The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

1. à haut débit détermination du glucose et du xylose rendements suivants enzymatique saccharification 9,29 <ol><li> Préparation de l&#39;échantillon (Grincement, De-amidonnage, Extraction, prétraitement) <ol><li> Broyer au moins 300 mg de chaque échantillon de la biomasse en utilisant un broyeur Wiley, de telle sorte que les particules passent à travers un tamis 20 format (850 um). Transfert à l&#39;anti-statiques zip-top sacs (généralement un code-barres) et de l&#39;information de l&#39;échantillon d&#39;enregistrement pour la base de données de codes à barres. </li><li> Ajouter environ 250 mg ou plus de la biomasse du sol du sac anti-statique à une numérotée (avec un crayon, ne pas utiliser de l&#39;encre ou un marqueur) sachet de thé, soigneusement retrousser les sachets de thé, en étant sûr de plier les extrémités sur la biomasse pour empêcher perte au cours de-amidonnage et de l&#39;extraction. </li><li> Enveloppez le sachet fermé à l&#39;aide de fil de cuivre étamé. Notez le numéro de sachet de thé pour chaque échantillon à code-barres. </li><li> Préparer la solution de-amidonnage enzyme parmi les enzymes commerciales (typiquement, 0,25% (v / v) de la glucoamylase (~ 1 600 AGU / L) et1,5% (v / v) d&#39;alpha-amylase (~ 2,900 KNU-S / L) dans 0,1 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,0)). Préparer 16 ml par g de biomasse en vrac ou 500 ml par 120 échantillons de sachets de thé. Note: Les chargements capables d&#39;éliminer l&#39;amidon à partir de biomasse au sol doivent être déterminées empiriquement en testant pour l&#39;amidon après digestion avec une gamme de charges d&#39;enzymes et des ratios. </li><li> Dans un récipient en plastique, ajouter 16 ml de solution d&#39;enzyme de-amidonnage pour 1 g de biomasse en vrac du sol. Pour un protocole de-amidonnage lot, ajouter 120 sachets à 500 ml de la solution tampon enzyme. </li><li> Incuber dans un agitateur à 55 ° C pendant 24 (± 4) heures, à 120 rpm pour éliminer l&#39;amidon possible. </li><li> Après l&#39;amidonnage de-incubation, rincer et laisser tremper la biomasse dans plusieurs litres d&#39;eau déminéralisée pendant 30 min. Répétez ce processus deux fois de plus pour éliminer les sels de tampons qui peuvent causer de supplantation (formation de bulles de gaz dans la solution qui peut se traduire par une hausse soudaine et violente dans le niveau de la solution, ce qui provoque l&#39;éthanol liquide chaud à cascadehors du récipient réactionnel) lors de l&#39;extraction. </li><li> Après le rinçage exhaustive de la biomasse de-amidonné, placer les sachets de thé dans la colonne Soxhlet pour l&#39;extraction. Aucune cosse est nécessaire pour cette étape. </li><li> Mettre en place le reflux Soxhlet, en utilisant 95% d&#39;éthanol et d&#39;extraire les échantillons pendant 24 heures. </li><li> Retirez les sachets de thé du réacteur Soxhlet et d&#39;étaler en une seule couche sur un plateau. </li><li> Laisser les échantillons sécher toute la nuit à la température ambiante dans une hotte. </li><li> Dérouler les sachets de thé et de retourner la biomasse sèche pour les sacs antistatiques code-barres originaux. Remarque: Les sacs antistatiques sont efficaces pour réduire l&#39;électricité statique dans la biomasse, améliorer les caractéristiques de manipulation. Si d&#39;autres options de stockage sont utilisés, de la biomasse supplémentaire peut être nécessaire en raison de la biomasse attachement au côté du récipient de stockage. </li><li> Transférer au moins 50 mg de la biomasse sèche à une trémie à code-barres (en utilisant plus de matériel est mieux pour la distribution précise). Speuvent codes à barres de sacs anti-statique et la trémie de réception pour assurer le suivi des échantillons précis. </li><li> Charger les trémies sur des solides pesant robot, en accordant une attention à l&#39;ordre des échantillons dans les racks. Chargez suffisamment de plaques de réacteur pour