This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

NOT: Bu protokol FRET kullanımı fare biyolojik örneklerden tohumlama aktivitesini tespit etmek için flow sitometri vurguluyor. Aynı zamanda, rekombinant fibriller ve insan biyolojik numuneler ile uyumludur. Fare ötanazi ve beyin hasat IACUC onaylı prosedürlere uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Beyin Ekstraksiyon <ol><li> Izofluran (% 2), derin anesthetization sonra, buz soğukluğunda PBS% 0.03 heparin ihtiva eden bir fare serpmek ve Gage ve ark bilgi aşağıdaki beyin ekstrakte edin. 18 </li><li> Bir kriyo-şişe içinde ekstre doku yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurularak ek yerleştirilmesi. Alternatif olarak, kuru buz üzerinde doku dondurma. Bir kez gerekli ise, uzun bir süre için -80 ° C ve saklamak için doku transfer dondurulmuş. NOT: Bu protokol, tüm beyin homojenatlarının veya mikro kesilir beyin bölgelerinde ile uyumludur. Hagihara et al. Detaylı mikrodiseksiyon protokol 19. </li></ol&gt; Biyolojik Tohum Materyali 2. Hazırlık <ol><li> 1 x TBS (10 ml için 1 tablet) halinde proteaz inhibitörleri (serbest EDTA) içinde çözerek homojenizasyon tamponu hazırlayın. Buz üzerinde şiddetle Vortex, ve mağaza. Proteaz inhibitörleri biyosensör hücre canlılığını korumak için EDTA arındırılmalıdır. </li><li> Tek kullanımlık tartmak tekne dondurulmuş beyin dokusu tartılır ve 5 ml konik tüp transfer. Nihai çözelti,% 10 ağırlık / hacim olduğu şekilde buz soğukluğunda homojenizasyon tamponu ekleyin. Geçici buz üzerinde saklayın. Doku kitlesi ve daha sonra homojenizasyon tampon maddesi hacmi kullanılan beyin boyut ve / veya bölgeye bağlı olarak değişecektir. Burada, 0,2 g ağırlığındaki bir yetişkin farenin hemibrain% 10 ağırlık / hacim solüsyonu 2 ml içinde süspanse edilir. </li><li> Transferi soğuk odaya örnekler ve uygun ayarları bir prob sonikatör ayarlayın. (Burada gösterilen) bir Omni Ruptor ile prob sonication için numuneler ov değil emin olmak için yaklaşık 75 W. kullanın darbe modu karşılık% 20, gücü ayarlayınsonication sırasında er-ısıtmalı. Yaklaşık 500 ms tekabül eden,% 30 Pulser ayarlayın. </li><li> Yine, su, izopropanol ve su ile durulanır, her çözeltisi arasında probu silinmesi ile prob sonikatör ucu temizleyin. Durulama ve taraf ve laboratuar mendil ile prob alt hem de silmek için emin olun. </li><li> Bir seferde bir numune ile çalışma, homojenizasyon tamponu içine prob ucu daldırın ve sonikatör başlatın. Yukarıda açıklanan güç ve üreteci ayarlarını kullanma, 25 toplam bakliyat teslim. Doku süspansiyon tamamen olduğundan emin olun. Bu adımı sırasında numunenin köpüklenmesini önlemek için dikkatli olun. NOT: a) toplam hacim düşük olduğu veya b) Homojenat ısıtır eğer numuneler köpüklenme duyarlıdır. Bu özel cihaz sayesinde, 250 ul daha az hacimli ses dalgalarına maruz yoktur. Numuneler, soğutulmuş durmalarını sağlamak için, borular bu aşama esnasında buz üzerinde depolanabilir. </li><li> Artık lizat uzakta silerek temizleyin prob, daha sonra bir bardak o içine 10 bakliyat teslimf temiz su. Her bir adım arasında silinerek kurutulmuş (adım 2.4 gibi) yan kenarlarına ve tekrar su, izopropanol ve su ile prob alt durulayın. Kontaminasyonu önlemek için, iyice örnekler arasında probu durulayın. NOT: tau agrega ile, daha sıkı temizleme yöntemleri örnek-örnek kirlenmesini önlemek için gerekli olduğunu bulamadı. Diğer amiloid Bununla birlikte, literatürde geniş 20,21 tarif edilmiştir, ek bakım gerektirir. </li><li> Tüm numuneler işlendikten kadar mağaza buz üzerinde homojenatlarında. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 21.300 x g&#39;de homojenatları dönerler. </li><li> Pelet rahatsız etmemek için özen, temiz bir tüpe süpernatant aktarın. Pelet atın. Daha fazla kullanım için -80 ° C&#39;de süpernatan ve mağaza lizatları alikotu. Bu tohumlama verimini azaltır, ancak homojenatlarının donma / çözülme döngüleri kaçının. </li></ol> 3. şarjı Biyosensör Hücreler NOT:Bu deney için, dört hücre çizgileri kullanın: HEK 293T (hücre çizgisi # 1), RD-P301S-CFP (hücre çizgisi # 2), RD-P301S-YFP (3 hücre çizgisi #) ve RD-P301S-CFP / YFP ( hücre çizgisi # 4). Tahlile her hücre hattının katkılarından dolayı Tablo 1 başvurun. <ol><li> Steril bir ortamda, aspirat kültür ortamı. Sıcak PBS ve aspirat ile hücreleri durulayın. Hücreleri tripsinize edin 3 dakika boyunca (tripsin-EDTA (% 0.05), 3 ml), sıcak bir kültür ortamında (DMEM 9 ml,% 10 FBS,% 1 pen / strep,% 1 glutamax) ile söndürün ve hemen hücreleri aktarmak konik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Orta aspire ve sıcak kültür ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet. </li><li> Hemasitometre kullanılarak, her hücre hattı için hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre yoğunluğu, toplama ve yeniden süspansiye etme hacminin zamanda konfluansa bağlı olarak değişecektir. Hücre yoğunluğu, 10 mi ortam içinde% 90 konfluent bir 10 cm&#39;lik bir tabak hasat hücreleri tekrar yaklaşık 1.000.000 hücre / ml olarak. </li><li> Makehücrelerin bir ana karışımı + ortam bir 96 çukurlu bir levhanın her bir oyuğa 130 ul ortam içinde 35,000 hücre içerecek (100 kuyu için bir ana karışımı yapmak için, örneğin, 13 mi ortam içinde 3.500.000 hücreleri tekrar süspansiyon). Bireysel deneysel tasarımlar ve zaman çizelgeleri sığdırmak için hücre numarasını değiştirin. Hücre tedavisi için ~ sonra kaplama 18 saat, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35.000 hücre ekleyin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaş yavaş düz taban kısmının her bir kuyunun içine ana karışım hücre süspansiyonu 130 ul pipet doku 96 plaka kültür işlemden geçirildi. Kaplama birlikte, plakanın alt temas etmeyen, kuyunun merkezinde pipet ucu yerleştirin. Not: kaplama biçimi değiştirilebilir olmasına rağmen, hücre çizgileri plaka başına 1-3 her biri için n = 4 kuyu yapımında tavsiye edilir. Plaka (n = 84), geri kalan hücre çizgisi # 4 (biyosensör hücreleri) için ayrılmıştır. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden plaka bırakarak oturmasına izin verin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve ve O / N inkübe# 8805;% 80 bağıl nem. </li></ol> 4. tedavi edilmesi Hücreler NOT: ertesi gün, tau biyosensör hücreleri aşağıdaki gibi tohum iletim kompleksleri hazırlamak,% 60-65 konfluent: <ol><li> Bir tüp içinde, bir ana karışımı yapmak için, örneğin Opti-MEM olarak indirgenmiş serum ortamı ile, örneğin Lipofectamine gibi transfeksiyon reaktifi birleştirir. Başına iyi 1.25 ul transfeksiyon reaktif ve 8.75 ul indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Flick tüpü hafifçe kısaca karıştırın aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> Başka bir tüp içinde, indirgenmiş serum medya ile tohum malzemesi (adım 2.9 den lizatın kısım) birleştirir. Not: Çekirdek malzemenin hacmi, bireysel deneye bağlı olarak değişir. Tohum hacmi seçerken, dikkate almak: bir numune ve potansiyel toksisite tohum bolluğu. Ham homojenatları hücrelerine toksik olabilir. Bunun gibi, istediğiniz etkiyi izlemek için mümkün olan en düşük hacim kullanın. Lizat / kuyu aralık fr Önceden test hacimleri5-20 ug toplam proteine ​​karşılık gelen om 1-5 ul. Gözenek başına toplam hacim (tohum + indirgenmiş serum ortamı) 10 ul olduğundan emin olun. </li><li> En az 20 dakika süreyle ve 2 saat kadar oda sıcaklığında kısaca hafifçe karıştırın 4.1 ve 4.2, fiske açıklanan iki tüp içeriğini birleştirin (1000 xg, 5 sn) aşağı spin ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Yavaşça bireysel biyosensör kuyularının yanında transdüksiyon kompleksinin 20 ul pipetle. Üç teknik çoğaltır, mümkünse kullanın. 