Bu çalışma SST İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_135278) bir hibe ile desteklenmiştir. MOP AXA Araştırma Fonu doktora hibe faydalanıcısı olduğu. Biz Şekil 1 tasarımı ile yardım için Patricia Nigg teşekkür ederiz.

Önce başlangıç ​​Not: Kullanım laminer akış kaput ve uygun biyolojik tecrit canlı virüs ile çalışırken. Burada, kültür, influenza virüs suşu A / WSN / 33 uygun büyüme koşulları açıklar. Enfeksiyon (MOI) ve inkübasyon süreleri, kullanılan virüs suşu bağlı olarak değişebilir. Biyotinilat A / WSN / 33 Virüs 1. Hazırlık <ol><li> Tohum Madin-Darby köpek kindey (MDCK),% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (pen / strep) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) kullanılarak T175 cm 2 şişe içine hücreleri. Yaklaşık% 70 konflüansa kadar 37 ° C &#39;de kültür hücreleri ulaşılır. </li><li> Enfeksiyon öncesinde, orta çıkarın ve hücre tekli tabakası kapak için yeterince büyük bir hacim ilave edilerek, fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.0-7.3) hücreleri yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve 10 -4 bir İçişleri Bakanlığı ile A / WSN / 33 ile hücreleri enfekte. PBS virüs seyreltin 0.02 mg Mg 2+, 0.01 mg Ca 2 + &lt;ile desteklenmiş/ sup&gt;,% 0.3 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve% 1 Pen / Strep (enfeksiyon PBS). Bir T175 cm2 şişe için 4 ml bir inokulum kullanın. </li><li> Hücreler, 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. Şişe içine% 0.3 BSA, 20 mM HEPES,% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş aspirasyon ve pipet 10 ml DMEM ile inokulum çıkarın. </li><li> Daha sonra, hasat süpernatan görülebilir ve sitopatik etki (CPE) kadar yaklaşık 3 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. CPE dekolmanı ve hücrelerin 14 ölümü ardından hücrelerin yuvarlama olarak kabul edilebilir. </li><li> Hücre debrisini uzaklaştırmak için 5 dakika süreyle 450 x g&#39;de süpernatan dönerler. Yeni şahin tüp içine süpernatant aktarın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Pelet atın. </li><li> Ultrasantrifüj tüpleri ve NTE tampon maddesi (10 mM Tris [pH 7.4], 100 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde seyreltildi,% 30 sukroz, 5 ml örtü süpernatantlarma Aktarım süpernatanlar. Ultrasantrifügasyon önce tüpleri Denge ve 30 ml&#39;lik bir son hacmi ulaşmak için PBS ile doldurun. Spin Superna112.398 x g&#39;de tants bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca (bir SVV28 rotor 25.000 rpm&#39;de karşılık gelir). </li><li> Dikkatle pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS içinde 4 ° C&#39;de gece boyunca virüs pelet ıslatın. Yukarı ve aşağı pipetleme süspanse edin pelet. Bradford tahlili 15 ile arıtılmış, virüs protein içeriğini ölçmek. </li><li> Biyotinlenmiş A / WSN / 33 oluşturmak için bir biyotinilasyon kiti kullanın. Üreticinin talimatları uygulayın. </li><li> Kısaca, saflaştırılmış virüs biyotin uygun miktarda ve buz üzerinde 2 saat boyunca inkübe edilir. Ultrasantrifüj işlemi tüp virüs aktarın ve 30 ml&#39;lik bir son hacme ulaşmak için PBS ile tüp doldurun. Bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika 112.389 xg&#39;de virüsü Spin. Pipetleme süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de gece boyunca pelet bekletin. Kısım en az 24 ay süreyle stabil olacak -80 ° C&#39;de saklandı Biyotinile edilmiş virüs depolamak ve. NOT: biyotinlenmiş p titresi belirlemek için yararlı olabilirStandart plak yöntemi ile IAV onarımı. Bununla birlikte, daha sonraki protokolü sadece biyotinlenmiş virüs partikülleri ölçecek dikkat edilmelidir. Nedeniyle eksik biyotinilasyon için biyotinile edilmemiş parçacıklar Kalan plak deneyi ile değil, ek / içselleştirme tahlilinde ölçülen sinyalin bulaşıcı titresi katkıda bulunacaktır. </li></ol> 2. Biyotinile Virüs Gerekli miktarı belirleyin Not: bağlanma / içselleştirme deney gerçekleştirilmeden önce, bir numunenin tüm hücreleri enfekte etmek için gerekli olan biyotinlenmiş virüs miktarını belirlemek için önemlidir. <ol><li> Kültür ve üreticinin talimatlarına göre trypsinize A549 hücreleri. Hücre bölme kullanarak hücreleri sayın. FACS içine Pipet 200.000 A549 hücreleri tüpler derin bölmeli. Spin 450 x g&#39;de 3 dakika. 