We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.

Aşağıdaki metni Arabidopsis&#39;de Psm ES4326 şırınga sızma deneyi optimize gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklar. Bu deneyde başlıca işlemleri basitleştirilmiş bir akış şeması (Figür 1) yer almaktadır. 1. Bitki Büyüme Koşullar <ol><li> Sow tohumlar <ol><li> Gevşek alt O onları iliklerine toprak ve su kapları ile doldurulmuş 2 tencere (çapı 4, uzun boylu 3.75) hazırlayın / N fazla suyu boşaltmadan önce. </li><li> Levha ya da diğer kağıt ağırlığında katlanmış 70 mm, her saksı, 50-100 Arabidopsis tohumu, yabani-tür Col-0 veya npr1-1 mutant ekmek. </li><li> % 80-90 (Şekil 2A) için bağıl nemi arttırmak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile tencerenin kapağını kapatın. </li></ol></li><li> Tam tabakalaşma ve senkron filizlenmesi için izin vermek için 72 saat boyunca 4 ° C&#39;de pot inkübe. </li><li> Standart büyüme koşulları pot aktarın (12 saat ışık/ 12 saat karanlık, 21 ° C, ışık yoğunluğu 100 mol / m 2 / sn, bağıl nem% 40) tohum çimlenme için izin vermek. Su yoğunlaşmasını önlemeye yardımcı olacaktır büyüme odası, transferinden sonra hemen açılması bir 2-3 oluşturmak için kubbeyi Crack. </li><li> Ilk gerçek yaprak uzunluğu 2-3 mm boyuta ulaştığında, düz toprak ile doldurulmuş 72 kuyu pot fidan nakli. <ol><li> Düz toprak yüzeyinin ortasında 1-derin depresyon oluşturmak için parmağınızı veya 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça mümkün olduğunca az kök hasarı ile bireysel fidan ayırın. Dikkatle forseps ile sağlam köklere sahip fide pick up. </li><li> Depresyon içine nakli şok aza indirmek ve yavaşça depresyon doldurmak için çevredeki toprağı aşağı pat yapışan toprak simler ile birlikte tek ayrılmış fide yerleştirin. Biyolojik tehlikeli atık kabına ilave fide ve toprak atın ve uygun imhaYerel biyolojik tehlike atık kurallarına. </li><li> Su üstten fide aktarılır ve tamamen% 80-90 nem korumak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile düz kapak. Daha sonra 4 gün sabahı kubbesi çatlak ve tamamen o günün sonunda çıkarın, 3 gün boyunca kubbeyi tutun. Not: Ekim tohumlar alternatif düz toprakla dolu bir 72-kuyu üzerine bir cam pipet ile 2-3 tohum aktarılması, ardından 4 ° C&#39;de 48 saat boyunca 1 mi,% 0.1 agar ihtiva eden 1.5 ml santrifüj tüplerine katmanlaştırıcı tohumları ile gerçekleştirilebilir. Yassı çimlenme sonrası bir hafta çıkarılabilir şeffaf bir kubbe ile kaplı olması gerekir. İlave fideler oyuk başına sadece bir fide bırakmak için çıkarılabilir. </li></ol></li><li> 20 dakika için 1-su içinde daire ıslatılmasıyla Su bitkileri her iki günde bir, daha sonra fazla suyu tahliye. Not: sulama tesisleri için zaman aralığı büyüme odası nem bağlıdır ve kararlı taban olması gerekirKullanıcının bitki büyüme tesisinin sürekli gözlem d. Onlar iyi sulanan emin olmak için her gün bitkileri kontrol edin. Sadece birkaç noktalar, su fışkırtma bir şişe üst gelenler bitkilerin kurutulması durumunda. </li><li> Ya da büyüme koşulları (photoperiod, sıcaklık) bağlı olarak 3-5 haftalık karşılık gelişim aşaması # 3.50 (rozet boyutu% 50 bitmiş boyut), yakın bitkiler üzerinde patojen enfeksiyonu tahlilleri (Adım 3-5) gerçekleştirin. Çiçeklenme ortaya çıkması (evre # 5) yaşa bağlı direnç 38,39 başlangıcından sonra bitkiler bulaştırmak etmeyin. </li></ol> Kültür Medya ve Tabaklar 2. Hazırlık <ol><li> Kral&#39;ın B (KB) sıvı ortam 1 L olun. Yavaşça 1000 ml görünür pelet yoktur 2 O kadar deiyonize H ile bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak 20 g proteoz pepton ve 2 g potasyum fosfat dibazik trihidrat karıştırın. 