This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

NOT: Bu protokol FRET kullanımı fare biyolojik örneklerden tohumlama aktivitesini tespit etmek için flow sitometri vurguluyor. Aynı zamanda, rekombinant fibriller ve insan biyolojik numuneler ile uyumludur. Fare ötanazi ve beyin hasat IACUC onaylı prosedürlere uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Beyin Ekstraksiyon <ol><li> Izofluran (% 2), derin anesthetization sonra, buz soğukluğunda PBS% 0.03 heparin ihtiva eden bir fare serpmek ve Gage ve ark bilgi aşağıdaki beyin ekstrakte edin. 18 </li><li> Bir kriyo-şişe içinde ekstre doku yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurularak ek yerleştirilmesi. Alternatif olarak, kuru buz üzerinde doku dondurma. Bir kez gerekli ise, uzun bir süre için -80 ° C ve saklamak için doku transfer dondurulmuş. NOT: Bu protokol, tüm beyin homojenatlarının veya mikro kesilir beyin bölgelerinde ile uyumludur. Hagihara et al. Detaylı mikrodiseksiyon protokol 19. </li></ol&gt; Biyolojik Tohum Materyali 2. Hazırlık <ol><li> 1 x TBS (10 ml için 1 tablet) halinde proteaz inhibitörleri (serbest EDTA) içinde çözerek homojenizasyon tamponu hazırlayın. Buz üzerinde şiddetle Vortex, ve mağaza. Proteaz inhibitörleri biyosensör hücre canlılığını korumak için EDTA arındırılmalıdır. </li><li> Tek kullanımlık tartmak tekne dondurulmuş beyin dokusu tartılır ve 5 ml konik tüp transfer. Nihai çözelti,% 10 ağırlık / hacim olduğu şekilde buz soğukluğunda homojenizasyon tamponu ekleyin. Geçici buz üzerinde saklayın. Doku kitlesi ve daha sonra homojenizasyon tampon maddesi hacmi kullanılan beyin boyut ve / veya bölgeye bağlı olarak değişecektir. Burada, 0,2 g ağırlığındaki bir yetişkin farenin hemibrain% 10 ağırlık / hacim solüsyonu 2 ml içinde süspanse edilir. </li><li> Transferi soğuk odaya örnekler ve uygun ayarları bir prob sonikatör ayarlayın. (Burada gösterilen) bir Omni Ruptor ile prob sonication için numuneler ov değil emin olmak için yaklaşık 75 W. kullanın darbe modu karşılık% 20, gücü ayarlayınsonication sırasında er-ısıtmalı. Yaklaşık 500 ms tekabül eden,% 30 Pulser ayarlayın. </li><li> Yine, su, izopropanol ve su ile durulanır, her çözeltisi arasında probu silinmesi ile prob sonikatör ucu temizleyin. Durulama ve taraf ve laboratuar mendil ile prob alt hem de silmek için emin olun. </li><li> Bir seferde bir numune ile çalışma, homojenizasyon tamponu içine prob ucu daldırın ve sonikatör başlatın. Yukarıda açıklanan güç ve üreteci ayarlarını kullanma, 25 toplam bakliyat teslim. Doku süspansiyon tamamen olduğundan emin olun. Bu adımı sırasında numunenin köpüklenmesini önlemek için dikkatli olun. NOT: a) toplam hacim düşük olduğu veya b) Homojenat ısıtır eğer numuneler köpüklenme duyarlıdır. Bu özel cihaz sayesinde, 250 ul daha az hacimli ses dalgalarına maruz yoktur. Numuneler, soğutulmuş durmalarını sağlamak için, borular bu aşama esnasında buz üzerinde depolanabilir. </li><li> Artık lizat uzakta silerek temizleyin prob, daha sonra bir bardak o içine 10 bakliyat teslimf temiz su. Her bir adım arasında silinerek kurutulmuş (adım 2.4 gibi) yan kenarlarına ve tekrar su, izopropanol ve su ile prob alt durulayın. Kontaminasyonu önlemek için, iyice örnekler arasında probu durulayın. NOT: tau agrega ile, daha sıkı temizleme yöntemleri örnek-örnek kirlenmesini önlemek için gerekli olduğunu bulamadı. Diğer amiloid Bununla birlikte, literatürde geniş 20,21 tarif edilmiştir, ek bakım gerektirir. </li><li> Tüm numuneler işlendikten kadar mağaza buz üzerinde homojenatlarında. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 21.300 x g&#39;de homojenatları dönerler. </li><li> Pelet rahatsız etmemek için özen, temiz bir tüpe süpernatant aktarın. Pelet atın. Daha fazla kullanım için -80 ° C&#39;de süpernatan ve mağaza lizatları alikotu. Bu tohumlama verimini azaltır, ancak homojenatlarının donma / çözülme döngüleri kaçının. </li></ol> 3. şarjı Biyosensör Hücreler NOT:Bu deney için, dört hücre çizgileri kullanın: HEK 293T (hücre çizgisi # 1), RD-P301S-CFP (hücre çizgisi # 2), RD-P301S-YFP (3 hücre çizgisi #) ve RD-P301S-CFP / YFP ( hücre çizgisi # 4). Tahlile her hücre hattının katkılarından dolayı Tablo 1 başvurun. <ol><li> Steril bir ortamda, aspirat kültür ortamı. Sıcak PBS ve aspirat ile hücreleri durulayın. Hücreleri tripsinize edin 3 dakika boyunca (tripsin-EDTA (% 0.05), 3 ml), sıcak bir kültür ortamında (DMEM 9 ml,% 10 FBS,% 1 pen / strep,% 1 glutamax) ile söndürün ve hemen hücreleri aktarmak konik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Orta aspire ve sıcak kültür ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet. </li><li> Hemasitometre kullanılarak, her hücre hattı için hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre yoğunluğu, toplama ve yeniden süspansiye etme hacminin zamanda konfluansa bağlı olarak değişecektir. Hücre yoğunluğu, 10 mi ortam içinde% 90 konfluent bir 10 cm&#39;lik bir tabak hasat hücreleri tekrar yaklaşık 1.000.000 hücre / ml olarak. </li><li> Makehücrelerin bir ana karışımı + ortam bir 96 çukurlu bir levhanın her bir oyuğa 130 ul ortam içinde 35,000 hücre içerecek (100 kuyu için bir ana karışımı yapmak için, örneğin, 13 mi ortam içinde 3.500.000 hücreleri tekrar süspansiyon). Bireysel deneysel tasarımlar ve zaman çizelgeleri sığdırmak için hücre numarasını değiştirin. Hücre tedavisi için ~ sonra kaplama 18 saat, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35.000 hücre ekleyin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaş yavaş düz taban kısmının her bir kuyunun içine ana karışım hücre süspansiyonu 130 ul pipet doku 96 plaka kültür işlemden geçirildi. Kaplama birlikte, plakanın alt temas etmeyen, kuyunun merkezinde pipet ucu yerleştirin. Not: kaplama biçimi değiştirilebilir olmasına rağmen, hücre çizgileri plaka başına 1-3 her biri için n = 4 kuyu yapımında tavsiye edilir. Plaka (n = 84), geri kalan hücre çizgisi # 4 (biyosensör hücreleri) için ayrılmıştır. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden plaka bırakarak oturmasına izin verin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve ve O / N inkübe# 8805;% 80 bağıl nem. </li></ol> 4. tedavi edilmesi Hücreler NOT: ertesi gün, tau biyosensör hücreleri aşağıdaki gibi tohum iletim kompleksleri hazırlamak,% 60-65 konfluent: <ol><li> Bir tüp içinde, bir ana karışımı yapmak için, örneğin Opti-MEM olarak indirgenmiş serum ortamı ile, örneğin Lipofectamine gibi transfeksiyon reaktifi birleştirir. Başına iyi 1.25 ul transfeksiyon reaktif ve 8.75 ul indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Flick tüpü hafifçe kısaca karıştırın aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> Başka bir tüp içinde, indirgenmiş serum medya ile tohum malzemesi (adım 2.9 den lizatın kısım) birleştirir. Not: Çekirdek malzemenin hacmi, bireysel deneye bağlı olarak değişir. Tohum hacmi seçerken, dikkate almak: bir numune ve potansiyel toksisite tohum bolluğu. Ham homojenatları hücrelerine toksik olabilir. Bunun gibi, istediğiniz etkiyi izlemek için mümkün olan en düşük hacim kullanın. Lizat / kuyu aralık fr Önceden test hacimleri5-20 ug toplam proteine ​​karşılık gelen om 1-5 ul. Gözenek başına toplam hacim (tohum + indirgenmiş serum ortamı) 10 ul olduğundan emin olun. </li><li> En az 20 dakika süreyle ve 2 saat kadar oda sıcaklığında kısaca hafifçe karıştırın 4.1 ve 4.2, fiske açıklanan iki tüp içeriğini birleştirin (1000 xg, 5 sn) aşağı spin ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Yavaşça bireysel biyosensör kuyularının yanında transdüksiyon kompleksinin 20 ul pipetle. Üç teknik çoğaltır, mümkünse kullanın. 24-48 saat boyunca inkübatör tedavi hücreleri dönün. Aşama 3.6 de tarif edildiği gibi aynı şartlar altında inkübe edilir. Not: fosfolipidlerin uygulanmasının lipozom reaktifi maruz kalmayan hücrelerin Biosensor için floresan profili nispeten hafif bir kayma getirmektedir, çünkü bu yerleşim için uygun negatif kontrol koşulu boş lipozomlar (örneğin, lipozom reaktifi + indirgenmiş serum ortamı) ile muamele biyosensör hücreleridir. </li></ol> FRET Akım Sitometrisi 5. Hasat Hücreleri <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOT: hücrelerini-genel hasat önce 24-48 saat tedavi sonrası-standart bir ters floresan mikroskop GFP filtresi kullanılarak tohumlama faaliyetinin ön okuma almak mümkündür. Tohum malzeme ile tedavi edilen hücreler yoğun noktasal ve retiküler hücre içi kapanımlar (- B Şekil 1A) gösterecektir oysa tohum malzemesi (yani, boş lipozomlar) olmadan tedavi hücreler, yaygın floresan gösterecektir. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm hücre ortamı (150 ul) aspire. Tripsinize (50 ul), 5 dakika boyunca hücreler ve 150 ul soğuk kültür ortamı ile söndürün. Hücre kaldırma ve sonraki hücre kaybına neden olabilir, bu aşamada trypsinization öncesinde PBS durulama dahil etmeyin. Yolluk stratejileri yoluyla akım sitometri sırasında herhangi kirlenmesine ölü hücreleri ve enkaz dışlamak. </li><li> Hemen 5 ml 1000 xg&#39;de, transferi 96 gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın hücreleri, ve santrifüj söndürme işleminden sonraoda sıcaklığında n. </li><li> Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, orta atmak ve. </li><li> Yavaşça fakat iyice 50 ul% 2 paraformaldehid hücre pelletini ve 10 dakika inkübe edilir. Sabitleme daha temiz ve tutarlı sonuçlar sağlar rağmen Alternatif olarak, koşmak hücreler, canlı. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, paraformaldehid atmak ve. </li><li> Yavaşça, ama iyice, 200 ul tamponla sitometri soğutulmuş akışı hücre pelletini tekrar süspansiyon (HBSS,% 1 FBS, 1 mM EDTA) ve hücre topaklanma önlemek için en kısa sürede plaka çalıştırın. </li></ol> 6. FRET Akım Sitometri Not: Lazer hattı ve filtre setleri (Tablo 2) ile uyumlu bir FRET donatılmıştır MACSQuant VYB, gibi bir akış sitometrisi kullanın. Bu bölümde her adım için, yazılımın 96 kuyu şablonu kullanarak ilgi kuyusunu tıklatın ve tıklatın&quot;Play&quot; örnek alımı ve akışını başlatmak için. &#39;Yeni analiz pencere&#39; simgesini tıklayarak araziler ya da istatistik tabloları yapın. X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde eksen parametrelerini değiştirin. Hücre popülasyonlarının veya floresan sinyalleri kaydırmaya artırmak veya uygun filtreler ile ilgili gerilimleri azaltmak. Bu alet sayesinde, doğru tek hücreli izlenmesini sağlamak için &lt;1,000 olay / sn çalıştırın. <ol><li> Hücre popülasyonu sol alt kadranda kadar bir Side Scatter-Alan Forward Scatter-Alan (FSC-A) iki değişkenli arsa vs (SSC-A) ve hücre hattı 1. çalışırken, SSC ve FSC voltajlarını