contenir tous les échantillons et sélectionnez le protocole de distribution basé sur le nombre de plaques utilisées. </li><li> Robotisé peser 5 mg des échantillons séchés (± 0,3 mg) en acier inoxydable de plaques à 96 puits résistant à l&#39;acide. Peser 3 répétitions de chaque échantillon distribué autour de la plaque afin de minimiser les variations localisées. </li><li> Inclure les 8 échantillons de contrôle de la biomasse d&#39;un matériau standard biomasse bien caractérisé afin de suivre les performances du test. Pour plusieurs plaques, l&#39;utilisation de plusieurs trémies de biomasse norme minimiser la dérive de taille de particules provoquée par tamisage dans les trémies sur des cycles répétés de distribution. Remarque: Dans chaque assiette, il devrait y avoir 24 échantillons avec 3 répétitions, 4 blancs constituées d&#39;eau déminéralisée et de l&#39;enzyme, et 8 controls, en utilisant la biomasse norme précédemment caractérisé. Les 3 puits d&#39;angle de chacun des 4 coins de la plaque sont réservés aux normes de sucre. </li><li> Vérifiez puits standard blanc et sucre pour les particules de biomasse errants et enlever le cas échéant. </li><li> Ajouter 250 pi d&#39;eau déminéralisée à chaque puits, et sceller les plaques avec polytétrafluoroéthylène adhésif silicone à des créances (PTFE). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un &quot;tip 1/8 de fer à souder, percer le ruban PTFE à chaque port de vapeur (117 au total) pour chaque plaque. Utilisez une assiette vide empilés sur scellée plaque de réacteur comme un guide et de restreindre PTFE mouvement de film. </li><li> Fixer les plaques étroitement avec 0.031 joints &quot;d&#39;épaisseur de verre renforcé de PTFE (pré-perforées avec des trous pour les ports de vapeur) entre les plaques et les assiettes vides en haut et en bas de la pile. Prétraiter les échantillons en utilisant un réacteur à vapeur réglée à 180 ° C pendant 17,5 min, ou d&#39;autres combinaisons de température / temps selon la gravité souhaitée. </li><li> Plaques de réacteur Refroidir à 50 °; C par les inondations avec de l&#39;eau déminéralisée. </li></ol></li><li> Saccharification enzymatique <ol><li> Préparer une solution de saccharification enzymatique constitué de 8% (v / v) de solution d&#39;enzyme dans 1,0 M de citrate de sodium, pH 5,0. Préparer 5 ml par plaque de réacteur. Remarque: dilution nécessaire doit être déterminé sur la base de l&#39;activité et de la teneur en protéines de la solution spécifique stock enzyme. </li><li> Lorsque les plaques sont cool, centrifuger dans un seau rotor oscillant à 1500 g pendant 20 min. Retirez le film d&#39;étanchéité. Note: Ces plaques sont lourds et les spécifications de centrifugeuses doivent être vérifiés pour la compatibilité. </li><li> Ajouter 40 ul de la solution enzymatique du stock de 8% à chaque puits (70 mg d&#39;enzyme par g de biomasse). </li><li> Refermer avec le nouveau ruban PTFE. Placez la plaque scellée dans plaque magnétique pince. </li><li> Mélanger délicatement les échantillons par inversion (au moins 15 fois), et incuber à 50 ° C pendant 70 heures. </li><li> Lorsque la saccharification a conclu, mélanger par inversion et centrifuger les plaques à 1500 xg pendant 20 min. </li></ol></li><li> Composition de sucre <ol><li> Préparer un ensemble de six glucose et xylose combiné standards d&#39;étalonnage dans un tampon 0,014 M de citrate (pH 5,0) allant de 0 à 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, et 0,75 mg / ml recommandé) et de 0 à 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 et 0,6 mg / ml recommandé) pour le glucose et le xylose, respectivement. </li><li> Préparer la glucose oxydase / peroxydase (goPod) et le xylose déshydrogénase (XDH) réactifs selon les instructions dans le kit. </li><li> En utilisant une pipette, retirer 200 ul de liquide à partir des 4 puits et les puits de coin de bord adjacentes aux puits de coin (12 puits au total) de la plaque de réacteur. </li><li> En