20 dakika bir sıvı döngüsü 150 ml&#39;lik bir cam şişe içine kısım 100 ml otoklav. </li><li> HazırlamakKB katı ortam ile kültür plakaları. <ol><li> Yavaşça 20 gr Proteoz peptonlu, 2 gr Potasyum Fosfat Dibazik Trihidrat ve 1000 ml 15 gr Agar deiyonize H 2 O karıştırın Otoklav. </li><li> Gelecekteki yoğunlaşmayı en aza indirmek ve antibiyotik bozulmasını önlemek için dokunmak serin kadar bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde orta soğutun. Ortam 1 ​​M MgSO 4 steril 18 ml steril% 80 Gliserol ve 5 ml. Psm ES4326 50 ug ml bir son konsantrasyona kadar soğutuldu ortamı içine streptomisin ekleyin streptomisin karşı direnç taşıdığı göz önünde - 1. </li><li> Plakaları dökün. 100 mm x 15 mm ve 150 mm x 15 mm Petri kapları: KB medya plakaları iki farklı boyutta hazırlayın. Daha küçük Petri içeren ortam birincil bakteri kültürü plakası olarak hizmet verir ve bakteri plaka sayma gibi büyük Petri kabı vermektedir. Not: plakaları sayma bakteriler için, dikdörtgen şekilli plakalar azaltmak için kullanılabiliriki katı kadar tedaviler geleneksel yuvarlak plakalara göre plaka başına çizilebilir beri sarf maliyet. <ol><li> Enfeksiyon deney öncesinde plakaları dökün. Streptomisin sülfat yana kadar 3/2 ay 4 ° C&#39;de saklayın KB aracı madde içinde plakaları kademeli antibiyotik aktiviteye 40 kaybeder. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Gelişmiş Hastalık Duyarlılık (EDS) <ol><li> 1. Gün - plaka üzerinde Streak bakteri <ol><li> İki gün EDS analizden önce, çizgi Psm ES4326 den -80 ° C gliserol stoğundan ° BB-Strep bakteriyel kültür levhası ve 24-48 saat süre ile 28 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> 2. Gün - sıvı kültür ve su bitkileri başlatmak <ol><li> , 28 ° CO / N 1 streptomisin ve 250 rpm&#39;de sallamak - 50 ug ml içeren 4 ml sıvı KB ortamı ile steril bir test tüpünde, sıvı kültürü başlatmak. Not: EDS enfeksiyonu testi için, genotip tavsiye edilir başına 6 bitkileri kullanaraked. STI ve MTI testlerde, tedavi başına genotip başına 6 bitki tavsiye edilmektedir. Bakteri inokulum için, 0.3 ve 0.6 arasında λ 600Nm optik yoğunluk ile taze sıvı bir kültürün kullanımı tavsiye edilir. </li><li> Mark örnekleme enfekte doku kolay tanımlama için bir künt uçlu su geçirmez işaretleyici ile yaprakları sayısı 5 ve 6 sapı (Şekil 1). Stoma açılmasını geliştirmek ve yaprak haline patojen çözümün girişini kolaylaştırmak, 20 dakika boyunca alttan düz iliklerine iyi bitkileri sulamak için, daha sonra aşırı suyu boşaltın. Not: Alternatif olarak, şeffaf bir kubbe ile düz kapak ve stoma açıklığı arttırmak için 2-4 saat boyunca suya daldırın. </li><li> 3. Gün - Patojen seyreltme ve şırınga infiltrasyonu Not: Sabah saatlerinde Patojen enfeksiyon duyarlı genotiplerin en belirgin hastalık belirtilerinin patojen çoğalması ve gelişmesi için en uygunudur. Infect tutmak için her türlü çabayıTutarlı iyon zamanlama deneysel tekrarlamalı arasında varyasyon azaltmaya yardımcı olur sirkadiyen ritimler ve gündüz gen regülasyonu 41,42 etkisini ortadan kaldırmak için. <ol><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 9600 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpü içinde 1.5 ml bakteri kültürü Pelet ve supernatant atın. Steril 10 1 ml mM MgCl2 ile bakteri pelletini. Not: Magnezyum katyonları P. motilitesini ve yapışma artırabilir Syringae 43.. Alternatif olarak, aynı konsantrasyonda MgSO 4 kullanın. Steril su Mg tuz çözeltileri için kabul edilebilir bir alternatiftir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde 10 mM