Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Bu tahliller değerlendirmek ve farklı bitki genotiplerinin bağışıklık çıktıları karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniklerin en büyük avantajı, hızlı, güvenilir ve ortak laboratuvar ekipmanları kullanmak olmasıdır. Büyüme inhibisyonu töziçin, aynı boyutta ve yaştaki fideler, değişimi sınırlamak için tartılmadan önce nakledilmeli ve tamamen kurutulmalıdır.

Çimlenmeden dört ila beş hafta sonra, Arabidopsis bitkibaşına göre bir yaprak diski çıkarmak için dört milimetrelik keskin bir biyopsi yumruğu kullanın, midveinden kaçının ve yaralanmayı sınırlamaya dikkat edin. Desiccation önlemek için, kuyu başına çift distile su 100 mikrolitre içeren kullanılmayan 96-iyi luminometer plaka bireysel kuyular halinde diskler toplayın, adaxial tarafı kadar. Birden fazla elicitors değerlendirirken, her elicitor tedavisi için aynı yaprak diski çıkarın ve yaprak diskler oda sıcaklığında bir gecede kurtarmak için izin vermek için kapağı ile plaka kapağı.

Ertesi sabah, dinamik oksidatif patlamayı yakalamak için mikroplaka okuyucu parametrelerini 40 ila 60 dakikalık bir süre içinde iki dakikalık aralıklarla 1,000 milisaniyelik bir tümleştirme süresine ayarlayın. Daha sonra, her kuyudaki suyu 100 mikrolitre taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisi ile değiştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın, buna bir kontrol, her genotip için elicitor reaksiyonu olmadan, elicitation yokluğunda bazal reaksiyon oksijen türleri seviyelerini değerlendirin. Daha sonra, mikroplaka okuyucudaki görünür spektrumdaki tüm dalga boyları için ışık emisyonuna hemen görebilen.

Çimlenme sonrası dört gün, elicitor peptid seyreltme ile birlikte MS orta 500 mikrolitre ile 48-iyi plaka her kuyu yükleyin. Daha sonra, her peptid seyreltme altı ila sekiz fide dikkatlice nakli için steril forceps kullanın, kök için fide veya kırılma hiçbir zarar olduğunu ve kök orta batık olduğunu dikkat. Tüm fideler kaplandığında, plakaları Mikropore bantla kapatın ve bitkileri 8 ila 12 gün boyunca standart kısa gün koşullarına yerleştirin.

Yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek için, dikkatle her kuyudan fide çıkarmadan önce büyüme inhibisyonu görsel olarak kaydetmek için bir fotoğraf çekmek. Sonra, kurubir kağıt havlu üzerinde kökleri dab ve analitik bir ölçekte her fide tartmak. Bu temsili deneyde, hiperaktif immün sinyalizasyonu olan mutant bitkiler yabani tip Arabidopsis bitkilerine göre daha yüksek kümülatif ve ortalama oksidatif patlama gösterirken, bağışıklık sinyali bozulmuş mutant bitkiler 10 ile 1000 nanomolar arasında konsantrasyonlarda azaltılmış oksidatif patlama göstermiştir.

100 ve 1,000 nanomolar elicitor peptid konsantrasyonlarında yetişen tüm genotipler arasında fide büyüme inhibisyonunda beklenen farklılıklar da ayırt edilebilir. 1, 000 nanomolar peptid seyreltme büyüdü, hiperaktif bağışıklık sinyali ile mutantlar belirgin aynı koşullar altında yetiştirilen yabani tip bitkilerdaha küçüktü, bozulmuş bağışıklık sinyali ile mutantlar yabani tipi bitkilere göre büyüme zayıf bir inhibisyon gösterdi. Bu yöntemler erken ve geç immün yanıtlar için kanıt sağlar.

MAP kiazaz tahlilleri, patojen kaynaklı gen ekspresyonu ve enfeksiyon tahlilleri de dahil olmak üzere diğer birçok teknik, bu yolları nitada etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, patojen reseptör proteinlerini ve diğer bazı sinyal bileşenlerini başarıyla tanımlayan büyük ölçekli ekranlarda kullanılmak üzere değiştirilmiştir.