita de PTFE em cada porto de vapor (117 total) para cada prato. Use um prato vazio empilhados na placa reactor selado como um guia e para restringir PTFE movimento filme. </li><li> Prenda as placas firmemente com 0,031 &quot;juntas de espessura reforçado com vidro de PTFE (pré-perfurados com orifícios para os portos de vapor) entre as placas e placas vazios na parte superior e inferior da pilha. Pretreat as amostras utilizando um reactor de vapor definido para 180 ° C durante 17,5 min, ou outras combinações de temperatura / tempo com base na severidade desejada. </li><li> Placas de reatores Arrefecer até 50 °; C por inundações com água deionizada. </li></ol></li><li> Enzimática Sacarificação <ol><li> Prepara-se uma solução de sacarificação enzimática consistindo em 8% (v / v) de solução de enzima em citrato de sódio 1,0 M, pH 5,0. Prepare 5 ml por placa reactor. Nota: A diluição necessária deve ser determinado com base na actividade e teor de proteínas da solução de estoque de enzima específica. </li><li> Quando as placas são legais, centrifugar-los em um rotor basculante em 1500 xg durante 20 min. Remover vedação filme. Nota: Estas placas são pesados ​​e as especificações de centrifugação deverão ser verificados para compatibilidade. </li><li> Adicionar 40 ul da solução de enzima de 8% a cada poço (70 mg de enzima por g de biomassa). </li><li> Selar novamente com nova fita PTFE. Coloque placa selada em placa de fixação magnética. </li><li> Misturar suavemente as amostras por inversão (pelo menos 15 vezes), e incuba-se a 50 ° C durante 70 h. </li><li> Quando a sacarificação concluiu, misturar por inversão e centrifugar as placas a 1.500 xg durante 20 min. </li></ol></li><li> Ensaio de Açúcar <ol><li> Preparar um conjunto de 6 de glucose e xilose combinado padrões de calibração em tampão de citrato 0,014 (pH 5,0) variando de 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, e 0,75 mg / ml recomendado) e de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, e 0,6 mg / ml recomendado) para a glucose e xilose, respectivamente. </li><li> Preparar a glucose-oxidase / peroxidase (goPod) e xilose desidrogenase (XDH) reagentes de acordo com as instruções do kit. </li><li> Usando uma pipeta, 200 uL de remover líquido dos poços de canto 4 e poços de bordo adjacentes às cavidades de canto (12 cavidades no total) da placa reactor. </li><li> Usando uma pipeta, 180 uL dispensar água desionizada a cada poço de uma placa de diluição de fundo plano de 96 poços de poliestireno. Não adicionar água aos poços de canto padrão e 12 açúcar (remover essas dicas se estiver usando uma cabeça de 96 canais). </li><li> Usando uma pipeta, 180 uL de reagente dispensar goPod a cada poço do ensaio de glucose plcomeu. </li><li> Usando uma pipeta, dispensar reagente XDH 180 ul a cada poço da placa de ensaio de xilose. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 20 ul de aliquotas a partir do hidrolisado do reactor placa de 96 cavidades para a placa de diluição. Pipetar a partir da parte superior dos poços para evitar sólidos de biomassa e o líquido residual em poços de canto. Misturar por trituração para pelo menos 10 ciclos. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 110 ul de padrões de açúcar, em duplicado, às cavidades de canto da placa de diluição. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 20 mL alíquotas a partir da placa de diluição às placas de ensaio de glicose e xilose. Misture por trituração. </li><li> Incubar as placas de ensaio de glicose e xilose à temperatura ambiente durante 30 min. Quebre cuidadosamente quaisquer bolhas de superfície antes de ler. Uma pistola de calor passou rapidamente sobre a superfície da placa funciona bem. </li><li> Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 510 nm e registre a absorvância contra um branco de reagente.Esta medição monitoriza a formação de quinonimina, que é proporcional à concentração de glicose. A concentração de glicose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1. </li><li> Usando um de 96 poços leitor de placas ultravioleta / visível, defina o comprimento de onda medido a 340 nm e registre a absorção. Esta medição controla a redução do NAD + a NADH, que é proporcional à concentração de xilose. A concentração de xilose é calculada a partir da curva de calibração com base em padrões de calibração preparadas no ponto 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. alta taxa de transferência de Determinação de lignina total e lignina Monomérico Conteúdo Usando pyMBMS 28 <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Moer e extrai-se a biomassa utilizando os métodos descritos nos passos 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Isso inclui moagem e extração de um conjunto de normas de usar controles como experimentais. Nota: O MEASUR pyMBMSements são não-dependente do tamanho da partícula, de modo que apenas utilizando o protocolo pyMBMS, a preparação de biomassa devem ser realizados para permitir que a amostra se encaixar no suporte da amostra, &lt;4 mm. </li><li> Utilizando uma pequena espátula de distribuição a cerca de 4 mg de (3 a 5 mg de preferência) da biomassa preparada num copo de aço inoxidável de 80 ul concebido para o amostrador automático. </li><li> Certifique-se de que pelo menos 10% das amostras sendo analisadas são normas de controlo, tais como os disponíveis do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (bagaço de cana-8491; choupo-8492; pinho-8493; ou palha de trigo-8494). O padrão pode também ser quaisquer espécies análogas para as amostras a serem analisadas, que já foram caracterizados utilizando métodos convencionais. </li><li> Aleatoriamente carregar as amostras para os copos auto-amostrador usando uma pinça para evitar viés devido a uma possível deriva espectrômetro ao longo do tempo. Nota: Uma aleatorização típica das amostras que incluem a medição de todas as amostras de uma vez, seguido por uma re-randomizaçãoda ordem das amostras para uma medição duplicado. Programas de randomização estão disponíveis online. </li><li> Usando um furador padrão, produzir manualmente discos de filtro de vidro a partir de folhas de fibra de vidro A / D tipo, sem aglutinante. Segure o filtro de fibra de vidro redondo com uma pinça, centralizá-lo sobre o copo de amostra, e empurrar para a amostra usando uma chave Allen de 3,5 milímetros para confinar o material em cada copo durante o experimento. </li></ol></li><li> Protocolo Instrumental <ol><li> Calibra-se o espectrómetro de massa usando um padrão conhecido que tem as intensidades dos picos mais de toda a gama de compostos que podem existir para as amostras experimentais. Para amostras de biomassa típicos, usar perfluorotributilamina (PFTBA). </li><li> Definir a taxa de fluxo de gás de transporte de hélio para 0,9 L / min, utilizando um medidor de fluxo de gás. </li><li> Definir o forno de auto-amostrador a uma temperatura de pirólise de 500 ° C e