ayarlamak emin olun. Çokgen aracını tıklatın ve hücre popülasyonu (Gate P1) tanımlar. Tüm yolluk parametreleri için bakınız Şekil 2. </li><li> Bir FSC-H (yükseklik) FSC-A değişkenli arsa vs yapın ve arsa üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P1 seçerek bu arsa Gate P1 uygulanır. Hücre hattı # 1çalışan, çokgen aracını tıklatın ve tek hücreleri (Gate P2) tanımlar. </li><li> CFP, YFP ve FRET: 3 histogram araziler, ilgi filtrelerin her biri için biri yapmak. Araziler üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P2 seçerek bu araziler tüm Kapısı P2 uygulayın. Hücre hattı 1. çalışırken, gerilimleri ayarlamak şekilde CFP, YFP medyan hücre popülasyonu ve histogramlar 405 nm lazer ile hücreleri uyarmak, CFP ve FRET ölçmek ve birlikte yakalama floresan için her 0 ile 1. olan FRET sırasıyla, 450/50 nm ve 525/50 nm filtre. YFP ölçmek için, bir 525/50 nm filtreli 488 nm lazer ve yakalama floresan ile hücreler heyecanlandırmak. Lazer ve filtre ayarları daha Tablo 2&#39;de açıklanmıştır. </li><li> FRET ve YFP kanal içine CFP yayılma için tazminat gerçekleştirin. NOT: Tazminat floresan dağıtma düzeltme işlemidir. Tek florokrom floresan emisyonu bir filtre desi içinde algılandığında floresan yayılma oluşurBaşka bir florokrom sinyali ölçmek için yapması- nın doğrudan. Uygun tazminat ile CFP yayılma floresans FRET ve YFP kanallarından çıkarılabilir. NOT: Tazminat hem floresan pozitif ve negatif hücrelerin varlığını gerektirir. Bu nedenle, CFP-pozitif hücreleri üzerindeki (hücre çizgisi # 2), çalışma öncesinde numuneye eklenmesi gerekir negatif hücreler (1 hücre çizgisi #) telafi etmek için. <ol><li> De hücre çizgisi # 2 süspansiyon 200 ul içine tek bir hücre hattı 1. süspansiyonu 30 ul başak telafi hemen önce. </li><li> &quot;Çalgı Settings&quot; simgesine, daha sonra &#39;tazminat&#39; sekmesini tıklayın ve tazminat tablosunu açmak için &#39;matris&#39; kontrol edin. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs FRET-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Hücre hatları 1 + 2 çalışırken, &#39;Quadrant&#39; simgesini tıklayın ve floresan -negatif ve pozitif popülasyonlar düşük iki kadran ayrılır ki (Gates, LL3 a kadran çizmeknd LR3 sırasıyla). </li><li> LL3 ve LR3 kapıları için FRET medyan floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. FRET sinyal MFI LL3 ve LR3 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde FRET parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, FRET sinyali MFI FRET kanalının içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs YFP-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Adım 6.4.3 yapılan benzer kadranlar (LL4 ve LR4) çizin. </li><li> LL4 ve LR4 için YFP MFI görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. YFP sinyal MFI LL4 ve LR4 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde YFP parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, bir YFP sinyal MFI YFP kanal içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li></ol></li><li> FollKapı kurulum ve tazminat nedeniyle, faiz kuyu vurgulamak ve plaka kalanını çalıştırın. </li><li> Tüm numuneler &#39;dosyası&#39;, ardından &#39;kopya&#39; tıklayarak, ihracat verileri dosyaları çalıştırmak edildikten sonra. &#39;Veri dosyaları&#39; sekmesini seçin deneme klasörünü vurgulayın ve &#39;kopya&#39; tıklayın. </li></ol> 7. Veri analizi NOT: X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde değiştirme eksen parametreleri. <ol><li> Analiz programı flow sitometri Open FCS dosyaları. </li><li> Dağıtma