24-48 saat boyunca inkübatör tedavi hücreleri dönün. Aşama 3.6 de tarif edildiği gibi aynı şartlar altında inkübe edilir. Not: fosfolipidlerin uygulanmasının lipozom reaktifi maruz kalmayan hücrelerin Biosensor için floresan profili nispeten hafif bir kayma getirmektedir, çünkü bu yerleşim için uygun negatif kontrol koşulu boş lipozomlar (örneğin, lipozom reaktifi + indirgenmiş serum ortamı) ile muamele biyosensör hücreleridir. </li></ol> FRET Akım Sitometrisi 5. Hasat Hücreleri <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOT: hücrelerini-genel hasat önce 24-48 saat tedavi sonrası-standart bir ters floresan mikroskop GFP filtresi kullanılarak tohumlama faaliyetinin ön okuma almak mümkündür. Tohum malzeme ile tedavi edilen hücreler yoğun noktasal ve retiküler hücre içi kapanımlar (- B Şekil 1A) gösterecektir oysa tohum malzemesi (yani, boş lipozomlar) olmadan tedavi hücreler, yaygın floresan gösterecektir. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm hücre ortamı (150 ul) aspire. Tripsinize (50 ul), 5 dakika boyunca hücreler ve 150 ul soğuk kültür ortamı ile söndürün. Hücre kaldırma ve sonraki hücre kaybına neden olabilir, bu aşamada trypsinization öncesinde PBS durulama dahil etmeyin. Yolluk stratejileri yoluyla akım sitometri sırasında herhangi kirlenmesine ölü hücreleri ve enkaz dışlamak. </li><li> Hemen 5 ml 1000 xg&#39;de, transferi 96 gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın hücreleri, ve santrifüj söndürme işleminden sonraoda sıcaklığında n. </li><li> Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, orta atmak ve. </li><li> Yavaşça fakat iyice 50 ul% 2 paraformaldehid hücre pelletini ve 10 dakika inkübe edilir. Sabitleme daha temiz ve tutarlı sonuçlar sağlar rağmen Alternatif olarak, koşmak hücreler, canlı. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, paraformaldehid atmak ve. </li><li> Yavaşça, ama iyice, 200 ul tamponla sitometri soğutulmuş akışı hücre pelletini tekrar süspansiyon (HBSS,% 1 FBS, 1 mM EDTA) ve hücre topaklanma önlemek için en kısa sürede plaka çalıştırın. </li></ol> 6. FRET Akım Sitometri Not: Lazer hattı ve filtre setleri (Tablo 2) ile uyumlu bir FRET donatılmıştır MACSQuant VYB, gibi bir akış sitometrisi kullanın. Bu bölümde her adım için, yazılımın 96 kuyu şablonu kullanarak ilgi kuyusunu tıklatın ve tıklatın&quot;Play&quot; örnek alımı ve akışını başlatmak için. &#39;Yeni analiz pencere&#39; simgesini tıklayarak araziler ya da istatistik tabloları yapın. X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde eksen parametrelerini değiştirin. Hücre popülasyonlarının veya floresan sinyalleri kaydırmaya artırmak veya uygun filtreler ile ilgili gerilimleri azaltmak. Bu alet sayesinde, doğru tek hücreli izlenmesini sağlamak için &lt;1,000 olay / sn çalıştırın. <ol><li> Hücre popülasyonu sol alt kadranda kadar bir Side Scatter-Alan Forward Scatter-Alan (FSC-A) iki değişkenli arsa vs (SSC-A) ve hücre hattı 1. çalışırken, SSC ve FSC voltajlarını ayarlamak emin olun. Çokgen aracını tıklatın ve hücre popülasyonu (Gate P1) tanımlar. Tüm yolluk parametreleri için bakınız Şekil 2. </li><li> Bir FSC-H (yükseklik) FSC-A değişkenli arsa vs yapın ve arsa üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P1 seçerek bu arsa Gate P1 uygulanır. Hücre hattı # 1çalışan, çokgen aracını tıklatın ve tek hücreleri (Gate P2) tanımlar. </li><li> CFP, YFP ve FRET: 3 histogram araziler, ilgi filtrelerin her biri için biri yapmak. Araziler üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P2 seçerek bu araziler tüm Kapısı P2 uygulayın. Hücre hattı 1. çalışırken, gerilimleri ayarlamak şekilde CFP, YFP medyan hücre popülasyonu ve histogramlar 405 nm lazer ile hücreleri uyarmak, CFP ve FRET ölçmek ve birlikte yakalama floresan için her 0 ile 1. olan FRET sırasıyla, 450/50 nm ve 525/50 nm filtre. YFP ölçmek için, bir 525/50 nm filtreli 488 nm lazer ve yakalama floresan ile hücreler heyecanlandırmak. Lazer ve filtre ayarları daha Tablo 2&#39;de açıklanmıştır. </li><li> FRET ve YFP kanal içine CFP yayılma için tazminat gerçekleştirin. NOT: Tazminat floresan dağıtma düzeltme işlemidir. Tek florokrom floresan emisyonu bir filtre desi içinde algılandığında floresan yayılma oluşurBaşka