MgCl2 9 ml bakteri süspansiyonu seyreltilir ve λ = 600 nm bir spektrofotometre ile bakteri optik yoğunluk (OD) ölçün. Nihai OD 600Nm 10 mM MgCl2 = EDS enfeksiyonu tahlili için 0.0002 ile bakteri ile seyreltilir. </li><li> Yaprak InfiltrateSeyreltilmiş bir bakteri çözeltisi ihtiva eder (genel olarak insülin şırınga olarak da bilinir) bir 1 ml&#39;lik kör uç iğnesiz şırınga. </li><li> Tam kapasite ile şırınga kadar doldurmayın. Sızma işlemi sırasında çok daha iyi bir kontrol sağlamak için 0.5-0.6 ml ile doldurun. </li><li> Işaret parmağı üstünde yaprak alt yüzeyini Açığa, yavaşça başparmak yardımıyla yaprak konumunu ayarlamak. Bu basınç eşit dağıtılmış sağlamak için yaprak yüzeyine dik şırınga yerleştirin. Yaprak hasarı azaltmak için sızma sırasında yaprak orta damarı alanı önlemek için deneyin. </li><li> Yavaşça bakteriyel çözüm sızmaya pistonu itmek; koyu renkli bir yaprak rengi ile gösterildiği gibi yaprak mezofil sıvı girişi görselleştirilecektir. Yaprağın tüm yüzeyini sızmak deneyin. Bu, tek bir girişimde başarılı değilse, başka bir infiltrasyon nokta seçin ve tüm yaprak yüzey kaplı kadar yukarıda açıklanan işlemleri tekrarlayın.</li><li> Tamamlandığında, yavaşça ilave patojen çözüm kaldırmak için emici dokusu ile yaprak leke. Görme hasar için enfekte yaprak dokusu inceleyin. Not: sızma tamamlandıktan sonra dairesel şırınga izlenim görünür olmamalıdır. </li><li> Orijinal büyüme koşulları içine dönmeden önce 1-2 saat kurumaya sızmış bitkiler bırakın. Sonraki su ile net bir kubbe sprey ve kapağı enfekte bitkiler 2 saat sonra açılış bir 2-3 üretmek ve enfeksiyon deney geri kalanı boyunca bunu bırakmak kubbeyi çatlak. Not: P. yana Syringae aynı tesiste yetiştirilen diğer bitkilere enfeksiyöz ajanı yayılma riski yoktur, bir havadan patojen değildir. Ancak, ilave bir önlem olarak, yakınlarda bulunan virüslü bitkiler ve diğer deneysel bitkiler arasındaki fiziksel temastan kaçının. Şeffaf bir kubbe ile düz Kaplama patojen virülansını artırmak ve hastalığın ilerlemesini hızlandırır.kaplama dönem bu adımı ve optimal süresi, kullanıcının bitki büyüme tesisinin nem koşullarına göre tespit edilmesi gerekmektedir ihtiyacı. </li></ol></li><li> 5. Gün - medya plakaları ön kurutmaya <ol><li> Soğuk depolama biriminin dışına 150 mm x 15 mm KB plakalarını alın ve plaka üzerinde herhangi bir ön mevcut su yoğunlaşmasını kurulayın. Yaklaşık 24 saat boyunca oda sıcaklığında tutularak kuru tabaklar. Bu işlemi hızlandırmak için, 30-60 dakika boyunca kırık onların kapaklı bir laminer akış kaputu koyun. Not: Bu adım, bir sonraki aşamada plaka yüzeyinde dairesel bir damlacık oluşumu için kritik önem taşır. </li></ol></li><li> Gün 6 - patojen büyümesini nicel Not: Aşağıdaki patojen miktar prosedür bakterilerin eşit miktarda bitkiler yaprak morfolojisi değiştirmiştir, özellikle yaprak halinde teslim edilmektedir teyit etmek için enfeksiyondan sonra erken zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. <ol><li> Ortaya çıkmasının ardından enfekte doku işleyinkloroz duyarlı genotiplerde enfekte dokuların sararma ile gösterilen ancak nekrotik lezyonlar gelişimi (Şekil 2B) daha önce. Not: Önerilen örnekleme süresi üç gün patojen aşılamadan sonra olduğunu. Patojen büyüme çevresel bir dizi faktöre bağlı olduğu, ancak, inkübasyon süresi 2 ½ 3 ½ günlük bir aralık içinde değişebilir ve kullanıcının bitki büyüme imkan enfeksiyon ilerlemesinin dikkat gözlemlerle tespit edilmesi gerekmektedir olabilir. <ol><li> Her genotip (Şekil 1) 6 taşlama tüpleri hazırlayın. Bir paslanmaz çelik öğütme topu yerleştirin ve her bir