utilisant une pipette, distribuer 180 pi d&#39;eau déminéralisée à chaque puits d&#39;un fond plat plaque de dilution de polystyrène de 96 puits. Ne pas ajouter de l&#39;eau à la norme et coin puits 12 de sucre (supprimer ces conseils si vous utilisez une tête à 96 canaux). </li><li> En utilisant une pipette, distribuer 180 ul réactif goPod à chaque puits du dosage du glucose plmangé. </li><li> En utilisant une pipette, distribuer 180 ul réactif XDH à chaque puits de la plaque d&#39;essai de xylose. </li><li> En utilisant une pipette, transférer 20 ul aliquotes hydrolysat de la plaque de réacteur de 96 puits à la plaque de dilution. Pipeter de la partie supérieure du puits à éviter matières solides de biomasse résiduelle et le liquide dans les puits d&#39;angle. Mélanger par trituration pendant au moins 10 cycles. </li><li> En utilisant une pipette, transférer 110 pi de normes de sucre, en double exemplaire, dans les puits d&#39;angle de la plaque de dilution. </li><li> En utilisant une pipette, transférer 20 ul de parties aliquotes de la plaque de dilution de glucose et xylose les plaques d&#39;essai. Mélanger par trituration. </li><li> Incuber les dosages de glucose et de xylose plaques à température ambiante pendant 30 min. Cassez délicatement les bulles de surface avant de lire. Un pistolet thermique brièvement passé au-dessus de la surface de la plaque fonctionne bien. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 96 puits lecteur de plaque ultraviolet / visible, régler la longueur d&#39;onde mesurée à 510 nm et enregistrer l&#39;absorbance contre un blanc de réactif.Cette mesure surveille la formation de la quinone-imine, qui est proportionnelle à la concentration en glucose. La concentration en glucose est calculée à partir de la courbe d&#39;étalonnage sur la base des standards d&#39;étalonnage préparées dans 1.3.1. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 96 puits lecteur de plaque ultraviolet / visible, régler la longueur d&#39;onde mesurée à 340 nm et enregistrer l&#39;absorbance. Cette mesure surveille la réduction de NAD + en NADH, qui est proportionnelle à la concentration en xylose. La concentration en xylose est calculée à partir de la courbe d&#39;étalonnage sur la base des standards d&#39;étalonnage préparées dans 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. à haut débit Détermination du total de lignine et de la lignine contenu monomère Utilisation pyMBMS 28 <ol><li> La préparation des échantillons <ol><li> Broyer et extraire la biomasse en utilisant les méthodes décrites dans les étapes 1.1.1 et 1.1.6-1.1.8. Cela comprend le broyage et l&#39;extraction d&#39;un ensemble de normes à utiliser des contrôles expérimentaux. Remarque: Le mesur pyMBMSements ne dépendent pas de la taille des particules, de sorte que si à l&#39;aide du protocole de pyMBMS, la préparation de la biomasse doit être effectuée pour permettre à l&#39;échantillon pour tenir dans le porte-échantillon, &lt;4 mm. </li><li> En utilisant une petite spatule de distribution d&#39;environ 4 mg (5 mg à trois de préférence) de la biomasse disposé dans une coupelle en acier inoxydable de 80 ul conçu pour l&#39;auto-échantillonneur. </li><li> Veiller à ce que au moins 10% des échantillons analysés sont en cours de normes de contrôle tels que ceux disponibles auprès de l&#39;Institut National des Standards et de la Technologie (bagasse-8491; peuplier-8492; pin-8493, ou la paille de blé-8494). La norme peut également être toute espèce analogues aux échantillons à analyser qui ont déjà été caractérisés en utilisant des procédés standard. </li><li> Charger au hasard les échantillons dans les tasses échantillonneur automatique en utilisant une pince à épiler pour éviter les biais en raison de la dérive possible du spectromètre au fil du temps. Remarque: Une randomisation typique des échantillons comprendrait la mesure de tous les échantillons une fois, suivie d&#39;une re-randomisationde l&#39;ordre des