özelliklerine göre, benzer şekilde, Bölüm 6&#39;da tarif edilene boş lipozomlar ile muamele edilen hücrelerden alınan (FSC-A v FSC H) hücre popülasyonu (FSC vs SSC) ve tekli popülasyonu tanımlamak için çok köşeli bir kapı kullanın. </li><li> OBP kompanzasyon kurulumu sırasında yapıldı, daha fazla CFP ayarlamak yok. </li><li> YFP değişkenli arsa vs FRET oluşturun. Hücre hattı 3. Kullanılması, FRET-pozitif hücre popülasyonu yamaç boyunca uzanan bir çokgen kapısı çizerek yanlış FRET kapısı tanımlayın. Bu kapı, FRET filtre içinde bir sinyal yayar YFP tek pozitif hücreler hariç, daha önce ve arkadaşları yasaklayarak gösterilene benzer çekilmektedir. 22 </li><li> OBP değişkenli arsa vs FRET boş lipozom-tedavi OBP / YFP hücrelerini çizerek bir FRET kapısı tanımlayın. Yukarı doğru uzanan ve uzak nüfus sola nüfusun yamaç boyunca bir çokgen kapısı tanıtın. Bu kapı arka plan hücrelerinin ≥1% olduğu FRET gibi çoğu hücreleri (~% 99), dışarıda olmalıdır. Bu kapının vitese herhangi bir olay FRET-pozitif kabul edilir. Not: Yukarıdaki tarif Her bir kapak daha sonra kapıları oluşturmak önce tüm örneklere uygulanır. Analizi takiben, dört ayrı kapıları tanımlanır (Hücre popülasyonu, tekli; yanlış FRET, FRET). </li><li> Yüzde FRET pozitifliği ve MFI: dahil olmak üzere ilgi Tutanak analiz parametreleri,FRET-pozitif hücre. El ile yüzde pozitifliği ve MFI ürünü ölçerek entegre FRET yoğunluğunu hesaplamak. Not: entegre FRET yoğunluğu sonuç ölçüsü, iki bireysel faktörler daha az olan bir ürün hesaplama önlemek için 1 &#39;den büyük ya da eşit ve MFI (adım 7.5&#39; de tanımlandığı gibi) ayarlanmış arka FRET olarak kullanılırsa. </li></ol>

<ol>
	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

Burada anlatılan FRET akım sitometri sistemi hızlı ve kantitatif tau tohumlama aktivitesini değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Sadece orta hücre kültürü deneyim ve FRET çalışan bir bilgi ve akım sitometri gerektirir. Beta bilanço yapısı bağlandığı zaman floresan gelişmiş sergileyen - - örneğin Thioflavin T gibi diğer ekim deneyleri, zahmetli ve saf, rekombinant protein alt tabakayı gerektirir. Ayrıca, tau için in vitro tohumlama deneyleri sadece semi-kantitatif ve tohum mal...

Hücre içi tau amiloid birikimi, Alzheimer hastalığı gibi tauopatıler tanımlar. Hastalığın erken evrelerinde, patoloji genellikle beynin farklı bölgelerinde lokalize, ancak hastalığın ilerlemesi ile, patoloji kaçınılmaz farklı sinir ağları 1-5 boyunca yayılır. Biriken deliller toksik protein agrega transselüler yayılımı (6-10 gözden) Bu patoloji altında yatan göstermektedir. Bu modelde, proteopathic tohumları (örneğin, tau) verici hücrelerden salınan ve şablonu konformasyonal değişiklik 11-15 ile yanlış katlanmış formda doğal tau proteini dönüşürken, komşu hücreleri girin. Burada açıklanan tahlil hassas tür tohum aktivitesini tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu rekombinant proteinin ve biyolojik numuneler ile uyumlu ve proteopathic tohumlama aktivitesi 16 dakikalık seviyelerinin ölçümü sağlar. Stabil tau tekrar d ifade HEK 293T hücreleriCFP ya YFP da kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonu içeren OMain (RD) tohumlama aktivitesi stabil biyosensör olarak hizmet (bundan sonra tau-RD-CFP / YFP hücreleri olarak da adlandırılır). Proteopathic tohum yokluğunda, hücreler, bir çözünür bir monomer olarak tau korumak ve kayda değer bir plan FRET sahiptir. Hücrelerin içine spontan alma ya da tau tohumların lipozom-aracılı iletim Bununla birlikte, akış sitometrisi