tüpe 10 mM MgCl2, steril 500 ul ilave edin. </li><li> Bitki enfekte yaprak ayırın ve 1 delikli kağıt zımba (Şekil 1) ile bir yaprak diski yumruk. Not: örnekleme hatasını en aza indirmek, aynı pozisyonda her örneklenmiş yaprak yumruk deneyin. Üst yaprak diskinin Örneklemeyaprağın tavsiye edilir. </li><li> Rasgele forseps kullanarak her öğütme tüpe (iki farklı bitkilerden) 2 yaprak diskleri yerleştirin. </li><li> Tüp kapatın ve 10 dakika süreyle maksimum hızda yüksek verimli bir homojenleştirici (dakikada 1600 vuruş) ile doku homojen hale getirilir. Doku iyi homojenize ve çözümleri nedeniyle enfekte yapraklardan klorofil sürümüne yeşile kadar gerekirse bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Homojenizasyon için beklerken, çok kanallı bir pipet ve pipetleme rezervuarı kullanarak 180 ul 10 mM MgCl2, 96 oyuklu bir kültür plakasına ilk 6 satır doldurun. </li><li> Öğütme işleminden sonra, 96-kuyulu plakanın ilk sıraya temel doku süspansiyonu 20 ul transfer ve sıvı yukarı ve aşağı pipetleme tekrar karıştırılır. Küçük doku parçaları ucu yapışmasına neden olursa, çözümün doğru hacmini edinmelerine yardımcı 2-3 mm tutturun. <ol><li> Üst o üzerinde damlacık için yeterli alan sağlamaklevha, uzay alternatif sıralardaki farklı genotipleri doku (Şekil 1) f. On kat seri seyreltme hazırlamak için, ikinci satıra 20 ul sıvı transferi ve altıncı seyreltme kadar bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Aktarım ayrılır pipet uçları (Şekil 1) kullanılarak 150 mm x 15 mm KB plaka üzerine 96-yuvalı plaka çözeltisi 20 ul. En yoğun en inceltilmiş süspansiyon çalışın. Not: En konsantre seyreltilmiş çoğu hareketle gereksiz seyreltilerde arasındaki pipet uçları değiştirmek için yapar. Plaka de önceden kurutulmuş ise (genellikle 15-30 dakika) absorbe kadar aktarılan damlacık ortamı üstünde sağlam kalmalıdır. Kuruma süresi, oda sıcaklığında ve nem ile değişir. </li><li> Kapak kırık ile oda sıcaklığında plaka kurulayın. Artık sıvı plaka yüzeyinde görülebilir kez kapak, ters kapatın ve oda sıcaklığında plaka ya da 28 ° C inkübatör inkübe. </li><li> Koloniler görünür hale gelene kadar 40-60 saat inkübe. Tabakalarına büyüme oluşturan üniteler (cfu) oluşturan koloni öngörülebilir 10 misli bir düşüş (Şekil 2C) yansıttığını teyit edin. Onlar büyümek ve koloniler sigorta önce bakteri sayın. Örtüşen kolonileri yok düşük sulandırma bakteri sayısını belirler. Genellikle tercih edilen seyreltme 10-50 koloniler arasında içerecektir sayılacak. Not: Varyasyon teknik çoğaltır arasında mevcut olabilir; Bu nedenle, her bir deney için düşük seyreltme ayrı belirlenmelidir. </li><li> Bakteriyel çoğalma seviyelerini hesaplamak için, üst üste (R) yanı sıra, yazılı olarak, her teknik tekrarında (T) içindeki bakteri sayısı sayısı belge. Koloni oluşturan birim sayısını belirler - formülü ile kob / yaprak disk: kob / yaprak disk = (T × 10 R / 20) 500/2 × </li><li> Süreden için aşağıdaki elektronik tablo şablonda verileri yazınbir grafik (Şekil 1) ce (elektronik tablo veri analizi şablon dosyası için, Tablo 2). Her veri noktası, logaritmik ölçekte altı teknik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak ifade edilir. Hata çubukları, ortalamanın% 95 güven aralığını temsil eder (n = 6). Not:% 95 güven aralıkları hesaplanması teknik çoğaltır sayısına göre ayarlanması gerekir. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. SA-Tetikledi Bağışıklık (STI) <ol><li> 1. Gün: Adım 3.1 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın. </li><li> Gün 2: Sıvı bakteri kültürü (Aşama 3.2) bitkiler sulama ve başlatılması yanı sıra, SA türevi sodyum salisilat 21 dış uygulama tarafından direnci sağladığım göstermektedir. Not: Saf SA zayıf suda çözünürlüğe sahiptir ve daha önceki pH ayarlama gerektiren, böylece, bu tahlil için tavsiye edilmez. <ol><li> P. karşı SA aracılı savunma indüklemek için syringae ve gelecekteki enfeksiyon 21 için prime bitkiler,(Sahte gibi) iyi bir 1 mM sodyum salisilat buğu veya H2O ile 24, püskürtme bitkileri patojen enfeksiyonundan önce 16-24 saat. </li></ol></li><li> 3. Gün: = OD 600Nm için 0.001 patojen seyreltme hazırlayın ve şırınga infiltrasyon (Adım 3.3) ile tüm yaprak yüzeyine bakteri itin. </li><li> 6. Gün: EDS tahlili (Adımlar 3.4 ve 3.5) için tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve saymak H 2 O ve Sodyum Salisilat - ayrı ön işlem örnekleri. Ön-muamele sistemleri - vahşi tür Arabidopsis thaliana için patojen büyümesinde 1-2 log azalma Sodyum Salisilat beklenmektedir. </li></ol> 5. MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI) Not: Bu deneme içinde, bizler, vahşi tip Arabidopsis Col-0 ve mutant fls2 ve efr kullanılan bitkiler. FLS2 ve EFR plazma membran lokalize Örüntü Tanıma Reseptörler (PRR) flg22 ve elf18 tanıyabilir, respe vardırctively 9,10. Psm ES4326 dış MAMP tedavi öncesi ve şırınga infiltrasyonu, aşağıdaki mutant değişmeden patojen büyümesinin ile gösterilir MAMP, spesifik tipte bir duyarsızlık her PRR sonuçları kaybı. <ol><li> Gün 1 ve 2: Adım 3.1 ve 3.2 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın. </li><li> 3. Gün: MAMP, tedavi öncesi ve patojen enfeksiyonu <ol><li> , MAMP-Tetiklemeli Dokunulmazlık kurmak flagellin epitop flg22 veya EF-Tu epitop elf18 ve 1 mcM solüsyonu hazırlamak için patojen enfeksiyonu (Adımlar 3.3.3-3.3.6) önce tüm yaprak yüzey 4 saat içine şırınga-sızmak. Bu P. karşı MAMP aracılı savunma indüksiyonu için sağlayacak syringae ve başbakan gelecek enfeksiyonu 6,37 için tesisler. Not: Kamuya açık mikrodizi verileri flg22 ya elf18 tedavi 37.44&#39;ü sonra 4 saat olur MAMP duyarlı genlerin yüksek transkripsiyon yeniden programlanması saptandı. Bu durumda, 4 saatlik önerilirCol-0 MAMP ile muamele edilmiş ve fls2 ve efr mutantlar arasında patojen büyümesinin açık bir fark elde sonuçlanır MAMP ön işlem süresi. </li><li> Emici doku ile ekstra MAMP çözüm çıkarın ve yaprak içindeki sıvı emme sürecini hızlandırmak için ortaya bitkiler bırakın. Şırınga basınç infiltrasyonu yaraladı etkisi hesaba katmak için, kontrol bitkilerinin yaprakları içine H 2 O sızmak. </li><li> OD 600 nm için patojen seyreltme hazırlayın = 0,001 MAMP / H2O ile önceden işlemden geçirilmiş bir şırınga infiltrasyonu ile yaprak (Aşama 3.3) tüm yaprak yüzeyine bakteri itin. </li></ol></li><li> 6. Gün: Adım 3.4 ve 3.5 de tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve ayrı ayrı H 2 O ve MAMP-ön tedavi örnekleri sayılır. Yabani tip Arabidopsis, patojen büyümesinde 1-2 log azalma kısmen güçlü olan, MAMP ön tedavisi yapılmış bitkilerde beklenmektedirflg22 aracılık ettiği er redüksiyon elf18 için karşılaştırıldı. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nüfusu mevcut arazileri azalan ve artan dünyada araştırmacılar ekin iyileştirilmesi için acil ihtiyaçları zorlanmaktadır. Verim büyük ölçüde çeşitli biyotik ve abiyotik streslere etkilenebilir. Bunlar arasında, patojen enfeksiyonu tek başına 45 ABD&#39;de yaklaşık% 12 kayıp sorumlu mahsul verim azalmasına önde gelen nedenlerinden biridir. Bu sorunu gidermek için, masif araştırma modeli Arabidopsis&#39;de yapılmıştır - P. syringae pathosystem kapsamlı bileşenleri ve b...