bir florokrom sinyali ölçmek için yapması- nın doğrudan. Uygun tazminat ile CFP yayılma floresans FRET ve YFP kanallarından çıkarılabilir. NOT: Tazminat hem floresan pozitif ve negatif hücrelerin varlığını gerektirir. Bu nedenle, CFP-pozitif hücreleri üzerindeki (hücre çizgisi # 2), çalışma öncesinde numuneye eklenmesi gerekir negatif hücreler (1 hücre çizgisi #) telafi etmek için. <ol><li> De hücre çizgisi # 2 süspansiyon 200 ul içine tek bir hücre hattı 1. süspansiyonu 30 ul başak telafi hemen önce. </li><li> &quot;Çalgı Settings&quot; simgesine, daha sonra &#39;tazminat&#39; sekmesini tıklayın ve tazminat tablosunu açmak için &#39;matris&#39; kontrol edin. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs FRET-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Hücre hatları 1 + 2 çalışırken, &#39;Quadrant&#39; simgesini tıklayın ve floresan -negatif ve pozitif popülasyonlar düşük iki kadran ayrılır ki (Gates, LL3 a kadran çizmeknd LR3 sırasıyla). </li><li> LL3 ve LR3 kapıları için FRET medyan floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. FRET sinyal MFI LL3 ve LR3 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde FRET parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, FRET sinyali MFI FRET kanalının içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs YFP-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Adım 6.4.3 yapılan benzer kadranlar (LL4 ve LR4) çizin. </li><li> LL4 ve LR4 için YFP MFI görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. YFP sinyal MFI LL4 ve LR4 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde YFP parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, bir YFP sinyal MFI YFP kanal içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li></ol></li><li> FollKapı kurulum ve tazminat nedeniyle, faiz kuyu vurgulamak ve plaka kalanını çalıştırın. </li><li> Tüm numuneler &#39;dosyası&#39;, ardından &#39;kopya&#39; tıklayarak, ihracat verileri dosyaları çalıştırmak edildikten sonra. &#39;Veri dosyaları&#39; sekmesini seçin deneme klasörünü vurgulayın ve &#39;kopya&#39; tıklayın. </li></ol> 7. Veri analizi NOT: X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde değiştirme eksen parametreleri. <ol><li> Analiz programı flow sitometri Open FCS dosyaları. </li><li> Dağıtma özelliklerine göre, benzer şekilde, Bölüm 6&#39;da tarif edilene boş lipozomlar ile muamele edilen hücrelerden alınan (FSC-A v FSC H) hücre popülasyonu (FSC vs SSC) ve tekli popülasyonu tanımlamak için çok köşeli bir kapı kullanın. </li><li> OBP kompanzasyon kurulumu sırasında yapıldı, daha fazla CFP ayarlamak yok. </li><li> YFP değişkenli arsa vs FRET oluşturun. Hücre hattı 3. Kullanılması, FRET-pozitif hücre popülasyonu yamaç boyunca uzanan bir çokgen kapısı çizerek yanlış FRET kapısı tanımlayın. Bu kapı, FRET filtre içinde bir sinyal yayar YFP tek pozitif hücreler hariç, daha önce ve arkadaşları yasaklayarak gösterilene benzer çekilmektedir. 22 </li><li> OBP değişkenli arsa vs FRET boş lipozom-tedavi OBP / YFP hücrelerini çizerek bir FRET kapısı tanımlayın. Yukarı doğru uzanan ve uzak nüfus sola nüfusun yamaç boyunca bir çokgen kapısı tanıtın. Bu kapı arka plan hücrelerinin ≥1% olduğu FRET gibi çoğu hücreleri (~% 99), dışarıda olmalıdır. Bu kapının vitese herhangi bir olay FRET-pozitif kabul edilir. Not: Yukarıdaki tarif Her bir kapak daha sonra kapıları oluşturmak önce tüm örneklere uygulanır. Analizi takiben, dört ayrı kapıları tanımlanır (Hücre popülasyonu, tekli; yanlış FRET, FRET). </li><li> Yüzde FRET pozitifliği ve MFI: dahil olmak üzere ilgi Tutanak analiz parametreleri,FRET-pozitif hücre. El ile yüzde pozitifliği ve MFI ürünü ölçerek entegre FRET yoğunluğunu hesaplamak. Not: entegre FRET yoğunluğu sonuç ölçüsü, iki bireysel faktörler daha az olan bir ürün hesaplama önlemek için 1 &#39;den büyük ya da eşit ve MFI (adım 7.5&#39; de tanımlandığı gibi) ayarlanmış arka FRET olarak kullanılırsa. </li></ol>

