The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

1. Alta-throughput determinazione del glucosio e xilosio rendimenti seguito enzimatica saccarificazione 9,29 <ol><li> Preparazione del campione (macinazione, De-inamidatura, estrazione, pretrattamento) <ol><li> Macinare almeno 300 mg di ciascun campione biomassa utilizzando un mulino Wiley, tale che le particelle passano attraverso una maglia 20 (850 micron) schermo. Trasferimento a zip-top sacchetti antistatici (in genere con codici a barre) e le informazioni sul campione record al database di codici a barre. </li><li> Aggiungere circa 250 mg o più di biomassa terra da sacchetto antistatico di un numerato (con la matita, non utilizzare inchiostro o pennarello) sacchetti da tè, con attenzione arrotolare le bustine di tè, facendo attenzione a piegare le estremità sopra la biomassa per prevenire perdita durante il de-inamidatura ed estrazione. </li><li> Avvolgere la bustina chiusa con filo di rame ricoperto di stagno. Registrare il numero bustina di tè per ogni campione con codice a barre. </li><li> Preparare la soluzione enzimatica de-starching da enzimi commerciali (tipicamente, 0,25% (v / v) glucoamilasi (~ 1.600 AGU / L) e1,5% (v / v) alfa-amilasi (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M di acetato di sodio (pH 5,0)). Preparare 16 ml per g di massa biomassa o 500 ml per 120 campioni bustina. Nota: Carichi in grado di rimuovere l&#39;amido di biomassa a terra dovrebbero essere determinati empiricamente da test per l&#39;amido dopo la digestione con una gamma di carichi di enzimi e di rapporti. </li><li> In un contenitore di plastica, aggiungere 16 ml di soluzione di de-starching enzimatica per 1 g di massa biomassa terra. Per un protocollo de-inamidatura batch, aggiungere 120 bustine a 500 ml di soluzione tampone-enzima. </li><li> Incubare in un agitatore a 55 ° C per 24 (± 4) ore, a 120 rpm per rimuovere possibili amido. </li><li> Dopo il de-starching incubazione, risciacquare e immergere la biomassa in diversi litri di acqua deionizzata per 30 minuti. Ripetere questo processo due volte per rimuovere i sali tampone che possono causare urti (formazione di bolle di gas nella soluzione che può portare a un improvviso e violento aumento del livello della soluzione, provocando etanolo liquido caldo a cascatafuori dal recipiente di reazione) durante l&#39;estrazione. </li><li> Dopo il risciacquo completo della biomassa de-inamidato, posizionare le bustine nella colonna di estrazione Soxhlet. Non è richiesta alcuna ditale per questo passo. </li><li> Impostare il reflusso Soxhlet, con il 95% di etanolo ed estrarre i campioni per 24 ore. </li><li> Rimuovere le bustine dal reattore Soxhlet e diffondere in un unico strato su un vassoio piatto. </li><li> Consentire ai campioni di asciugare durante la notte a temperatura ambiente in una cappa aspirante. </li><li> Srotolare le bustine e riportare la biomassa secca di sacchetti antistatici codice a barre originali. Nota: I sacchetti antistatici sono efficienti nel ridurre l&#39;elettricità statica nella biomassa, migliorando le caratteristiche di maneggevolezza. Se vengono utilizzate altre opzioni di archiviazione, ulteriore biomassa può essere necessaria a causa della biomassa aggrapparsi al lato del contenitore di stoccaggio. </li><li> Trasferire almeno 50 mg della biomassa essiccata in una tramoggia di codice a barre (usando più materiale è migliore per un dosaggio accurato). Spossono codici a barre dei sacchetti antistatici e la tramoggia di ricezione al fine di garantire il monitoraggio accurato del campione. </li><li> Tramogge caricare su solidi di peso del robot, prestando molta attenzione all&#39;ordine dei campioni nel rack. Caricare piastre reattore sufficiente per contenere tutti i campioni e selezionare il protocollo di dosaggio in base al numero di lastre utilizzate. </li><li> Pesare robotizzato 5 mg di campioni essiccati (± 0,3 mg) in acciaio inox piastre a 96 pozzetti resistenti agli acidi. Pesare 3 repliche di ciascun campione distribuite intorno alla piastra per ridurre al minimo eventuali variazioni localizzate. </li><li> Includere 8 campioni di controllo di biomassa di un materiale standard di biomassa ben caratterizzato, al fine di monitorare le prestazioni del dosaggio. In caso di più targhe, l&#39;utilizzo di più tramogge biomasse standard di ridurre al minimo la dimensione delle particelle deriva causata dal setacciando nelle tramogge sopra cicli ripetuti di erogazione. Nota: In ogni piatto, non ci dovrebbero essere 24 campioni con 3 repliche, 4 spazi vuoti consistenti di acqua deionizzata e l&#39;enzima, e 8 Controls, utilizzando la biomassa normale precedentemente