échantillons de mesure double. Programmes de randomisation sont disponibles en ligne. </li><li> En utilisant un poinçon standard, produire manuellement des disques de filtre de verre à partir de type feuilles de fibre de verre A / D, sans liant. Tenez le filtre en fibre de verre ronde avec des pincettes, centrer sur la coupelle d&#39;échantillon, et pousser dans l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;une clé Allen de 3,5 mm pour confiner la matière dans chaque tasse pendant l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Protocole Instrumental <ol><li> Étalonner le spectromètre de masse en utilisant une norme connue qui a des intensités de pointe sur toute la gamme de composés qui peuvent exister pour les échantillons expérimentaux. Pour les échantillons de biomasse typiques, utiliser perfluorotributylamine (PFTBA). </li><li> Régler le taux de débit de gaz porteur d&#39;hélium à 0,9 L / min à l&#39;aide d&#39;un débitmètre de gaz. </li><li> Régler le four auto-échantillonneur à une température de pyrolyse de 500 ° C et la température de l&#39;interface de 350 ° C à l&#39;aide du logiciel d&#39;auto-échantillonneur. Remarque: Un &quot;acier inoxydable 1/8 chaufféligne de transfert enveloppé dans la bande de chaleur qui relie l&#39;échantillonneur automatique pour le spectromètre de masse est contrôlé à l&#39;aide d&#39;un contrôleur de la chaleur à 250 ° C. </li><li> Commencez acquisition de données sur le spectromètre de masse et attendre au moins 60 secondes pour obtenir suffisamment de données pour la collecte des spectres de fond. </li><li> Commencez la méthode d&#39;auto-échantillonneur automatique avec les spécifications de 2.2.2. Remarque: L&#39;échantillonneur automatique tombe chaque échantillon individuellement dans le four échantillonneur automatique. Le temps d&#39;acquisition de données totale est d&#39;environ 1,5 min; Toutefois, la pyrolyse d&#39;un échantillon typique de 4 mg est complète après 30 sec. </li><li> Le contenu de la fiche ionique total (TIC) de chaque échantillon en utilisant un logiciel de spectromètre de masse à 0,5 sec vitesse de balayage. Intensités de record entre m / z 30 à 450. Remarque: composés de la biomasse typiques utilisent ionisation douce à 17 eV. L&#39;instrument peut enregistrer des intervalles plus grands de m / z 1 à 1000; Cependant, la vitesse de balayage sera limitée par la puissance du processeur. </li><li> Retirer fond à partir des spectres en utilisant le MAnuel améliorer fonctionnalité du logiciel. Note: Une portion de 60 balayage de la ligne de base au début de la collecte de données est utilisé pour calculer une valeur de fond moyen. Ce spectre d&#39;arrière-plan moyenne est éliminée à partir des spectres de l&#39;échantillon expérimental automatiquement dans le logiciel du spectromètre de masse. </li><li> Importer le fichier de texte de la colonne unique créé par le logiciel de spectromètre de masse contenant les données spectrales pour chaque échantillon, dans un programme de base de données et de combiner tous les échantillons en une seule base de données. Ajouter les métadonnées applicable à la feuille de calcul. Importez les données formatées (feuille de calcul de fichiers / CSV) dans un logiciel de statistique et de signifier à normaliser les spectres pour tenir compte de la variation dans les masses d&#39;échantillons pyrolysées. </li><li> Utilisez un logiciel de statistique d&#39;effectuer une analyse en composantes principales (ACP) en utilisant les données spectrales pour analyser regroupement des échantillons standards répliquées utilisées dans les mesures, ainsi que d&#39;évaluer quels sommets font partie intégrante de la classification des produits chimiquescomposés dans les chargements complotent 28. Remarque: les groupes PCA les échantillons en fonction de la similitude de leurs spectres, et permet un contrôle des normes de mesurer l&#39;erreur expérimentale en raison de la dérive de l&#39;instrument pendant la course. </li><li> Pour