a temperatura de interface a 350 ° C, utilizando o software de auto-amostrador. Nota: A &quot;de aço inoxidável 1/8 aquecidaA linha de transferência de calor envolvido na fita que liga o amostrador automático para o espectrómetro de massa é controlada usando um controlador térmico a 250 ° C. </li><li> Comece a aquisição de dados sobre a espectrômetro de massa e aguarde pelo menos 60 segundos para obter dados suficientes para a recolha de espectros de fundo. </li><li> Comece o método de auto-amostrador automático com as especificações de 2.2.2. Nota: O amostrador automático gotas cada amostra individual para dentro do forno de auto-amostrador. O tempo total de aquisição de dados é de aproximadamente 1,5 min; No entanto, a pirólise de um típico 4 mg de amostra é completa após 30 seg. </li><li> Conteúdo recorde total de iões (TIC) de cada amostra utilizando software espectrômetro de massa em 0,5 seg velocidade de varredura. Intensidades recorde entre m / z 30-450. Nota: compostos de biomassa típicas utilizam ionização suave em 17 eV. O instrumento pode gravar intervalos maiores a partir de m / z de 1 a 1000; no entanto, a taxa de varredura será limitado pela potência da CPU do computador. </li><li> Remover fundo a partir dos espectros usando o manual aprimorar recurso do software. Nota: Uma porção de 60 varrimento de linha de base no início da recolha de dados é usada para calcular um valor médio de fundo. Este espectros média de fundo é removido a partir dos espectros da amostra experimental automaticamente no software espectrómetro de massa. </li><li> Importar o ficheiro de texto coluna único criado pelo software espectrómetro de massa que contém os dados espectrais para cada amostra, em um programa de base de dados e combinar todas as amostras numa base de dados. Adicionar quaisquer metadados aplicável à planilha. Importe os dados formatados (planilha de arquivos / CSV) em um pacote de software estatístico e significa normalizar o espectro para explicar a variação nas massas de amostra pyrolyzed. </li><li> Usar um pacote de software estatístico para realizar uma análise de componentes principais (PCA), usando os dados espectrais para analisar agrupamento das amostras padrão replicados utilizados nas medições, bem como para avaliar os picos que são integrais com a classificação de químicacompostos nas cargas plotar 28. Nota: grupos PCA as amostras com base na similaridade de seus espectros, e permite uma verificação das normas para medir erro experimental devido à deriva instrumento durante a corrida. </li><li> Para calcular a lenhina siringil (S) / guaiacilo (L) índice, soma das áreas dos picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividir pela soma de G picos em 124, 137, 138, 150, 164, e 178. </li><li> Para calcular o teor de lignina total, soma dos picos de lignina com m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210. </li><li> Calcular um fator de correção para escalar a medição pyMBMS com um método padrão para a estimativa total de lignina, como Klason lignina. Divida o valor lignina Klason da norma individual pelo teor de lignina total medido para essa amostra padrão usando pyMBMS. </li><li> Aplicar esse fator de correção para todos os-espécies, como no conjunto de dados. Repita o procedimento para cada tipo de biomassa analisada. Nota: O factor de correcção pode variar significativamente com base no S / L de biomassa analisados. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