caratterizzati. Le 3 pozzetti angolo di ciascuno dei 4 angoli della piastra sono riservati per gli standard di zucchero. </li><li> Assegno in bianco e zucchero pozzi standard, per le particelle di biomassa erranti e rimuovere, se presenti. </li><li> Aggiungere 250 ml di acqua deionizzata a ogni bene, e sigillare le piastre con politetrafluoroetilene silicone adesivo-backed (PTFE) Nastro. </li><li> Utilizzando un &quot;suggerimento saldatore 1/8, forare il nastro in PTFE in ciascun porto vapore (117 in totale) per ogni piatto. Utilizzare un piatto vuoto impilati su piastra reattore sigillato come guida e per limitare il movimento di PTFE pellicola. </li><li> Fissare le piastre saldamente con 0,031 &quot;guarnizioni spesse vetroresina PTFE (pre-perforati con fori per i porti di vapore) fra piatti e piatti vuoti sulla parte superiore e inferiore della pila. Pretrattare i campioni utilizzando un reattore a vapore per 180 ° C per 17,5 min, o altre combinazioni di temperatura / tempo in base alla gravità desiderata. </li><li> Piastre reattore Raffreddare a 50 °; C da inondazioni con acqua deionizzata. </li></ol></li><li> Enzimatica Saccarificazione <ol><li> Preparare una soluzione di saccarificazione enzimatica composto dell&#39;8% (v / v) in soluzione enzimatica 1.0 M sodio citrato, pH 5,0. Preparare 5 ml per piastra reattore. Nota: è necessaria la diluizione deve essere determinato sulla base di attività e di proteine ​​della soluzione di riserva enzima specifico. </li><li> Quando le piastre sono fresche, li centrifugare in un rotore secchio oscillante a 1.500 xg per 20 min. Rimuovere la pellicola sigillante. Nota: Queste piastre sono pesanti e le specifiche centrifuga devono essere controllate per la compatibilità. </li><li> Aggiungere 40 ml di soluzione enzimatica magazzino 8% in ogni pozzetto (70 mg enzimatica per g di biomassa). </li><li> Richiudere con il nuovo nastro in PTFE. Mettere piatto sigillato nel morsetto piastra magnetica. </li><li> Mescolare delicatamente i campioni per inversione (almeno 15 volte), e incubare a 50 ° C per 70 ore. </li><li> Quando la saccarificazione ha concluso, mescolare per inversione e centrifugare le piastre a 1.500 xg per 20 min. </li></ol></li><li> Zucchero Assay <ol><li> Preparare una serie di 6 glucosio e xilosio combinato standard di calibrazione a 0.014 tampone M citrato (pH 5,0) va da 0 a 0.750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 e 0,75 mg / ml raccomandato) e da 0 a 0.600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 e 0,6 mg / ml raccomandato) per il glucosio e xilosio, rispettivamente. </li><li> Preparare il glucosio ossidasi / perossidasi (goPod) e xilosio deidrogenasi (XDH) reagenti in base alle istruzioni contenute nel kit. </li><li> Usando una pipetta, rimuovere 200 ml di liquido dai 4 pozzi d&#39;angolo e pozzi bordo adiacente ai pozzetti d&#39;angolo (12 pozzi totali) della piastra reattore. </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 ml di acqua deionizzata a ciascun pozzetto di una piastra di diluizione a fondo piatto di polistirene da 96 pozzetti. Non aggiungere acqua ai pozzi d&#39;angolo standard e 12 di zucchero (rimuovere quei suggerimenti se si utilizza una testina a 96 canali). </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri goPod di reagente in ogni pozzetto del saggio del glucosio plmangiò. </li><li> Usando una pipetta, dispensare 180 microlitri XDH reagente a ciascun pozzetto della piastra di test xilosio. </li><li> Usando una pipetta, 20 ml aliquote di idrolizzato dalla piastra del reattore a 96 pozzetti per piastra di diluizione. Pipettare dalla sezione superiore dei pozzetti per evitare solidi biomassa e liquido residuo in pozzi angolo. Mescolare triturazione per almeno 10 cicli. </li><li> Usando una pipetta, 110 ml di standard di zucchero, in duplice copia, per i pozzi d&#39;angolo della piastra di diluizione. </li><li> Usando una pipetta, trasferire 20 microlitri aliquote dalla piastra di diluizione alla glucosio e xilosio piastre test. Miscelare triturazione. </li><li> Incubare le piastre di glucosio e xilosio test a temperatura ambiente per 30 min. Rompere con attenzione tutte le bolle di superficie prima della lettura. Una pistola termica brevemente passato sopra la superficie della piastra funziona bene. </li><li> L&#39;utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d&#39;onda misurata a 510 nm e registrare l&#39;assorbanza contro un bianco reagente.Questa misura monitora la formazione di quinonimine, che è proporzionale alla concentrazione di glucosio. La concentrazione di glucosio è calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1. </li><li> L&#39;utilizzo di un lettore