ile, tek hücreler içinde ölçüldüğü bir FRET sinyali üretir RD-CFP ve RD-YFP agregasyonu ile sonuçlanır. Bu testte çok sayıda bileşenleri duyarlılığını artırmak ve değişkenliği azaltmak için geliştirilmişti. Bir 1 monoklonal hücre çizgisi: en uygun sinyal sağlar olarak 1 RD-CFP / YFP sentezleme oranı seçildi: gürültü. Hassasiyetini artırmak için, fosfolipidler, doğrudan hücre içine tohum tanıtmak için kullanılan (uptake biyolojik mekanizmaları incelemek için, ancak bu ihmal edilebilir). Son olarak, nüfus düzeyi ve tek bir hücre de izler FRET akım sitometri<html> seviye, diğer protein kümeleme deneyleri aksine. Nihai sonuç ölçüsü, entegre FRET yoğunluğu, yüksek kantitatif ve agregasyonu ile hücrelerin sayısında ve kümeleme her hücrede meydana geldi hangi derecede hem hesapları. Bu optimize tüm parametreler duyarlılığını artırmak ve tekrarlanabilirlik sağlamak. Bu sistem son zamanlarda yaygın olarak kullanılan diğer tau patolojik belirteçleri temporal başlamasını ve tau tohumlama faaliyetleri göreli ilerlemesini (örneğin, MC1, AT8, PG5 ve ThioflavinS) değerlendirildi transgenik P301S tauopathy farelerde 17 kapsamlı bir çalışmada kullanılmıştır. Tohum etkinlik bugüne kadar en az 6 hafta histolojik algılama önceki değerlendirilen tau patolojisi en eski ve en güçlü işaret vardır. Tohum aktivite başlangıcı ve / veya nörodejenerasyonda 16 ilerlemesinde proteopathic tohumların nedensel rolünü düşündürmektedir 1.5 ay ve ilerleyen yaşla birlikte artar görünür. e_content &quot;&gt; biyolojik örneklerden tohum malzemesi dakika seviyelerinin hassas kantitatif. Erken hastalığın ilerlemesini izlemek çalışmaları kolaylaştırabilir deneme süresinin kısaltılması ve genç hayvanların kullanılmasını sağlayarak, bu klinik öncesi hayvan deneylerinde verimliliği ve doğruluğunu artırabilir. Örneğin, P301S fare daha önce tarif edilen, kurşun bileşikleri erken 4-6 hafta kadar teslim edilebilir, ve 2-4 hafta sonra etki için izlenir. deney doğru tohumlama herhangi bir azalma ölçmek gerekir (ya da ekim aktivitesi başlangıcında hemen önce) faaliyet. sitometrisi in vitro tarama uygulamaları da. Örneğin, anti-tau reaktifler (örneğin, antikorlar, küçük moleküller, vs.) ya da rekombinant tau kullanılarak yapılmış, kültür doğrudan indüksiyon tohumlama bloke etme kapasitesi hızlı bir şekilde test edilebilir olan akış FRET bir tohum kaynağı (Şekil 5). Bu düzenleme ile, tohum malzemesi hazırlandıktan sonra, eski olarak agrega ya da beyin türevli lisatlarperiment veri analizi de dahil olmak üzere, tamamlamak için sadece üç gün sürer. Proteopathic tohumlama faaliyetinin hızla kantitatif böylece nörodejenerasyon birçok çalışma kolaylaştırabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET akım sitometri duyarlı, nicel ve rekombinant veya biyolojik örneklerden tohumlama faaliyetinin hızlı algılama sağlar. Deney ayarları yüzeysel olduğu: Tau-RD-CFP / YFP ifade monoklonal türetilen stabil hücre hatları 24-48 saat için kuluçkalanmıştır, tohum malzemesi ile transduse ve analizi (Şekil 1A) akış sitometrisi tabi tutulur. Tohumların yokluğunda, biyosensör hücreleri çözünür, monomerik formda (Şekil 1B) tau korumak. Tohumların varlığında ise,...

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry at JoVE.com

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Video: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Biyomühendislik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Ucuz Sensörler ile Böcek Tespit ve Sınıflandırma Uçan

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.