calculer le syringyl de lignine (S) / guaiacyle (G) le rapport, la somme des aires des pics de S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, et 210) et diviser par la somme de G pics à 124, 137, 138, 150, 164, et 178. </li><li> Pour le calcul de la teneur en lignine au total, la somme des pics de lignine avec m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, et 210. </li><li> Calculer un facteur de correction pour la mesure de mise à l&#39;échelle pyMBMS une méthode standard pour estimer la lignine totale, comme Klason lignine. Diviser la valeur de la lignine Klason de la norme individuelle par la teneur totale en lignine mesurée pour l&#39;échantillon standard en utilisant pyMBMS. </li><li> Appliquer ce facteur de correction à tous comme-espèces dans l&#39;ensemble de données. Répétez l&#39;opération pour chaque type de biomasse analysé. Note: Le facteur de correction peut varier considérablement en fonction de la S / G de la biomasse analysé. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+multivariate+analysis:+a+comparison+between+mid-infrared,+near-infrared,+and+Raman+spectroscopies+for+model+development.">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).</li><li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy.">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+syringyl:guaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy.">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les principales étapes de préparation d&#39;échantillons pour obtenir des données précises et reproductibles lors de la conduite des expériences de criblage à haut débit sont les suivantes: Sucre Essai de libération: En général, les échantillons sont préparés en lots allant de quelques dizaines à plusieurs milliers à la fois. Chaque étape majeure est typiquement effectuée pour tous les échantillons avant de se déplacer vers l&#39;avant afin de...

Comme l&#39;offre mondiale de combustibles non renouvelables et de leurs produits déclins associés, les scientifiques ont mis au défi de créer des carburants et des produits chimiques similaires à partir de sources d&#39;origine végétale 1. Un aspect clé de ce travail est de déterminer quelles espèces de plantes peuvent être appropriés pour la production de biocarburants et des biomatériaux 2,3. En général, ces matières premières sont évaluées pour la lignine, la cellulose, l&#39;hémicellulose et la teneur en; ainsi que leur sensibilité à la déconstruction (récalcitrant) par un prétraitement thermique, mécanique et / ou chimique, avec ou sans saccharification enzymatique ultérieure. Des analyses plus détaillées sont utilisés pour déterminer la composition spécifique de la lignine et l&#39;hémicellulose fractions ainsi que des activités enzymatiques optimales nécessaires. Les modifications transgéniques de plantes qui ne possèdent pas intrinsèquement traits idéales pour la conversion biochimique ou thermochimique aux produits souhaités ont fourni aux chercheurs une source considérablement élargi du potmatières premières tiels 4. Les méthodes d&#39;analyse standard pour quantifier les traits chimiques d&#39;une plante, tout en étant très utile pour les petites séries d&#39;échantillons, sont inadaptés pour le dépistage rapide de centaines ou de milliers d&#39;échantillons 5-7. Les procédés décrits ici HTP ont été développés pour évaluer rapidement et efficacement un grand nombre de variantes de la biomasse à des changements dans la paroi cellulaire récalcitrant à la dégradation thermochimique et / ou enzymatique. Il est essentiel de comprendre que les essais de criblage HTP décrites ici n&#39;a pas été conçu pour maximiser la conversion ou le rendement. L&#39;objectif est de déterminer les différences relatives dans la résistance intrinsèque des échantillons de biomasse connexes. En conséquence, un grand nombre des étapes d&#39;analyse diffèrent des essais de conversion de la biomasse «typiques», où l&#39;objectif est d&#39;obtenir des taux