di piastre a 96 pozzetti ultravioletta / visibile, impostare la lunghezza d&#39;onda misurata a 340 nm e registrare l&#39;assorbanza. Questa misura monitora la riduzione di NAD + in NADH, che è proporzionale alla concentrazione xilosio. La concentrazione xilosio viene calcolata dalla curva di calibrazione in base agli standard di taratura preparate al punto 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. Alta-throughput Determinazione del totale lignina e lignina Monomerico contenuti utilizzando pyMBMS 28 <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Macinare ed estrarre la biomassa utilizzando i metodi descritti nei passaggi 1.1.1, e 1.1.6-1.1.8. Questo include macinazione e l&#39;estrazione di una serie di standard da utilizzare come controlli sperimentali. Nota: Il measur pyMBMSements non granulometria dipende, quindi se solo utilizzando il protocollo pyMBMS, preparazione biomassa devono essere effettuate per consentire al campione di essere introdotto nel portacampioni, &lt;4 mm. </li><li> Utilizzando una spatolina erogazione circa 4 mg (da 3 a 5 mg preferiti) della biomassa preparato in una tazza di acciaio inossidabile 80 microlitri progettato per l&#39;auto-campionatore. </li><li> Assicurarsi che almeno il 10% dei campioni analizzati sono in fase di norme di controllo, come quelli disponibili presso il National Institute of Standards and Technology (canna da zucchero bagassa-8491, pioppo-8492; pino-8493, o paglia di grano-8494). Lo standard può anche essere qualsiasi specie analoghe ai campioni da analizzare che sono già stati caratterizzati utilizzando metodi standard. </li><li> Caricare in modo casuale i campioni nelle tazze di auto-campionatore con una pinzetta per evitare distorsioni a causa di possibili derive spettrometro nel corso del tempo. Nota: Un tipico randomizzazione dei campioni dovrebbe includere la misurazione di tutti i campioni una volta, seguita da una ri-randomizzazionedell&#39;ordine dei campioni per la misurazione duplicato. Programmi di randomizzazione sono disponibili online. </li><li> Usando un hole-pugno di serie, produrre manualmente dischi filtranti di vetro dal tipo fogli A / D in fibra di vetro, senza legante. Tenere il filtro in fibra di vetro rotondo con pinzette, centrare la tazza campione e spingere nel campione con una chiave a brugola da 3,5 mm per confinare il materiale in ogni tazza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Protocollo strumentale <ol><li> Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando uno standard noto che ha intensità dei picchi sull&#39;intera gamma di composti che possono esistere per i campioni sperimentali. Per i campioni tipici di biomassa, utilizzare perfluorotributilammina (PFTBA). </li><li> Impostare la portata del gas di trasporto elio a 0,9 L / min usando un misuratore di flusso del gas. </li><li> Impostare il forno autocampionatore ad una temperatura di pirolisi di 500 ° C e la temperatura di interfaccia a 350 ° C utilizzando il software autocampionatore. Nota: riscaldata A &quot;in acciaio inox 08/01linea di trasferimento di calore avvolto in nastro che collega l&#39;autocampionatore al spettrometro di massa viene controllata tramite un regolatore di calore a 250 ° C. </li><li> Inizia acquisizione dati sulla spettrometro di massa e attendere almeno 60 secondi per ottenere dati sufficienti per la raccolta sfondo spettri. </li><li> Avviare il metodo di auto-campionatore automatico con le specifiche da 2.2.2. Nota: L&#39;autocampionatore gocce ogni campione singolarmente nella fornace autocampionatore. Il tempo totale di acquisizione dei dati è di circa 1,5 minuti; tuttavia, pirolisi di un tipico campione 4 mg è completa dopo 30 sec. </li><li> Record tenore totale di ioni (TIC) di ogni campione utilizzando software spettrometro di massa a velocità di scansione di 0,5 sec. Record intensità tra m / z 30-450. Nota: composti biomassa tipiche usano ionizzazione morbido a 17 eV. Lo strumento può registrare grandi intervalli di m / z 1 a 1.000; tuttavia, velocità di scansione sarà limitata dalla potenza della CPU del computer. </li><li> Rimuovere sfondo dagli spettri utilizzando la manuale migliorare funzione del software. Nota: Una porzione 60 di scansione della linea di base all&#39;inizio di raccolta dati vengono usati per calcolare un valore medio di sfondo. Questo spettri medi sfondo viene rimossa dal campione sperimentale spettri automaticamente nel software spettrometro di massa. </li><li> Importare il file di testo unico colonna creata dal software spettrometro di massa contenente i dati spettrali per ciascun campione, in un programma di database e combinare tutti i campioni in un