<ol>
	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

Burada anlatılan FRET akım sitometri sistemi hızlı ve kantitatif tau tohumlama aktivitesini değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Sadece orta hücre kültürü deneyim ve FRET çalışan bir bilgi ve akım sitometri gerektirir. Beta bilanço yapısı bağlandığı zaman floresan gelişmiş sergileyen - - örneğin Thioflavin T gibi diğer ekim deneyleri, zahmetli ve saf, rekombinant protein alt tabakayı gerektirir. Ayrıca, tau için in vitro tohumlama deneyleri sadece semi-kantitatif ve tohum mal...

Hücre içi tau amiloid birikimi, Alzheimer hastalığı gibi tauopatıler tanımlar. Hastalığın erken evrelerinde, patoloji genellikle beynin farklı bölgelerinde lokalize, ancak hastalığın ilerlemesi ile, patoloji kaçınılmaz farklı sinir ağları 1-5 boyunca yayılır. Biriken deliller toksik protein agrega transselüler yayılımı (6-10 gözden) Bu patoloji altında yatan göstermektedir. Bu modelde, proteopathic tohumları (örneğin, tau) verici hücrelerden salınan ve şablonu konformasyonal değişiklik 11-15 ile yanlış katlanmış formda doğal tau proteini dönüşürken, komşu hücreleri girin. Burada açıklanan tahlil hassas tür tohum aktivitesini tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu rekombinant proteinin ve biyolojik numuneler ile uyumlu ve proteopathic tohumlama aktivitesi 16 dakikalık seviyelerinin ölçümü sağlar. Stabil tau tekrar d ifade HEK 293T hücreleriCFP ya YFP da kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonu içeren OMain (RD) tohumlama aktivitesi stabil biyosensör olarak hizmet (bundan sonra tau-RD-CFP / YFP hücreleri olarak da adlandırılır). Proteopathic tohum yokluğunda, hücreler, bir çözünür bir monomer olarak tau korumak ve kayda değer bir plan FRET sahiptir. Hücrelerin içine spontan alma ya da tau tohumların lipozom-aracılı iletim Bununla birlikte, akış sitometrisi ile, tek hücreler içinde ölçüldüğü bir FRET sinyali üretir RD-CFP ve RD-YFP agregasyonu ile sonuçlanır. Bu testte çok sayıda bileşenleri duyarlılığını artırmak ve değişkenliği azaltmak için geliştirilmişti. Bir 1 monoklonal hücre çizgisi: en uygun sinyal sağlar olarak 1 RD-CFP / YFP sentezleme oranı seçildi: gürültü. Hassasiyetini artırmak için, fosfolipidler, doğrudan hücre içine tohum tanıtmak için kullanılan (uptake biyolojik mekanizmaları incelemek için, ancak bu ihmal edilebilir). Son olarak, nüfus düzeyi ve tek bir hücre de izler FRET akım sitometri<html> seviye, diğer protein kümeleme deneyleri aksine. Nihai sonuç ölçüsü, entegre FRET yoğunluğu, yüksek kantitatif ve agregasyonu ile hücrelerin sayısında ve kümeleme her hücrede meydana geldi hangi derecede hem hesapları. Bu optimize tüm parametreler duyarlılığını artırmak ve tekrarlanabilirlik sağlamak. Bu sistem son zamanlarda yaygın olarak kullanılan diğer tau patolojik belirteçleri temporal başlamasını ve tau tohumlama faaliyetleri göreli ilerlemesini (örneğin, MC1, AT8, PG5 ve ThioflavinS) değerlendirildi transgenik P301S tauopathy farelerde 17 kapsamlı bir çalışmada kullanılmıştır. Tohum etkinlik bugüne kadar en az 6 hafta histolojik algılama önceki değerlendirilen tau patolojisi en eski ve en güçlü işaret vardır. Tohum aktivite başlangıcı ve / veya nörodejenerasyonda 16 ilerlemesinde proteopathic tohumların nedensel rolünü düşündürmektedir 1.5 ay ve ilerleyen yaşla birlikte artar görünür. e_content &quot;&gt; biyolojik örneklerden tohum malzemesi dakika seviyelerinin hassas kantitatif. Erken hastalığın ilerlemesini izlemek çalışmaları kolaylaştırabilir deneme süresinin kısaltılması ve genç hayvanların kullanılmasını sağlayarak, bu klinik öncesi hayvan deneylerinde verimliliği ve doğruluğunu artırabilir. Örneğin, P301S fare daha önce tarif edilen, kurşun