As principais etapas de preparação de amostras para a obtenção de dados precisos e reprodutíveis quando conduzindo experimentos de rastreio de alto rendimento são as seguintes: Ensaio de Libertação de açúcar: Em geral, as amostras são preparadas em lotes que vão desde algumas dezenas a milhares de cada vez. Cada passo importante é tipicamente levada a cabo em todas as amostras antes de se mudar para a frente, a fim de minimizar as variações na prep...

Como a oferta global de combustíveis não renováveis ​​e os seus associados produtos declínios, os cientistas foram desafiados a criar combustíveis e produtos químicos similares a partir de fontes de origem vegetal 1. Um aspecto importante deste trabalho é determinar que espécies de plantas podem ser adequados para a produção de biocombustíveis e biomateriais 2,3. Tipicamente, estas matérias-primas são avaliadas para a lenhina, celulose, hemicelulose e conteúdo; bem como a sua susceptibilidade à desconstrução (recalcitrante) através de pré-tratamento térmico, mecânico e / ou químico, com ou sem subsequente sacarificação enzimática. Análises mais detalhadas são utilizados para determinar a composição específica das fracções de lignina e hemicelulose, bem como actividades enzimáticas óptimas necessário. Modificações transgênicas de plantas que não intrinsecamente possuem características ideais para a conversão bioquímica ou termoquímica a commodities desejados forneceram os investigadores com uma fonte de grande expansão de maconhacial matérias-primas 4. Os métodos analíticos padrão para quantificar as características químicas de uma planta, ao mesmo tempo bastante útil para pequenos conjuntos de amostras, não são adequadas para a pesquisa rápida de centenas ou milhares de amostras 5-7. Os métodos aqui descritos HTP foram desenvolvidas para avaliar rapidamente e com eficiência um grande número de variantes de biomassa para alterações na parede celular recalcitrante à degradação termoquímico e / ou enzimático. É fundamental compreender que os testes de rastreio HTP aqui descritos não foram concebidos para maximizar a conversão ou o rendimento. O objetivo é determinar as diferenças relativas na recalcitrância intrínseca de amostras de biomassa. Como resultado, muitas das etapas de análise são diferentes dos &quot;típicos&quot; ensaios de conversão da biomassa, onde o objetivo é obter a taxa de conversão máxima ou extensão. Por exemplo, inferiores gravidades de pré-tratamento e tempos mais curtos de hidrólise enzimática são usadas para maximizar diferemcias entre as amostras. Na maioria dos casos, cargas relativamente elevadas de enzimas são usados ​​para reduzir as diferenças devidas à variação experimental da actividade da enzima, o que poderia distorcer os resultados significativamente. Técnicas rápidas para determinar a composição de plantas de células-paredes e os açúcares monoméricos libertado seguinte sacarificação enzimática incluem robótica, personalizado, placas de 96 poços termoquimicamente compatíveis, e modificações de métodos laboratoriais padrão 8-11 e protocolos instrumentais, como a espectroscopia vibracional (infravermelho (IV), no infravermelho próximo (NIR), ou de Raman) e de ressonância magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologias são a chave para o isolamento de matérias-primas com alta de celulose ou de baixo teor de lignina, ou aqueles esperado para produzir a mais elevada de glicose, xilose, etanol, etc. Estes métodos permitiram análises downscaled que empregam menores quantidades de biomassa e produtos de consumo, levando a reduções nos experimental custa 18 </sup&gt;. Outra característica desta abordagem metodológica é que várias condições experimentais pode ser rapidamente e, em alguns casos, ao mesmo tempo, avaliada. Por exemplo, uma variedade de diferentes estratégias de pré-tratamento ou cocktails enzima pode ser testado, permitindo que os parâmetros experimentais mais ideais para ser rapidamente identificados e empregues. Matérias-primas populares, como palha de milho 9, álamo 8,10, bagaço de cana 8, e switchgrass 8 foram avaliadas com sucesso usando esses métodos HTP. Lignina total e composição monomérica lignina também são comumente quantificada traços de biomassa. As reduções no teor de lenhina foram mostrados para aumentar a digestibilidade enzimática de polissacarídeos 19,20. O papel que a razão monomérica lignina (muitas vezes relatadas como siringil / guaiacil (S / G)) desempenha na desconstrução da parede celular da planta ainda está sob investigação. Alguns relatórios indicaram que as reduções no S / Grácio levou a rendimentos aumentados de glicose após hidrólise 21, enquanto outros estudos revelam a tendência oposta 19,22. Métodos de alto rendimento para avaliar a lignina e seus monômeros incluem espectroscopia vibracional (IR, NIR e Raman 23-26) juntamente com a análise multivariada, pirólise e espectrometria de massa de feixe molecular (pyMBMS) 27,28. Ao desenvolver métodos HTP para o rastreio de biomassa, várias considerações integrais precisam ser mantidos em mente. Um aspecto chave é a complexidade do método. Qual é o nível de habilidade necessária para a técnica? Análises quimiométricas, por exemplo, exigem