database. Aggiungere qualsiasi metadati applicabile al foglio di calcolo. Importare i dati formattati (foglio elettronico di file / CSV) in un pacchetto software statistico e significa normalizzare gli spettri per tenere conto di variazioni nelle masse campione pirolizzati. </li><li> Utilizzare un pacchetto software statistico per eseguire una analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando i dati spettrali per analizzare raggruppamento dei campioni standard replicati utilizzati nelle valutazioni, nonché per valutare quali picchi solidali alla classificazione di chimicacomposti nelle carichi tramano 28. Nota: i gruppi PCA campioni basati sulla somiglianza dei loro spettri, e permette un controllo degli standard per misurare errore sperimentale derivante da strumenti deriva durante la corsa. </li><li> Per calcolare il syringyl lignina (S) / guaiacyl (G) rapporto, sommare le aree dei picchi S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, e 210) e dividere per la somma dei picchi G a 124, 137, 138, 150, 164, e 178. </li><li> Per calcolare il contenuto totale di lignina, sommare i picchi lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, e 210. </li><li> Calcolare un fattore di correzione per la misura di scala pyMBMS ad un metodo standard per la stima lignina totale, come Klason lignina. Dividere il valore di lignina Klason dello standard individuale per il tenore totale lignina misurato per il campione standard utilizzando pyMBMS. </li><li> Applicare questo fattore di correzione per tutte come specie nel set di dati. Ripetere per ogni tipo di biomassa analizzato. Nota: Il fattore di correzione può variare notevolmente in base al S / G della biomassa analizzato. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).</li><li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).</li><li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil.">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li><li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production.">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy:+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques.">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li><li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioacidolysis+of+lignin:+comparison+with+acidolysis.">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li><li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass.">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses.">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification.">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li><li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass,+pretreatments,+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release.">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li><li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li><li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS.">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li><li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors.">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li><li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover.">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li><li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy.">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li><li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy.">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li><li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production.">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility.">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li><li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+S/G+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis.">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+multivariate+analysis:+a+comparison+between+mid-infrared,+near-infrared,+and+Raman+spectroscopies+for+model+development.">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).</li><li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy.">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+syringyl:guaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy.">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le fasi di preparazione del campione chiave per ottenere dati accurati e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti di screening high-throughput sono i seguenti: Zucchero saggio di rilascio: In generale, i campioni sono preparati in lotti che vanno da poche decine a diverse migliaia per volta. Ogni punto importante è tipicamente effettuata per tutti i campioni prima di andare avanti al fine di minimizzare le variazioni in preparazione tra i campioni. De-ina...