bileşikleri erken 4-6 hafta kadar teslim edilebilir, ve 2-4 hafta sonra etki için izlenir. deney doğru tohumlama herhangi bir azalma ölçmek gerekir (ya da ekim aktivitesi başlangıcında hemen önce) faaliyet. sitometrisi in vitro tarama uygulamaları da. Örneğin, anti-tau reaktifler (örneğin, antikorlar, küçük moleküller, vs.) ya da rekombinant tau kullanılarak yapılmış, kültür doğrudan indüksiyon tohumlama bloke etme kapasitesi hızlı bir şekilde test edilebilir olan akış FRET bir tohum kaynağı (Şekil 5). Bu düzenleme ile, tohum malzemesi hazırlandıktan sonra, eski olarak agrega ya da beyin türevli lisatlarperiment veri analizi de dahil olmak üzere, tamamlamak için sadece üç gün sürer. Proteopathic tohumlama faaliyetinin hızla kantitatif böylece nörodejenerasyon birçok çalışma kolaylaştırabilir.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Noise Cancelling Ear Muffs</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>USA Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx&quot;&gt;1615-5510&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reagent resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Multi channel pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 well flat bottom plates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo analysis software</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipett</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET akım sitometri duyarlı, nicel ve rekombinant veya biyolojik örneklerden tohumlama faaliyetinin hızlı algılama sağlar. Deney ayarları yüzeysel olduğu: Tau-RD-CFP / YFP ifade monoklonal türetilen stabil hücre hatları 24-48 saat için kuluçkalanmıştır, tohum malzemesi ile transduse ve analizi (Şekil 1A) akış sitometrisi tabi tutulur. Tohumların yokluğunda, biyosensör hücreleri çözünür, monomerik formda (Şekil 1B) tau korumak. Tohumların varlığında ise,...

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry at JoVE.com

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Video: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Gelişim Biyolojisi

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Kanser Araştırmaları

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal allophycocyanin (APC) fluorescence intensity, are conjugated to antibodies specific to a particular analyte. Next, a selected panel of defined capture bead sets is incubated with a biological sample containing target analytes specific to the capture antibodies. A biotinylated detection antibody cocktail is added, which leads to the formation of capture bead-analyte-detection antibody sandwiches.
Finally, streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) is added, which binds to biotinylated detection antibodies, providing fluorescent signal intensities in proportion to the amount of bound analyte. The PE fluorescent signal of analyte-specific beads regions is quantified using flow cytometry, and the concentrations of particular analytes are determined using data analysis software and the standard curve generated in the assay.
In this experiment, we use a mouse T helper cytokine panel to simultaneously quantify the concentration of 13 separate cytokine targets in tissue culture supernatants collected from mouse splenocytes cultured under various stimulatory conditions.

This protocol describes the quantification of multiple cytokine targets simultaneously in tissue culture supernatants collected from stimulated mouse splenocytes using multiplex bead based immunoassay platform and a flow cytometer.

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

İnsan Nötrofillerinde β2 İntegrin Aktivasyon İnhibitörlerinin Taranması

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından