Bu protokol, aptamers ile çalışmaya yeni başlayan araştırmacıların bunları projelerinde kullanabilmelerine ve ayrıca protokolü tamamlamak için gereken bireysel küçük adımları anlamalarına yardımcı olacaktır. Aptamerler çok yönlüdür ve bu protokol bir immünofenotipleme testinde ne kadar kolay ve basit olduklarını gösterir. Aptamerler hem tanısal hem de terapötik uygulamalar için kullanılabilir.
Bu protokol, özgüllüklerini ve hassasiyetlerini doğrulamak için atılan ilk adımlardır. Bu özel tahlil bir hücre yüzey reseptörünün boyanmasını gösterirken, aptamerler çok parametrik akış sitometrisi için çok kolay bir şekilde kullanılabilir ve yüksek düzeyde fenotipik bilgi sağlar. Aptamerlerle çalışmanın önemli yönleri, kullanımdan önce doğru şekilde katlanmalarını ve ayrıca tampon ve iyonik mukavemet koşullarının seçildikleri zamanki ile aynı olmasını sağlamaktır.
Şişedeki ortamı toplayıp attıktan sonra, üç mililitre PBS ekleyin ve hücrelerin üzerine yayın. Her şişeye bir mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ekledikten sonra, 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın ve hücrelerin mikroskop altında ayrılmasını görselleştirin. Ardından, hücrelere bir mililitre tam ortam ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücreleri uygun bir tüpe pipetle yerleştirin ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri bir mililitre taze ortamda yeniden askıya alın ve belirli miktarda hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile seyrelterek tripan mavisi boyamasını kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri saymak için karışımın yaklaşık 15 mikrolitresini bir hemositometre ve bir kapak camı arasına dağıtın.
Test örneği başına yüz bin hücreye sahip olduğunuzdan emin olarak gerekli sayıda hücreyi toplayın. Daha sonra, enzimatik ayrılmayı takiben hücre zarı üzerindeki ilgili proteinin stabilizasyonuna izin vermek için hücreleri iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki saatlik inkübasyonun ardından, hücreleri beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin.
Süper natantı attıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre bloke edici tamponda yeniden askıya alın. Hücreleri aralıklı karıştırma ile 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bu 30 dakikalık inkübasyon sırasında, makalede açıklandığı gibi aptamer konsantrasyonlarının iki katını hazırlayarak aptamer katlama işlemini gerçekleştirin.
Daha sonra aptamerleri termosikler makinesi ile gerekli katlama koşullarına göre karıştırın ve inkübe edin ve aptamerlerin ışıktan korunmasını sağlayın. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri daha önce gösterildiği gibi santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Ardından bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri tekrar santrifüj edin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri bağlayıcı tamponun uygun bir hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden askıya alınan hücrelerin 50 mikrolitresini buz gibi soğuk 96 kuyucuklu siyah bir plakanın her bir kuyucuğuna pipetleyin. Daha sonra 50 mikrolitre aptamers pipeti, 50 mikrolitrelik bir hücre hacmine yerleştirin, 30 dakika boyunca karanlıkta dört santigrat derecede karıştırın ve inkübe edin.
Santrifüj yaptıktan ve süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti yıkama tamponunda dikkatlice yeniden askıya alın ve beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüj yapın. Ardından, yıkama adımını iki kez tekrarlarken akış sitometrik analizi için 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. İlk önce akış sitometresini ve ardından bilgisayarı açın.
Ardından, akış sitometrisi analiz yazılımını açın, programa giriş yapın ve sitometre sekmesinin altında sıvı başlangıcını çalıştırın. Yeni bir deneme oluşturmak için, deneme sekmesinin altında yeni klasör'ü tıklatın ve klasör eğik çizgi denemesini uygun şekilde adlandırın. Vurgulamak için yeni klasöre tıklayın.
Ardından, deneme sekmesinin altında tekrar yeni deneme'yi tıklayın ve denemeyi uygun şekilde adlandırın. İlk örnek eğik çizgi örneğini eklemek için, deneme sekmesinin altında yeni örnek'i tıklatın ve örneği uygun şekilde adlandırın. Bir tüp örneği eklemek için, numuneyi vurgulayın ve deneme sekmesinin altında yeni tüp'ü tıklayın.
Ardından uygun sayıda tüp ve isim ekleyin. Gerekli grafikleri hazırlamak için, çalışma sayfası sekmesi altında yeni bir çalışma sayfası açın. Yeni çalışma sayfası penceresi açıldığında, ilgilenilen popülasyonu seçmek için yan dağılım ile ileri dağılım arasında bir nokta lekesi grafiği hazırlayın.
Tek hücreli popülasyonu seçmek için ileri dağılım yüksekliği ile ileri dağılım alanının nokta lekesi grafiğini hazırlayın. Ardından, ilgilenilen florofora karşı olayların sayısının bir histogramını hazırlayın. Akış sitometrisine başlamadan önce voltaj parametrelerini ayarlamak için numune alımını, denetçiyi ve sitometreyi kontrol etmek için alım panosunun ve tüm grafiklerin bulunduğu çalışma sayfasının açık olduğundan emin olun.
İlk olarak, tedavi edilmemiş hücreleri çalıştırın. Tüpe işaret eden okun yeşil olduğundan emin olun. Bu ok yeşil değilse, yeşil yapmak için oka tıklayın.
Pipet kullanarak, her numuneyi 96 kuyucuklu siyah plakadan bir akış sitometri tüpüne aktarın. Edinme panosunda, kaydedilecek uygun sayıda olay seçin, akış hızını düşük olarak değiştirin ve Veri Al'a tıklayın. FSC ve SCC parametreleri için voltajı ayarlayarak, hücre popülasyonunun nokta grafiği içinde merkezileştirildiğinden ve ilgilenilen hücreleri kaybetmemek için hiçbir hücrenin grafiğin her iki eksenine de dokunmadığından emin olun.
İlk kapıyı, en düşük ileri saçılma sinyaline sahip popülasyonu oluşturan enkazı hariç tutarken, ileri ve yan dağınık yoğunluk grafiğindeki ilgili popülasyonu tanımlayarak ve seçerek tanımlayın. Çifte hücre popülasyonlarını hariç tutarak ikinci kapıyı tanımlayın, çünkü çift hücreler sonuçları ve sonuçları önemli ölçüde etkiler. Örnekleri daha hızlı analiz etmek için edinme hızını orta veya yüksek seviyeye yükseltin, ancak saniyede 200 ila 300 olaydan fazlasını aşmayın.
Ardından verileri kaydet'i tıklayın. Voltajı ayarladıktan ve verileri kapatıp kaydettikten sonra, örneği çıkarın ve Sonraki Tüp'e tıklayın. Bir sonraki numuneyi ekleyin ve tüm kontrol ve test numuneleri için kayıt verilerini tekrarlayın.
Tüm veriler toplandıktan sonra, akış sitometresini, her biri beş dakika boyunca yüksek bir akış hızında üç tüp ağartıcı, FACSRinse ve ultra saf su çalıştırarak yıkayın. Ardından sitometre açılır menüsünden akışkanlar kapatıldı'yı tıklayın. Sonucu, aktarılacak fsc dosyaları olarak bir USB sürücüsüne aktarın.
Analizi işlemek üzere yeni bir belge ve pencere oluşturmak için yeni düğmeye basarak analiz yazılımını kullanarak bunları analiz edin ve örnek dosyaları yeni pencereye sürükleyin. Lekesiz örneği açmak için çift tıklayın. Tek hücreli popülasyonu geçmek için, P1 popülasyonunu seçin ve FSCH versus FSCA grafiği oluşturmak için P1 popülasyonuna çift tıklayın.
Kullanılan florokroma karşı olayların histogramını oluşturmak için kapılı tek hücrelere çift tıklayın. Orijinal pencerede P1 ve tek hücreleri seçin ve tüm örneklerin artık aynı geçidi içermesi için bunları tüm örneklere sürükleyin. Ardından, mizanpajlar penceresini açmak için düzen düzenleyici düğmesine tıklayın ve bindirme histogramı oluşturmak için iki örneği birbirinin üzerine sürükleyin.
EpCAM pozitif MDA-MB-231 hücrelerinde, TEPP ve TENN ile tedavi edilen hücreleri temsil eden histogramların üst üste binmesi, TEPP ile tedavi edilen hücrelerin, TEPP aptamerinin bağlanmasının ilgili proteine bağlandığını gösteren TENN ile tedavi edilen hücrelere kıyasla sağa kaydırıldığını göstermektedir. Negatif kontrolde, TEPP ve TERN'in histogramlarını kaplayan HEK 293T hücreleri, EpCAM eksprese eden hücrelerde TEPP'nin reseptörüne bağlı EpCAM aptamer olduğunu gösteren herhangi bir kaymayı yansıtmaz. Ayrıca, EpCAM negatif hücrelerinde, geliştirilen aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğrulayan bir bağlanma gözlenmemiştir.
Aptamerlerin ışıktan korunduğundan, aptamerlerin ve hücrelerin plaka üzerinde karıştırıldığından ve akış sitometresinde doğru voltajların ayarlandığından emin olun. Bu, aptamers için gelecekteki uygulamalara büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, ilaç dağıtımına odaklandık.
Bu yüzden bizim için bir sonraki adım, aptamerlerin floresan mikroskopi kullanılarak içselleştirilip içselleştirilmediğini değerlendirmek olacaktır. Bu protokol, immünofenotipleme tahlillerinde aptamerlerin monoklonal ve poliklonal antikorların yerini almasının ne kadar kolay olduğunu göstermiştir.