Mentre l&#39;offerta mondiale di combustibili non rinnovabili e loro prodotti associati declino, gli scienziati sono stati messi in discussione per creare carburanti e sostanze chimiche simili da fonti di origine vegetale 1. Un aspetto chiave di questo lavoro è determinare quali specie di piante possono essere adatti per la produzione di biocarburanti e biomateriali 2,3. Tipicamente, queste materie prime vengono valutati per la lignina, cellulosa, emicellulosa e contenuti; nonché la loro suscettibilità alla destrutturazione (recalcitrance) attraverso pretrattamento termico, meccanico e / o chimico con o senza successiva saccarificazione enzimatica. Analisi più dettagliate sono utilizzati per determinare la composizione specifica della lignina ed emicellulosa frazioni nonché attività ottimali enzima necessario. Modificazioni transgeniche di piante che non possiedono intrinsecamente caratteristiche ideali per la conversione biochimica o termochimica di merci desiderati hanno fornito ai ricercatori una fonte notevolmente ampliato di pentolaprefe- materie prime 4. I metodi di analisi standard per quantificare le caratteristiche chimiche di un impianto, mentre molto utile per piccole serie di campioni, sono inadatti per lo screening rapido di centinaia o migliaia di campioni 5-7. I metodi qui descritti HTP sono stati sviluppati per valutare rapidamente ed efficacemente un gran numero di varianti di biomassa per i cambiamenti nella parete cellulare recalcitrance al degrado termochimico e / o enzimatico. E &#39;fondamentale capire che i test di screening HTP qui descritti non sono state progettate per massimizzare la conversione o la resa. L&#39;obiettivo è quello di determinare differenze relative recalcitrance intrinseca dei campioni relativa alla biomassa. Come risultato, molte delle fasi di analisi differiscono dai saggi &quot;tipici&quot; di conversione di biomassa, in cui l&#39;obiettivo è di ottenere massima velocità di conversione o portata. Ad esempio, inferiori gravità pretrattamento e tempi di idrolisi enzimatica più brevi sono usati per massimizzare differirerenze tra i campioni. Nella maggior parte dei casi, carichi relativamente elevati enzimi sono utilizzati per ridurre le differenze dovute a variazioni sperimentali dell&#39;attività enzimatica, che potrebbero falsare i risultati in modo significativo. Tecniche rapide per determinare la composizione delle pareti cellulari delle piante e gli zuccheri monomerici liberato dopo saccarificazione enzimatica includono la robotica, personalizzati, piastre a 96 pozzetti termochimico compatibili, e modifiche di metodi di laboratorio standard 8-11 e protocolli strumentali, come la spettroscopia vibrazionale (infrarosso (IR), nel vicino infrarosso (NIR), o Raman) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) 12-17. Queste metodologie sono fondamentali per isolare le materie prime ad alto o basso contenuto di cellulosa lignina, o quelli previsti per garantire la massima glucosio, xilosio, etanolo, ecc Questi metodi hanno permesso analisi rimpiccioliti che utilizzano minori quantità di biomassa e di consumo, con conseguente riduzione della sperimentazione spesa 18 </sup&gt;. Un&#39;altra caratteristica di questo approccio metodologico è che varie condizioni sperimentali possono essere rapidamente, e in alcuni casi contemporaneamente, valutata. Ad esempio, una varietà di differenti strategie di pretrattamento o cocktail di enzimi può essere testato, permettendo parametri sperimentali più ottimali per essere rapidamente identificati e impiegati. Materie prime popolari, come paglia del mais 9, pioppo 8,10, canna da zucchero canna da zucchero 8, e il panico verga 8 sono state valutate con successo con questi metodi HTP. Lignina totale e composizione monomerica lignina sono anche comunemente quantificati tratti biomassa. La riduzione del contenuto di lignina hanno dimostrato di aumentare la digeribilità enzimatica di polisaccaridi 19,20. Il ruolo che il rapporto monomerica lignina (spesso riportato come syringyl / guaiacyl (S / G) contenuto) gioca nella decostruzione della parete cellulare vegetale è ancora sotto inchiesta. Alcuni report hanno indicato che riduzioni della S / Grapporto ha portato a un incremento delle rese di glucosio successiva all&#39;idrolisi 21, mentre altri studi svelano la tendenza opposta 19,22. Metodi High Throughput per la valutazione lignina e dei suoi monomeri comprendono spettroscopia vibrazionale (IR, NIR, Raman e 23-26) accoppiata con analisi multivariata, e pirolisi spettrometria di massa a fascio molecolare (pyMBMS) 27,28. Quando lo sviluppo di metodi di screening per HTP biomassa, diverse considerazioni integrali devono essere tenuti in considerazione. Un aspetto fondamentale è la complessità del metodo. Qual è il livello di abilità richiesto per la tecnica? Analisi chemometric, per esempio, richiedono competenze specifiche per la costruzione, la valutazione, e il mantenimento di modelli predittivi. I metodi standard presentano indesiderati fasi di analisi preparatoria o dati o utilizzano reagenti tossici. Sviluppo dei modelli è un processo continuo in cui i nuovi dati vengono incorporati nel modello nel tempo per aumentare la robustezza del