de conversion maximal ou étendue. Par exemple, sévérités prétraitement plus faibles et la réduction des temps d&#39;hydrolyse enzymatique sont utilisés pour optimiser différerrences entre les échantillons. Dans la plupart des cas, des charges relativement élevées d&#39;enzymes sont utilisés pour réduire des écarts dus à la variation expérimentale de l&#39;activité de l&#39;enzyme, ce qui pourrait fausser considérablement les résultats. Des techniques rapides pour déterminer la composition des parois cellulaires végétales et les sucres monomères libérés suivante saccharification enzymatique comprend la robotique, personnalisés, des plaques à 96 puits thermochimique compatibles, et des modifications des méthodes de laboratoire standard 8-11 et protocoles instrumentales, telles que la spectroscopie de vibration (infrarouge (IR), dans le proche infrarouge (NIR), ou Raman) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) de 12 à 17. Ces méthodologies sont essentiels pour isoler les matières premières à forte cellulose ou le contenu de lignine faible, ou ceux qui devraient donner le plus élevé de glucose, le xylose, l&#39;éthanol, etc. Ces méthodes ont permis analyses à échelle réduite qui emploient de plus petites quantités de biomasse et de consommables, menant à des réductions dans experimental dépenses 18 </sjusqu&#39;à&gt;. Une autre caractéristique de cette approche méthodologique est que diverses conditions expérimentales peuvent être rapidement et, dans certains cas simultanément, évaluée. Par exemple, une variété de différentes stratégies de prétraitement ou cocktails d&#39;enzymes peut être testé, permettant à des paramètres expérimentaux les plus optimales pour être rapidement identifiés et utilisés. Matières premières populaires, tels que les tiges de maïs 9, le peuplier 8,10, la bagasse de canne 8, et le panic raide 8 ont été évaluées avec succès en utilisant ces méthodes de HTP. Lignine totale et de la composition monomère lignine sont aussi communément quantifiés traits de la biomasse. Il a été démontré des réductions de la teneur en lignine pour augmenter la digestibilité enzymatique de polysaccharides 19,20. Le rôle que le rapport monomère lignine (souvent signalé comme syringyl / guaiacyle (S / G) contenu) joue dans la déconstruction de la paroi cellulaire de la plante est toujours sous enquête. Certains rapports ont indiqué que les réductions dans le S / Grapport a conduit à une augmentation des rendements de glucose après hydrolyse 21, tandis que d&#39;autres études dévoilent la tendance inverse 19,22. Procédés à haut débit pour l&#39;évaluation de la lignine et de ses monomères comprennent la spectroscopie vibrationnelle (IR, NIR, Raman et 23 à 26) couplée à une analyse multivariée, et la pyrolyse faisceau moléculaire par spectrométrie de masse (pyMBMS) 27,28. Lors de l&#39;élaboration des méthodes de HTP pour le criblage de la biomasse, plusieurs considérations intégrales doivent être gardés à l&#39;esprit. Un aspect clé est la complexité de la méthode. Quel est le niveau de compétence requis pour la technique? Analyses chimiométriques, par exemple, exigent des compétences spécifiques pour la construction, l&#39;évaluation et le maintien de modèles prédictifs. Les méthodes standard présentent étapes indésirables d&#39;analyse préparatoire ou des données ou utilisent des réactifs toxiques. Développement des modèles est un processus continu où de nouvelles données sont incorporées dans le modèle au fil du temps pour augmenter la robustesse du modèle. Un autre considration est les économies et une diminution des temps d&#39;analyse expérimentale des méthodes à haut débit proposées. Si la méthode est très rapide, mais très coûteux, il peut ne pas être réalisable pour une technique de nombreux laboratoires à adopter. Les méthodes illustrées dans ce manuscrit sont des variantes des techniques normalisées, modifiés pour amplifier les capacités de débit. Ces protocoles mesurer quantitativement les traits de la biomasse d&#39;intérêt sans nécessiter le développement de modèles prédictifs. Ceci est un attribut essentiel de ces techniques, car les méthodes de prévision, tout en présentant de fortes corrélations avec la norme analyses utilisé pour développer les modèles, ne sont pas aussi précis que la mesure effectivement la quantité d&#39;intérêt pour les échantillons. Considérant que les méthodes utilisées sont essentiellement versions réduites de méthodes analytiques banc échelle standard, exactitude et la précision sont négociés pour la vitesse et le débit. Surtout, ce résultat est dû à des erreurs élevé dans les petites pipetage de volume et de pesage; ainsi que l&#39;augmentation deamplement hétérogénéité taille de l&#39;échantillon est réduite. Alors que les grandes séries d&#39;échantillons peuvent être examinés et comparés, un grand soin doit être exercé en faisant des comparaisons entre les campagnes distinctes et aux résultats l&#39;échelle du laboratoire. La plupart des étapes fastidieuses impliquent la manipulation physique de la biomasse. Échantillons de broyage peut prendre plusieurs minutes par échantillon, y compris le nettoyage de l&#39;usine entre les échantillons. Le chargement manuel, le déchargement, et les trémies de nettoyage et de remplissage et de vidange des sachets de thé et les sacs d&#39;échantillons est également très intensive en main. Bien que chaque étape peut prendre une minute ou plus, faisant des milliers d&#39;échantillons peuvent prendre plusieurs heures, voire des jours. Les robots peuvent charger une plaque de réacteur typique avec la biomasse dans environ 3 à 4 heures ou 6 à 8 plaques jour -1 robot de -1. Cette situation est fonction des paramètres de précision utilisées ainsi que le type et la quantité de biomasse à tester. Plateaux de remplissage du réacteur avec de l&#39;eau, de l&#39;acide dilué, ou enzymatique est effectué rapidement à l&#39;aide d&#39;un robot de manipulation de liquides. Pretraitement d&#39;un empilement de plaques (de 1 à 20 des plaques de réacteur) prend entre 1 et 3 heures lorsque l&#39;assemblage, refroidir, et le démontage est inclus. L&#39;hydrolyse enzymatique prend 3 jours et l&#39;analyse du sucre nécessite environ 1 h de temps de préparation ainsi que 10 minutes par plaque de réacteur pour terminer le test et lire les résultats. Un horaire hebdomadaire de prétraitement et d&#39;analyse fixées jours accueille un horaire de travail raisonnable, minimisant impair heures et le week-end des efforts pour la composante humaine de l&#39;essai et permet un traitement ~ 800 à 1000 échantillons par semaine sur une base continue. Le débit maximum dépend de plusieurs facteurs, notamment la quantité de matériel (robots, réacteurs plaques, etc.) et combien de &quot;logiciel&quot; (ie, la dotation en personnel) sont disponibles pour faire le travail manuel. La limite supérieure pratique est 2500 à 3000 échantillons / semaine; cependant, que la production nécessite l&#39;opération 7 jours par semaine et plusieurs stagiaires étudiants et techniciens. En comparaison, 3000 échantillons par HPLC exigeraient environ 125 jours de samanalyse ple plus la main-d&#39;œuvre supplémentaire de peser manuellement des échantillons dans des réacteurs et des échantillons de filtrage avant l&#39;analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

L&#39;effet combiné de la pré-traitement thermochimique et la saccharification enzymatique ultérieure est mesurée en fonction de la masse de glucose et xylose libérée à la fin de l&#39;essai. Les résultats sont rapportés en termes de milligrammes de glucose et xylose libérés par gramme de biomasse. Ceci est en contraste frappant avec les données déclarées à partir d&#39;essais banc échelle, qui est généralement déclarés comme pour cent de rendement théorique basée sur l&#39;analyse de la compositio...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K vues.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.