Bu yöntem, bozulmamış arabidopsis yapraklarında bağışıklık gibi dinamik biyolojik olay sırasında ilgi bir genin spatiotemporal düzenleme cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı bize toprak bozulmamış bitki yaprakları birkaç gün içinde yetiştirilen organizatör faaliyetinin spatiotemporal dinamikleri yakalamak için izin verir. Bu yordamı başlatmak için, otoklavlı toprak ile bir plastik hücre fiş tepsisi doldurun.
Her hücreye bir transgenik arabidopsis tohumu ekin. Tepsiyi 23 santigrat derecede tutulan bir büyüme odasına aktarın ve bitkileri 2-3 hafta boyunca sürekli beyaz ışık koşullarında büyütün. Patojen aşılamadan iki gün önce, litrebaşına 100 miligram rifampisin ve litre başına 50 miligram kanamisin içeren NYG ortamına gliserol stoğundan avrRpt2 taşıyan patojeni çizgi.
48 saat boyunca 28 derecede kuluçkaya yat. Plastik ipuçları kullanarak, orta yüzeyinde görünen bakteri hücreleri hasat. Bakterileri 10 miliMolar magnezyum klorür içeren plastik bir tüpe aktarın ve yeniden askıya alın.
Daha sonra çözeltinin optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün. Bakteri hücrelerinin son konsantrasyonu, normalde 0,2 OD600'e karşılık gelen mililitre başına 100 milyon koloni oluşturan üniteye ayarlayın. İlk olarak, dikkatle bitki zarar vermemek için emin olmak için bir iki ila üç haftalık bitki içeren bir hücre fişi kesip.
İyi bir denge sağlamak için hücreyi boş bir hücre fiş tepsisine ayarlayın. Aşılama için gözle görülür derecede sağlıklı bir yaprak seçin. Genel olarak, bitkinin altından üçüncü, dördüncü ve beşinci yaprakları işlemek kolaydır dikkat çekiyor.
Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme için aşılamadan önce bitki tutan toprağı sulayın. İsteğe bağlı olarak, strese duyarlı organizatörler analiz ederken, YFP sinyalinin yokluğunu doğrulamak için patojen aşılamadan önce bir floresan stereomikroskop altında yaprakları inceler. Daha sonra, infiltrasyon sırasında patojen ile doğrudan temas tan kaçınmak için tek kullanımlık lateks eldiven takın.
Bir mililitre iğnesiz plastik şırınga kullanarak, dikkatle bakteriyel süspansiyon ile yaprağın eksenel tarafına sızın. Yaprağın yarısına küçük bir porsiyon aşılama pr1 organizatörü aktivitesinin iyi bir görselleştirme sağlar. Sızmış yaprak üzerinde sızmış alan çevreleyen bölgeden herhangi bir aşırı bakteriyel süspansiyon emmek için yumuşak bir kağıt havlu kullanın.
Aşılamadan hemen sonra, plastik tepsiye bir cam slayt düzeltmek için cerrahi bant kullanın, böyle sızmış yaprak cam slayt merkezinde yer alır. Aşılanmış yaprak bıçağın cam kaydıraktan tamamen takılı olduğundan emin olun. Sızmış yaprağın petiole boyunca boşluk sığdırmak için iki parça halinde çift katmanlı plastik bant bir parça kesin ve her parça kapalı bir köşe kesti.
İnce cımbız bir çift kullanarak, her parçanın kesme köşeleri yaprak bıçağıtabanı ile hizalamak, bant parçaları petiole veya yaprak bıçak dokunmadığından emin olmak gibi petiole her iki tarafında bant bu parçaları sopa. Daha sonra metin protokolünün ikinci şekil ikisinde belirtildiği gibi çift katmanlı plastik bant ek bir parça hazırlamak. Petiole üzerinde bir köprü oluşturmak için daha önce yapıştırılan parçaların üstüne bant bu parça sopa, doğrudan bant parçaları arasında petiole veya yaprak bıçak yakalamak için dikkatli olmak.
Daha sonra küçük bir parça cerrahi bandı yaprak bıçağının ucunun üzerindeki cam kaydırağa yapıştırın, böylece kaydırağa çok yumuşak bir şekilde sabitlenir. Yalnızca bandın doğrudan cam kaydırağa dokunan kısmına sıkıca bastırın. Petiole'nin ve plastik bant parçalarının sınırına küçük bir parça daha yerleştirin, böylece petiole hem cam kaydırağa hem de plastik bant parçalarına çok yumuşak bir şekilde sabitlenir ve cerrahi bandın doğrudan cam kaydırağa veya plastik bant parçalarına dokunan kısmını sıkıca iliştirdiğinden emin olun.
200 mikrolitrelik pipet uçlarını yavaşça toprağa takın ve komşu yaprakları sızmış yapraktan hafifçe uzak tutun. Önce floresan stereomikroskopu açın. Görüntüleme için stereomikroskop objektif lens altında uzaya bitki ayarlayın.
Hızlandırılmış görüntüleme parametrelerini ayarlayın. YFP sinyalini görselleştirmek için geleneksel YFP filtresini kullanın. PCD etki alanıNın YFP pozitif hücre katmanlarıyla çevrili karanlık bir alan olarak görülebilmesi için klorofil otofloresansını görselleştirmek için Texas Red filtresini kullanın.
Daha sonra ek ışık maruziyeti adımları için geleneksel epi-parlak alan kurulumkullanın, ışık bitki bağışıklığı üzerinde önemli bir etkisi olduğu gibi zaman atlamalı görüntüleme aralık döneminde ışığa maruz kalma için program adımları emin olun. Hızlandırılmış görüntüleme programını çalıştırın. Birkaç gün boyunca uzun süreli gözlem için, uygun bitki sulama düşünün.
Görüntü ediniminden sonra, veri kümesinden aralıklarla ışığa maruz kalmak için kullanılan ekstra kanalları atlayabilirsiniz. Görüntü analizi yazılımını kullanarak, verileri ilgi alanı analizi gibi çeşitli yöntemlerle analiz edin. Bu çalışmada, intravital zaman atlamalı görüntüleme için arabidopsis yapraklarının montajı için çok yönlü bir yöntem gösterilmiştir.
AvrRpt2 indüklenen ETI kullanılarak zaman atlamalı görüntü verilerinin temsili bir örneği hem bir dizi görüntü hem de hızlandırılmış film olarak elde edilir. AvrRpt2 indüklenen ETI sırasında pPR1-YPF-NLS kullanılarak yapılan başarılı deneylerde, YFP'nin foci'yi ve PCD etki alanını çevreleyen çeşitli hücre katmanlarından anlaşılarak PR1 organizatörünün geçici aktivasyonu gözlenmektedir. PCD etki alanını çevreleyen hücrelerde PR1 organizatörü aktivasyonu genellikle yaklaşık beş saat sonra aşılama başlar, yaklaşık 12 saat post aşılama zirveleri ve 40 saat sonrası aşılama kadar sürer.
Bu yordamı denerken, zaman atlamalı koşulların metinde açıklandığı gibi dikkatle belirlenmesi gerekir. Bu yordamı takiben, organizatör etkinliği analiz yazılımı kullanılarak nicel ve nitel olarak analiz edilebilir. Bu analizler arabidopsis bitkilerinin yaşayan yapraklarında meydana gelen herhangi bir biyolojik olayda gen ekspresyonunun spatiotemporal dinamiklerini keşfetmemize yardımcı olur.