modello. Un&#39;altra considperazione è il risparmio di costi e una diminuzione tempi di analisi sperimentale dei metodi high-throughput proposti. Se il metodo è abbastanza rapida, ma molto costosa, non può essere una tecnica praticabile per molti laboratori di adottare. I metodi illustrati in questo manoscritto sono varianti di tecniche standardizzate, modificate per amplificare le capacità di throughput. Questi protocolli quantitativamente misurano i tratti di biomassa di interesse senza richiedere lo sviluppo di modelli predittivi. Questa è una caratteristica fondamentale di queste tecniche, poiché metodi predittivi, mentre esibendo forti correlazioni con l&#39;analisi standard utilizzata per sviluppare i modelli, non sono precisi come effettivamente misurare la quantità di interesse per i campioni. Considerando che i metodi utilizzati sono sostanzialmente ridimensionato le versioni di metodi analitici standard di bench-scala, accuratezza e precisione sono negoziati per la velocità e il throughput. Per lo più, questo risultato è dovuto ad errori più elevati in piccolo pipettaggio volume e di peso; così come una maggiore sampia eterogeneità dimensione del campione è diminuita. Mentre le grandi serie di campioni possono essere esaminati e confrontati, grande attenzione deve essere esercitata quando si effettua il confronto tra campagne distinte e ai risultati panca scala. La maggior parte delle fasi dispendiose comportano la manipolazione fisica della biomassa. Campioni di rettifica può richiedere diversi minuti per campione, compresa la pulizia fuori del mulino tra i campioni. Caricamento manuale, scarico, e tramogge di pulizia e riempimento e svuotamento bustine di tè e sacchetti di campionamento è anche molto alta intensità di lavoro. Mentre ogni passaggio potrebbe richiedere un minuto o più, fare migliaia di campioni possono richiedere molte ore o persino giorni. I robot possono caricare un piatto tipico reattore con biomassa in circa 3 a 4 ore o 6 per 8 piastre giorno -1 robot -1. Questa situazione dipende dai parametri di precisione utilizzati nonché il tipo e la quantità di biomassa da testare. Riempimento reattore piastre con acqua, acido diluito, o enzima viene rapidamente fatta usando un robot manipolatore liquido. Pritrattamento di una piastra pila (da 1 a 20 piastre reattore) dura tra 1 e 3 ore durante il montaggio, raffreddare e smontaggio è inclusa. Idrolisi enzimatica dura 3 giorni e l&#39;analisi zucchero richiede circa 1 ora di tempo di preparazione, più 10 minuti per piastra reattore per completare il test e leggere i risultati. Un programma settimanale di set di pretrattamento e di analisi giorni ospita un programma di lavoro ragionevole, riducendo al minimo dispari ore e week-end sforzi per la componente umana del test e consentono l&#39;elaborazione ~ 800 a 1.000 campioni settimana su base continuativa. La velocità massima dipende da diversi fattori, soprattutto la quantità di hardware (robot, reattori piatti, etc.) e la quantità di &quot;software&quot; (vale a dire, il personale) sono a disposizione per fare il lavoro manuale. Il limite superiore è pratico 2.500 a 3.000 campioni / settimana; tuttavia, che la produzione richiede operazione 7 giorni a settimana e più stagisti e tecnici degli studenti. In confronto, 3.000 campioni mediante HPLC richiederebbe circa 125 giorni di samanalisi ple più del lavoro aggiuntivo di pesare manualmente i campioni in reattori e campioni di filtraggio prima dell&#39;analisi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

L&#39;effetto combinato del pretrattamento termochimica e successiva saccarificazione enzimatica è misurata in funzione della massa di glucosio e xilosio rilasciato alla fine del test. I risultati sono riportati in termini di milligrammi di glucosio e xilosio rilasciato per grammo di biomassa. Ciò è in netto contrasto con i dati riportati da saggi di bench-scala, che di solito è riportato come percentuale rendimento teorico basato sull&#39;analisi compositiva del materiale di partenza. Poiché non è ancora pratico ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release at JoVE.com

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K Views.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Video: High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ricerca

Ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Screening Semi-High Throughput per potenziale siccità-tolleranza Lattuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) germoplasma Collezioni

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

Il pretrattamento di lignocellulosica biomassa con basso costo Liquidi Ionici

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

Impenitta di espansione della fibra di Ammonia (AFEX) di biomassa lignocellulosica

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Un nuovo metodo per l'analisi di pentosano presente nella biomassa di iuta e la relativa conversione in monomeri di zucchero utilizzando acido liquido ionico

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Alto-rendimento, Microscale protocollo per l'analisi dei parametri di elaborazione e qualità nutrizionali in mais (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...