Nedeniyle sapsız doğası, bitkiler sürekli çeşitli yaşam tarzları ve beslenme stratejileri 1 sergileyen patojenlerin bir bolluk tarafından tehdit edilmektedir. Nekrotrofik patojenler aktif gizli toksinler ve enzimler konak dokusunu öldürmek ve ölü hücreleri 1 beslemek için ise bir ilk yaklaşım için, biotrophic patojenler, besin almak için hayatta onların ev sahibi korumak. Patojenler olarak adlandırılan hemibiotrophs başka bir grup, patojen birikimi 2 belli bir eşik ulaştıktan sonra nekrotrofik sahneye biotrophic sahne ve vardiya ile enfeksiyon kursu başlıyor. Etkili bu mikroorganizmalara karşı kendilerini savunmak amacıyla, bitkiler patojen saldırı tespit ve tetiklemek için birden fazla gözetim mekanizmaları ile donatılmış karmaşık bir doğal bağışıklık sistemini geliştirmişlerdir hücre ölümünü 3 yanı sıra Sistemik Kazanılmış Direnç (SAR) 4 programlanmış lokalize. Mevcut araştırma temel sig karakterize odaklanmıştırnaling bileşenleri ve bitki bağışıklık sistemi 5 içinde çapraz görüşmeler. &quot;Zik-zak&quot; modeli 5 önerildiği gibi, bitki doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin birinci tabaka bir mikrop istilasına tespit etmek için, plazma membran lokalize bir görüntü tanıma Reseptörler (PRR) varlığını gerektirir. PRR&#39;ler Mikrop İlişkili Moleküler Desenler (MAMPs) tanımak ve MAMP-Tetikledi Dokunulmazlık (MTI) 6 kurabiliyoruz. Antimikrobiyal PR proteinleri 7 kodlayan genlerin transkripsiyonel bir regülasyonunu indükleyici yanı sıra, MTI hücre duvarına reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ve reaktif nitrojen (RNS), kaloz birikimini içeren patojen büyümesini tutuklama etkinlikleri çeşitli yol açar yanı sıra birden fazla kinaz sinyal aktivasyonu 8 yolaklarıyla olarak. Şimdiye kadar, çok sayıda bakteriyel MAMPs flg22 9 da dahil olmak üzere, Arabidopsis&#39;te MTI tetiklemek için tespit edilmiştir </sup&gt; (Flagellin türetilen bir 22 amino asit fragmanı) ve yapısal hücre duvarı bileşeni elf18 10 (bakteriyel için uzatma faktörü Tu 18 amino asit), 11 peptidoglikanlar. Başarılı bir enfeksiyon kurmak için, bazı özel patojenler, hücre içi veya hücreler arası boşluklar içine gizli virülans efektör proteinleri yeteneği gelişti ve dolayısıyla MTI bastırmak ve Efektör-Tetikledi Hassasiyetinin (ETS) 12,13 tetikleyebilir var. Örneğin, hastalık oluşturma efektörler enfekte olmuş doku 14-16 içinde hastalık gelişimini azaltmak için TEB Mitojen Aktive Protein Kinaz (MAPK) fosforilasyon kaskadlar etkisiz hale getirebilir. Host ve patojen arasındaki dinamik işbirliği evrimi sırasında, bitkiler de efektör proteinleri tanır ve patojen hastalık oluşturma 17 molekülleri azaltmak için kontra strateji geliştirmiştir. Bu, doğrudan veya dolaylı efektör tanıma hastalık direnci (R) proteinleri 18 aracılık eder. T çoğuetek NB-LRG üyeleri (nükleotid Bağlama ve Lösin Zengin Tekrarlar) ailesi 19 vardır. R proteini tarafından avirulent efektör algısı Efektör-Tetikledi Bağışıklık (ETİ) 20 olarak karakterize güçlü ve daha geniş bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Savunma genlerinin 21 ekspresyonunu ve savunma metabolitlerinin 22 üretimini indükleyen yanı sıra, ETİ genellikle komşu doku 3 içine yayılmasını kısıtlamak için patojen Hiperduyarlı Cevap (HR) olarak bilinen bir hızla lokalize programlı hücre ölümüne yol açar. Programlanmış lokalize hücre ölümü 23 ek olarak, bitkileri (SAR) 4 Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç olarak adlandırılan uzun süreli ve sistem genelinde bir bağışıklık tepkisi başlatılması yeteneğine sahiptir. Bir biotrophic patojen ile tehditten sonra, bitki hücreleri, lokal ve sistemik dokularda 24 hem de endojen fitohormon salisilik asit (SA) ve PR proteinlerinin sentezini ve birikimini tetikler. T yoluylaHer ne kadar süreç, hazırlık yüksek bir durumu patojenlerin 24, geniş bir spektrum ile daha sonraki bir enfeksiyona karşı savunma davranışlarını sırasında daha hızlı bir montaj sağlar enfekte edilmemiş yaprak elde edilir. SA ve örneğin benzo gibi sentetik analogları (1,2,3) tiadiazol-7-karbotioik asit S-metil ester (BTH) ve 2,6-dikloroizonikotinik asit (INA) kimyasal Salisilik asit uyarabildiğinden (SA) dış uygulama 24 üzerine -Triggered Bağışıklık (STI). Patojenesis-ilgili genler 1 (NPR1) arasında Nonexpressor lokal ve sistemik dokularda 21,25,26 hem de SA aracılı savunma cevabı sırasında büyük bir kopyalama düzenleyicisi SA reseptörleri ve işlevlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Bu kesin NPR1 SAR kurulması için gerekli olan ve NPR1 kaybı, Pseudomonas syringae&#39;ye 25 doğru dramatik bir duyarlılığa yol açtığı gösterilmiştir. Yoğun bitki moleküler katkı karakterize etmek içinbitki-patojen etkileşimlerine bileşenleri, çok sayıda biyo-deneyler, ROS 27 patlama da dahil olmak