200 ul PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Serin hücreleri, buz üzerinde 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Bioti 5-kat seri dilüsyonları hazırlayınEnfeksiyon-PBS içinde nylated virüs stoku. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de hücreleri içeren Spin tüpler. 100 ul virüs içeren enfeksiyon PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Biyotinlenmiş virüs olmadan sahte kontrolü kullanımı enfeksiyon PBS gibi. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Tespit için 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. % 3.7 paraformaldehid (PFA) 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın. </li><li> Geçirgenliği için, 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. % 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatan pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 6 dakika süreyle inkübe edilir. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldırPBS STV- Cy3 ihtiva eden seyreltilmiş 50 ul% 2 BSA et. (Lütfen dikkat, STV-Cy3 uygun konsantrasyonu deney başlamadan önce belirlenmelidir 1 konsantrasyonunda ile başlayın. Kat 2 dilüsyonları kadar 1 200 ve test. 2400 Bizim ellerde, 1 bir seyreltme: kanıtladı 1000 optimal olduğu). </li><li> Oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat inkübe edin. Daha sonra, tekrar yıkama aşaması 2.4&#39;te açıklandığı gibi, ama PBS içinde seyreltilmiş 200 ul% 2 BSA pelletini. </li><li> 16 flow sitometri örnekleri analiz edin. Cy3-pozitif nüfus Kapısı. A549 popülasyonda Cy3-pozitif hücrelerin maksimum sayıda yol biyotinlenmiş virüsün düşük konsantrasyonu yapın. </li></ol> 3. Streptavidin Gerekli miktarı belirleyin Not: Hücre dışı virüs gelen sinyalin bloke verimi deneyinin bir algılama aralığı belirler. Bu nedenle, mümkün olduğunca STV- Cy3 sinyali ortadan kaldırmak için önemlidir. ThSTV gerekli miktarda gerekli e (bölüm 2 belirlenen) kullanılan biyotinlenmiş virüs stokunun miktarına bağlıdır. <ol><li> Adımları 2,1-2,4 izleyin ancak 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonu kullanın. </li><li> PBS,% 2 BSA ve% 0.1 sodyum azit içeren içerisinde seyreltilmiş STV beş kat seri dilüsyonları hazırlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 50 ul STV seyreltme süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Sahte kontrolü kullanımı gibi PBS STV olmadan% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif. </li><li> Adımlar 2.5-2.9 izleyin. Içselleştirme tahlil için, (herhangi bir STV da bulunduğu numune ile karşılaştırıldığında), Cy3-sinyali güçlü bir blok elde STV en düşük konsantrasyonunu belirleyin. Bunun için, CY3-pozitif hücreleri veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir. İdeal olarak, STV ile tedavi numunelerin Cy3 sinyali mock-enfekte gelen sinyale kadar yakın olmalıdırmümkün olduğu hücreler. </li></ol> 4. Eklenti / İçselleştirme Deneyi NOT: Deneye başlamadan önce tüm reaktifler hazırlamak için emin olun. Protokole üç kontrol sonuç bölümünde (sahte enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz ön-muamele edilmiş hücreler ve sodyum azit ile muamele edilmiş hücreler) yer alan grupların küçük değişiklikler için gereklidir. <ol><li> Her 200.000 A549 hücreleri içeren 16 derin kuyu tüpleri hazırlayın. Sonraki 4 tüpten oluşan deney seti, 3 kontrol koşulları gerektiren her 4 tüp vardır: sözde-enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz (NA) -pretreated hücreleri ve sodyum azit ile tedavi edilen hücreler. Her grup &#39;0 dk&#39;, &#39;0 dakika + STV&#39;, &#39;30 dakika &#39;&#39;30 dakika + STV&#39; olarak etiketlenmiş 4 borulardan oluşmaktadır. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> 450 x g&#39;de 4 ° C&#39;de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldır% 0.3 BSA, 20 mM HEPES ve% 1 penisilin-streptomisin (kuluçka ortamı) ihtiva eden 200 ul DMEM içinde ve çal. 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. NOT: bakteriyel nöraminidaz (örneğin siyalidaz Vibrio kolera itibaren) mi hücrelerin yeniden askıya almak için inkübasyon ortamı içinde seyreltilmiş / 200 mU bir konsantrasyonda: nöraminidaz kontrolü için. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 10 dakika buz üzerinde aşağı, sonra bu adımı serin tüpleri bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. (Enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonunu kullanın) virüsü biyotinile 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif. NOT: enfeksiyon PBS virüsü olmadan: mock-enfekte kontrolü için. Sodyum azid kontrolü için: enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş Kullanım virüsü% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş. </li><li> ProfesyonelBuz üzerinde enfeksiyon sonrası numune cessing: <ol><li> Diğer numuneler sabit kadar &#39;0 dak&#39; numuneler için, 4 ° C&#39;de adım 2.5 ve mağaza örnekleri izleyin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de&#39; 0 dakika + stv &#39;örnekleri, santrifüj tüpleri için. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3&#39;te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de &#39;30 dakika&#39; örnekleri, santrifüj tüpleri için. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C&#39;de 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir. </li><li> &#39;3 için0 dakika + stv &#39;numuneleri 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüpler dönerler. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C&#39;de 30 dakika kuluçkalayın. Daha sonra, 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3&#39;te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir. </li></ol></li><li> Adımları 2,6-2,8 izleyin ve flow sitometri örnekleri analiz. Her bir numunedeki Cy3-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li><li> Yüzde ekli virüs ve içselleştirilmiş virüs nispi miktarını hesaplayın. <ol><li> Ekli virüs miktarını hesaplamak için, Cy3 positi yüzdesini kullanıngeçirilen hücreler ya da Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu ettik. Karşılaştırma için, 100% (Şekil 4B) muamele edilmemiş hücreler ayarlayın. Not: bağlı virüs yüzdesi &quot;0 min&quot; numune tarafından tarif edilmektedir. </li><li> Içselleştirilmiş virüs miktarını hesaplamak için, &quot;30 dakika&quot; örnek (Şekil 5B) ile &quot;30 dakika + STV&quot; örnek oranı alır. Not: Yukarıda sözü edildiği gibi, Cy3 pozitif kapılanmış hücrelerin veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+influenza+A+virus:+host+factors+and+antiviral+targets.">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virolog. 2, (2007).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN.">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li><li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans.">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li><li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry.">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li><li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication.">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li><li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu:+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy.">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li><li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes.">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li><li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death.">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Macey, M. G., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).</li><li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bizim protokol akış sitometri virüs eki ve içselleştirilmesi ölçmek için kolay bir yol açıklar. Bu, virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) kullanımı ile karşılaştırıldığında bu daha yakından taklit virüsü enfeksiyonlarının etiketli yabanıl tür virüsün kullanılmasını mümkün kılar. Protokol IAV bağlanmasını ve içselleşmesini ölçmek için optimize edilmiş olsa da kolayca diğer virüsler için adapte edilebilir. Akış sitometri okuma için kullanılan ek olarak, ko-renklendirm...

Influenza A virüsü (IAV) giriş hedef hücrelere 1 plazma membranında reseptörlere virüs bağlayıcı ile başlayan bir çok-aşamalı süreçtir. IAV reseptörü glikoproteinlerin ve glikolipitlerin çok çeşitli üzerinde mevcut olan sialik asit. Viral zarf içinde mevcut olan IAV bir hemaglütinin (HA) proteini sialik aside bağlanır ve böylece hedef hücrelerin 2 plazma zarına viral partiküllerin bağlanmasına aracılık eder. Virüs 3-6 tarif edilmiştir klatrin dolayımlı endositoz yoluyla hücrelerin değil, aynı zamanda, makropinositozlar gibi alternatif giriş yolları, girer. HA ve sialik asit arasındaki etkileşim, her iki aracı bağlanma ve viral parçacıkların 7 içselleşmesini tetiklenmesi için yeterli olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, alternatif giriş reseptörleri öne sürülmüştür ve IAV girişi rolleri şu anda 1,8,9 araştırılmaktadır. Sokak köpeğirently çabalar acil olarak ihtiyaç duyulan yeni antiviral tedaviler 10-12 geliştirilmesi amacıyla, virüsün yaşam döngüsünde yer alan ana bilgisayar faktörlerini tanımlamak için yapılır. Virüs girdi onun erken noktada viral enfeksiyon engellemek için IAV büyümeyi hedeflemek için olumlu bir adım olacaktır. Virüsün genellikle büyük miktarlarda gelen virüs tespit etmek gerekli olarak IAV girişi farklı aşamalarını Ölçme deneysel zordur. Buna ek olarak, virüs girişi değişiklikleri için algılama aralığı nedeniyle viral replikasyon eksikliği sadece doğrusal olduğunu. Bu yüksek hassasiyet ile tahliller ihtiyacını vurgulamaktadır. Burada takdim deney hücreye birleşik virüs toplam miktarına bağlı olarak, hücre yüzeyinde bağlanmış virüsünün taranmasında olarak içsel virüs tespit edilmesine olanak sağlar. Biyotinlenmiş yabanıl tür virüsün kullanımı flow sitometri STV-Cy3&#39;e ile boyama ve okuma yoluyla uygun ölçüm sağlar. Biyotinile virüs hücreye soğuk sınırdırs eki izin ancak viral parçacıkların içselleştirilmesi önlemek için. Hücreler, sabit permeabilize ve ekli virüs ölçmek için STV-Cy3 ile boyanmış olabilir. Bir bloke etme adımı olmayan hücreler etiketli streptavidin (STV) ile inkübe edildiği tespitten önce uygulanırsa, hücre dışı, bağlı virionlar sinyal iptal edilebilir. Bir sonraki adımda, biyotinlenmiş IAV bağlanmasını takiben, sıcaklık 37 ° C&#39;ye kaydırılır ve viral parçacıkların içselleştirme gerçekleşmesi sağlanır. Içselleştirilmiş parçacıklar, böylece ekstra ve hücre içi virüsler arasında ayrımcılık sağlayan STV bağlanması korunur. Deneysel koşul başına, dört numune gereklidir: &#39;0 dk&#39;: İlk örnek, etiketlenmiş &#39;0 dakika&#39; hücre yüzeyinde soğuk bağlı virüs ölçmektir. &#39;0 dk + STV&#39;: İkinci örnek, &#39;0 dk + STV&#39; etiketli, deney temel sinyal yoğunluğu verir. Ekli virüs zekâ engellendih STV ve STV-Cy3 ile sinyal aşağıdaki boyama &#39;0 dak&#39; örnek kıyasla çok daha düşük olmalıdır. &#39;30 Dakika &#39;: üçüncü numune, &#39;30 dakika&#39; nedeniyle, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;ye kadar bir sıcaklık geçişi eklenmiş ve virüs içselleştirilir içerir. &#39;30 Dakika + STV &#39;: Dördüncü örnek, &#39;30 dakika + STV&#39; önlemler virüslerin hücre içi fraksiyon. STV bloke etme adımı 30 dakika inkübasyon süresi sonrasında uygulanır. Bunun bir sonucu olarak, hücre yüzeyinde viral partiküller STV- Cy3 ile lekeleme için tek içsel virüsleri uygun ayrılan STV bağlıdırlar. Içsel virüs nispi miktarı &#39;(örnek &#39;30 dakika tarafından anlatıldığı gibi) bir virüs toplam miktarına bölünmesiyle elde edilen (örnek &#39;30 dakika + stv olarak ölçülür)&#39; içsel virüs oranı olarak hesaplanabilir. Kontroller olarak, sözde-enfekte edilmiş hücreler dahil etmektedir. Mock-enfekte olmuş hücrelerde STV-Cy3 boyaması aşağıdaki sinyal arka plan verirboyama protokolünden elde edilir. IAV bağlanması için bir kontrol bakteriyel nöraminidaz (NA) içeren hücrelerin önceden bir tedavi yöntemidir. Hücresel glikoproteinlerin gelen sialik asit kapalı NA böler, böylece hücre yüzeyinden eki reseptörleri çıkarılması. Sodyum azid (SA) etkili bir metabolizma inhibitörüdür ve böylece blok 13, endositoz. Sodyum azid ile muamele hücreler internalizasyonundan bağlanma virüsü için pozitif ancak negatif olmalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Dört farklı deneysel koşullar açıklayan bir çizgi, Şekil 1 &#39;de gösterilen bir temsili örneğin sonuçları Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, -. 5. &quot;0 dak&quot; örnek olarak, biyotinile virüsü soğuk bağlanır STV- Cy3 boyama ile görselleştirilebilir hedef hücrelere (Şekil 1 ve 2). (&quot;0 dakika + STV&quot; örnek olarak) bir bloke etme adımı uygulandığında, hücre yüzeyinde virüs artık STV- Cy3 boy...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.