habilidades específicas para a construção, avaliação e manutenção de modelos preditivos. Os métodos padrão de análise exibem passos preparatórios ou dados indesejáveis ​​ou empregar reagentes tóxicos. Desenvolvimento dos modelos é um processo contínuo em que os novos dados são incorporados no modelo ao longo do tempo para aumentar a robustez do modelo. Outra consideperação é a redução de custos e diminuição do tempo de análise dos métodos experimentais de alto rendimento propostas. Se o método é bastante rápida, mas muito dispendioso, não pode ser uma técnica viável para muitos laboratórios a adoptar. Os métodos ilustrados neste manuscrito são variantes técnicas padronizadas, modificados para amplificar as capacidades de rendimento. Estes protocolos medir quantitativamente os traços de biomassa de interesse sem que seja necessário o desenvolvimento de modelos preditivos. Este é um atributo-chave destas técnicas, uma vez que os métodos preditivos, enquanto exibem fortes correlações com o padrão análises utilizados para desenvolver os modelos, não são tão precisos como realmente medir a quantidade de interesse para as amostras. Considerando que os métodos utilizados são essencialmente reduzida versões de métodos analíticos em escala de bancada padrão, exatidão e precisão são negociadas para a velocidade e taxa de transferência. Na maior parte, este resultado é devido a erros maiores na pequena pipetagem volume e pesagem; bem como o aumento sampla heterogeneidade como tamanho da amostra é reduzida. Enquanto as grandes conjuntos de amostras podem ser rastreados e comparados, muito cuidado deve ser exercitado ao fazer comparações entre campanhas separadas e aos resultados em escala de bancada. Os passos mais demoradas envolvem a manipulação física da biomassa. Amostras de moagem pode levar vários minutos por amostra, incluindo a limpeza do moinho entre as amostras. Carregando manualmente, a descarga, e moegas de limpeza e enchimento e esvaziamento sacos de chá e sacos de amostras também é muito trabalhoso. Embora cada etapa pode demorar um minuto ou mais, fazendo milhares de amostras pode demorar várias horas ou mesmo dias. Os robots podem carregar um reactor típico placa com biomassa em cerca de 3 a 4 horas ou 6 a 8 placas dia -1 -1 robô. Esta situação depende dos parâmetros de precisão utilizados, bem como do tipo e quantidade de biomassa a ser testado. Placas de enchimento do reactor com água, ácido diluído, ou enzima é feito rapidamente, utilizando um manuseamento robô líquido. Pretratamento de uma pilha de placas (de 1 a 20 placas de reactores) leva entre 1 e 3 horas, quando a montagem, esfriar e desmontagem está incluído. Hidrólise enzima leva 3 dias e a análise de açúcar requer cerca de 1 hora de tempo de preparação, mais 10 min por placa reactor para completar o ensaio e ler os resultados. A programação semanal de Set de pré-tratamento e de análise dias acomoda um horário de trabalho razoável, minimizando estranho horas e fins de semana os esforços para o componente humano do ensaio e permite o processamento de ~ 800 a 1.000 amostras por semana em uma base contínua. A taxa de transferência máxima depende de vários fatores, principalmente quanto hardware (robôs, reatores placas, etc.) e quanto &quot;software&quot; (ou seja, recursos humanos) estão disponíveis para fazer o trabalho manual. O limite prático superior é 2.500 a 3.000 amostras / semana; no entanto, que a produção exige operação de sete dias por semana e vários estagiários e técnicos dos estudantes. Em comparação, 3.000 amostras por HPLC exigiria cerca de 125 dias de samanálise ple mais o trabalho adicional de pesagem manualmente amostras em reatores e amostras de filtragem antes da análise.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

O efeito combinado do pré-tratamento termoquímico e subsequente sacarificação enzimática é medida como uma função da massa de glicose e xilose libertada no final do ensaio. Os resultados são relatados em termos de miligramas de glicose e xilose libertada por grama de biomassa. Isto está em contraste gritante com dados reportados a partir de ensaios em escala de bancada, que normalmente é avaliado como por cento de rendimento teórico com base em análise da composição do material de partida. Como ele ainda ...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K visualizações.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Screening Semi-High Throughput para o Potencial tolerância à seca em alface ( Lactuca sativa) Germoplasma Colecções

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

Pré-tratamento de biomassa lignocelulósica com baixo custo líquidos iônicos

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

Pré-tratamento de biomassa lignocelulósica da fibra de amônia (AFEX)

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Um novo método para a análise de Pentosan presentes na biomassa de juta e sua conversão em monômeros de açúcar usando ácido líquido iônico

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Elevado-throughput, microescala protocolo para a análise de parâmetros de processamento e qualidades nutricionais em milho (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...