üzere, belirli bir savunma etkinlikleri ölçmek için protein ürünlerinin 21 kaloz birikimi 28 savunma genleri ekspresyonunu ve birikimini geliştirilmiştir. Bu bireysel deneyler bitki bağışıklık tepkisinin özel bir forma anlayış sağlamak mümkün olmakla birlikte, bunların hiçbiri, ancak, tüm tesis düzeyinde tam bir savunma yanıtı temsil edebiliyoruz. Bunun aksine, enfeksiyondan sonraki patojen büyümesinin miktar organizma seviyesinde bağışıklık tepkisinin genel bir tahmin sağlar. Bu nedenle, kesin ve son derece standart patojen aşılama testinin geliştirilmesi ve optimizasyonu Arabidopsis bağışıklık tepkiler üzerine araştırma ve keşifler kadar yakıt için kritik öneme sahiptir. Pseudomonas syringae, bir Gram negatif bir bakteridir, Arabidops da dahil olmak üzere bitki hücrelerine bir dizi hastalığa neden olabilen bir fitopatojenin olarak tanımlandı29 olduğunu. P. - Model bitki-patojen sistemi, Arabidopsis gibi syringae etkileşim yaygın moleküler mekanizmaları altında yatan bitki savunma yanıtları 29 anlamak için uygulanmıştır. Şimdiye kadar, üzerinde 50 P. Syringae pathovars farklı bitki türlerinin 30 bulaştırmak için kendi yeteneklerine göre tespit edilmiştir . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 ve P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) 32 iki en yaygın olarak kullanılan ve yaygın karakterize öldürücü suşlar vardır. Kenara bitki tarafından tanınan ve MTI yanıtı tetikleyen olmaktan, Pst DC3000 ve Psm ES4326 MTI bastırmak ve patojen büyüme 31,33 lehine ETS tetiklemek için öldürücü efektör proteinleri salgılayan yeteneğine sahiptirler. Işlevsel Arabidopsis ve P. etkileşimini incelemek syringae, çoklu0; patojen enfeksiyon yöntemleri patojen teslim yaklaşımına dayalı geliştirilmiştir. Toprak yetiştirilen bitkiler için patojen şırınga infiltrasyonu, vakum infiltrasyonu, daldırma aşılama ve sprey aşılamadan 29,34 ile teslim edilebilir. Son zamanlarda, fide sel aşılama tahlil doku kültürü üzerinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için geliştirilen genç Arabidopsis bitkiler 35 plakaları yetiştirilen. Şırınga sızma, en sık kullanılan yaklaşım olarak, elle stoma 29 olarak adlandırılan doğal yaprak deliklerden apoplast içine patojeni sunar. P. Bu yaklaşım sayesinde, eşit miktarlarda syringae enfekte kanadı içine sızabilir ve bitki bağışıklık tepkisinin gücü ters patojen artışı seviyeleri ile bağıntılıdır. Bu nedenle, patojen büyümesinin ölçümü bütün bitki düzeyinde bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için en uygun yaklaşım olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, şırınga infiltrasyonu lokal ve sistemik doku ayırt edebilirsiniz, hangi olabilir bSAR 36 altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize uygulanabilir e. Aşağıdaki protokol, artan hastalık yatkınlık (EDS) için Arabidopsis mutantlar ekrana Psm ES4326 ile optimize edilmiş şırınga sızma testi açıklar. Bu protokol, iki Arabidopsis genotipleri istihdam sağlayacak: vahşi tip ekotipinin Columbia-0 (Col-0) bitkileri (kontrol) ve npr1-1 kayıp fonksiyon-mutantlar (hypersusceptible) Bu öldürücü bakteri suşu Psm ES4326 37 ile enfekte olacaktır. Npr1-1 mutant tirozin son derece korunmuş histidin değiştirir ve 25 fonksiyonel olmayan protein işler NPR1 molekülünün ankirin-tekrar konsensüs dizisi içinde bir nokta mutasyonu taşır. Buna ek olarak, şırınga süzme analizinde modifikasyonları bir dizi MTI ve STI da dahil olmak üzere bağışıklık tepkisi, spesifik tabakalar kusurların kantifikasyonuna izin veren bu tarif edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MetroMix 360&#160;</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>SNGMM360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large pots</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>TEKUVCC10TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x6 Inserts</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with no holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl propagation domes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>CW-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0122-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>151946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>SB0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-450&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MB0328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MN1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9992493&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding tubes&#160;</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for grinding tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Salicylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>s3007-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td>146308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu spin micro centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (10-100 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (30-300&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (20&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120 000.038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3552-HR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie permanent marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>507130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-890</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem

Özel bir mobil bağışıklık hücrelerinin yokluğunda, bitkiler lokalize programlanmış hücre ölümü ve Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç patojen saldırısına karşı kendilerini savunmak için kullanmaktadır. Genel bitki bağışıklık tepkisinin belirli bir Arabidopsis geni katkısı spesifik olarak ve kantitatif olarak enfekte olmuş doku içinde patojen büyümesinin tahlil ile değerlendirilebilir. Üç yılı aşkın süredir, hemibiotrophic bakteri Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) yaygın Arabidopsis bağışıklık tepkisini altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model patojen olarak uygulanmıştır. Yaprak dokusuna patojenleri teslim etmek, birden fazla aşılama yöntemleri kurulmuştur, örneğin, şırınga sızma, daldırma aşılama, sprey, vakum infiltrasyon ve sel aşılama. Aşağıdaki protokol yetişkin yaprakları içine zehirli Psm ES4326 sunmak için optimize edilmiş bir şırınga sızma yöntem açıklanırArabidopsis bitkileri, toprak yetiştirilen ve doğru bu patojenin yönelik artan hastalık yatkınlık (EDS) için ekran. Buna ek olarak, bu protokol daha Salisilik Asit (SA) -Triggered Bağışıklık (STI) ve MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI) dahil bitki savunma farklı katmanları, içinde belirli bağışıklık kusurları incelemek için birden fazla ön tedaviler ile takviye edilebilir.

Burada açıklamak protokol optimize edilmiş P. temsil syringae şırınga sızma deneyi nicel Arabidopsis bitkilerde bağışıklık tepkisini değerlendirmek için. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, Psm ES4326 şırınga infiltrasyonu sulandırılmış hali ve koloniler numaralandırma ile patojen ekstre edilmek ve nicelendirilmek izlemektedir. Protokol metin içinde Aşama 3&#39;de tarif edildiği gibi, Psm ES4326 karşı ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem at JoVE

Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patosistemini Kullanarak Bitki Savunma Yanıtlarının İnce Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

bacterial-leaf-infiltration-assay-for-fine-characterization-plant

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

21.6K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Video: Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize conserved microbial features called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and this detection leads to PAMP-triggered immunity (PTI), which effectively prevents colonization of plant tissues by non-pathogens1,2. The most well studied system in PTI is the FLS2-dependent pathway3. FLS2 recognizes the PAMP flg22 that is a component of bacterial flagellin. 
Successful pathogens possess virulence factors or effectors that can suppress PTI and allow the pathogen to cause disease1. Some plants in turn possess resistance genes that detect effectors or their activity, which leads to effector-triggered immunity (ETI)2.
We describe a cell death-based assay for PTI modified from Oh and Collmer4. The assay was standardized in N. benthamiana, which is being used increasingly as a model system for the study of plant-pathogen interactions5. PTI is induced by infiltration of a non-pathogenic bacterial strain into leaves. Seven hours later, a bacterial strain that either causes disease or which activates ETI is infiltrated into an area overlapping the original infiltration zone. PTI induced by the first infiltration is able to delay or prevent the appearance of cell death due to the second challenge infiltration. Conversely, the appearance of cell death in the overlapping area of inoculation indicates a breakdown of PTI. 
Four different combinations of inducers of PTI and challenge inoculations were standardized (Table 1). The assay was tested on non-silenced N. benthamiana plants that served as the control and plants silenced for FLS2 that were predicted to be compromised in their ability to develop PTI.

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

A cell death-based assay for PTI in Nicotiana benthamiana plants is described.

Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Methods Article

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi