Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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この作品は、のSStにスイス国立科学財団（31003A_135278）からの助成金によってサポートされていました。 MOPはAXA研究基金から博士助成金の受益者です。我々は、 図1の設計のヘルプはパトリシア・ニグに感謝します。

開始前の注意：使用層流フード、適切な生物学的封じ込め生ウイルスでの作業。ここで、我々は、培養インフルエンザウイルス株A / WSN / 33の適切な成長条件を説明します。感染多重度（MOI）およびインキュベーション時間は、使用されるウイルス株に依存して変化し得ます。 ビオチン化、A / WSN / 33ウイルスの作製<ol><li>シードマディンダービーイヌkindey（MDCK）を、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、T175のcm 2のフラスコへの細胞。約70％コンフルエントになるまで37℃で培養細胞に到達します。 </li><li>感染の前に、培地を除去し、細胞単層をカバーするのに十分大きな容量を追加することにより、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.0-7.3）で細胞を洗浄します。 </li><li> PBSを削除し、10 -4のMOIで、A / WSN / 33を細胞に感染します。 PBS中のウイルスを希釈0.02ミリグラムのMg 2+、0.01ミリグラムの Ca 2+ &lt;を補っ/ SUP&gt;、0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（感染-PBS）。 T175センチ2フラスコのために4ミリリットルの接種材料を使用してください。 </li><li>細胞を37℃で1時間インキュベートします。フラスコに0.3％BSAを添加し、吸引ピペット10ミリリットルのDMEMによって接種物を取り除き、20mMのHEPES、及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li>その後、収穫上清表示されており、細胞変性効果（CPE）まで約37℃で3日間細胞をインキュベートします。 CPEは、細胞14の剥離や死に続いて細胞の切り上げとして認識することができます。 </li><li>細胞の破片を除去するために5分間、450×gで上清をスピン。新しいファルコンチューブに上清を移し、この手順をもう一度繰り返します。ペレットを廃棄します。 </li><li>超遠心管とNTE緩衝液（10mMトリス[pHが7.4]、100mMのNaCl、1mMのEDTA）で希釈した30％スクロース、5 mlの下敷き上清へ転送上清。超遠心分離の前にチューブのバランスをとり、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでいっぱい。スピンsuperna112398×gでtantsは、超遠心機で90分間（SW28ローターのための25,000 RPMに相当します）。 </li><li>ピペットで注意深く上清を除去し、250μlのPBS中に4℃で一晩ウイルスペレットを浸します。ピペッティングにより再懸濁ペレット。 Bradfordアッセイ15によって精製されたウイルスのタンパク質含有量を測定します。 </li><li>ビオチン化、A / WSN / 33を生成するために、ビオチン化キットを使用してください。製造元の指示に従ってください。 </li><li>簡潔には、精製されたウイルスを、適切な量のビオチンを添加し、氷上で2時間インキュベートします。超遠心管にウイルスを移し、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでチューブを埋めます。超遠心機で90分間112389×gでウイルスをスピン。ピペットで上清を除去し、250μlのPBSを追加します。 4℃で一晩ペレットを浸します。ビオチン化ウイルスをアリコートし、格納、少なくとも24ヶ月間安定である-80℃で保存しました。 注：これは、ビオチン化Pの力価を決定するために役立つかもしれません標準的なプラークアッセイによりIAVの賠償。しかし、後続のプロトコルのみをビオチン化ウイルス粒子を測定することに留意すべきです。不完全なビオチン化のために残りの非ビオチン化粒子は、プラークアッセイにより感染力価に貢献ではなく、添付ファイル/内在化アッセイで測定された信号になります。 </li></ol> 2.ビオチン化ウイルスの必要量を決定します注：添付ファイル/内在化アッセイが行われる前に、試料の全ての細胞を感染させるために必要なビオチン化されたウイルスの量を決定することが重要です。 <ol><li>製造業者の指示に従ってA549細胞を培養し、トリプシン処理。セルチャンバーを用いて細胞を数えます。 FACSディープウェルチューブに20万A549細胞をピペット。スピン450×gで3分。上清を除去し、200μlのPBSでペレットを再懸濁。クールダウン細胞を氷上で10分間。 </li><li> biotiの5倍連続希釈液を調製します感染-PBS中にウイルスストックをnylated。 </li><li> 450 x gで3分間、4℃で細胞を含有するスピンチューブ。 100μlのウイルス含有感染-PBSで上清と再懸濁したペレットを削除します。モック対照として、ビオチン化ウイルス感染なし-PBSを使用しています。 1時間氷上でチューブをインキュベートします。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。この手順をもう一度繰り返します。 </li><li>固定のために、450 x gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）の100μl中にペレットを再懸濁。 RTで10分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。 </li><li>透過性のために、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 0.5％のトリトンX-100を含む100μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。室温で6分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁STV-のCy3を含むPBSで希釈した50μlの2％BSAでら。 （STV-のCy3の適切な濃度は、実験を開始する前に決定されるべきで、注意してください1の濃度で開始します。1まで200及びテスト2倍希釈：2400我々の手では、1の希釈：1,000証明最適です。） </li><li>室温で暗所で1時間インキュベートします。その後、繰り返し洗浄工程は、2.4で説明したが、PBSで希釈した200μlの2％BSA中でペレットを再懸濁。 </li><li> 16フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。 Cy3で陽性集団の門。 A549集団中のCy3陽性細胞数の最大値が得られたビオチン化ウイルスの最低濃度を選択してください。 </li></ol> 3.ストレプトアビジンの必要量を決定します 注：外ウイルス由来のシグナルを遮断する効率がアッセイの検出範囲を決定します。したがって、できるだけSTV-Cy3シグナルを排除することが重要です。目STVのE必要量は、（セクション2で決定）を使用し、ビオチン化ウイルスストックの量に依存する必要がありました。 <ol><li>手順2.1から2.4に従いますが、セクション2で決定したウイルス濃度を使用しています。 </li><li> 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈したSTVの5倍連続希釈液を調製します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、50μlのSTVの希釈でペレットを再懸濁。モック対照としてSTVずに2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSを使用します。氷上で30分間チューブをインキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>ステップ2.5から2.9に従ってください。内在化アッセイのために、（何STVが存在しないた試料と比較して）のCy3シグナルの強力なブロックの結果STVの最低濃度を選択します。このため、CY3陽性細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。理想的には、STV処理サンプルのCy3シグナルは、偽感染からの信号の近くに配置してくださいできるだけ細胞。 </li></ol> 4.添付ファイル/内在化アッセイ 注：アッセイを開始する前に、すべての試薬を準備していることを確認してください。プロトコルへの3つの制御結果セクション（モック感染細胞、ノイラミニダーゼ前処理した細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞）に提示グループの小さな変更のために必要とされます。 <ol><li>それぞれ200,000 A549細胞を含む16ディープウェルのチューブを準備します。次の4管から成る実験セットに、3制御条件、4チューブを必要とする各があります：モック感染した細胞は、ノイラミニダーゼ（NA）は、細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞を-pretreated。各グループは、「0分」、「0分+ STV &#39;、&#39;30分&#39;、&#39;30分+ STV」とラベルされた4のチューブで構成されています。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 </li><li> 450×gで4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁0.3％のBSA、20mMのHEPESおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（培養培地）を含有する200μlのDMEMにおいてら。 37℃で30分間インキュベートします。 注：使用細菌ノイラミニダーゼ（例えばシアリダーゼビブリオコレラから）mlの細胞を再懸濁するために、インキュベーション培地に希釈/ 200ムーの濃度で：ノイラミニダーゼ制御のため。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 10分間氷上でチューブを冷却、その後、この手順をもう一度繰り返します。 </li><li> 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 （感染-PBSで希釈したセクション2で決定したウイルス濃度を使用）、100μlのビオチン化ウイルスで上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で1時間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。 注：モック感染制御の場合：ウイルス感染せず、PBSを使用してください。アジ化ナトリウムを制御するために：感染-PBSで希釈したウイルスを使用し、0.1％のアジ化ナトリウムを補充しました。 </li><li>プロの氷上での感染後のサンプルのcessing： <ol><li>他のサンプルが固定されるまで、「0分」のサンプルについて、4℃でステップ2.5と店舗のサンプルに従ってください。 </li><li> 450×gで3分間、4℃で0分+ STV」のサンプル、スピンチューブ用。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 </li><li> 450×gで3分間、4℃で&#39;30分 &#39;サンプル、スピンチューブ用。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。 </li><li> 「3の場合0分+ STV」のサンプルは、450×gで3分間、4℃でチューブをスピン。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。その後、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4​​から2.5とストアのサンプルに従ってください。 注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。 </li></ol></li><li>手順2.6から2.8に従って、フローサイトメトリーによってサンプルを分析。各サンプル中のCy3陽性細胞の割合を決定します。 </li><li>パーセンテージ添付ウイルスおよび内在化ウイルスの相対的な量を計算します。 <ol><li>付着したウイルスの量を計算するために、Cy3でPOSITIの割合を使用しゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度をまし。比較のために、100％（ 図4B）に未処理細胞を設定します。 注：添付ウイルスの割合を「0分」サンプルによって記述されます。 </li><li>内在化ウイルスの量を計算するには、「30分」のサンプル（ 図5B）に「30分+ STV」のサンプルの比を取ります。 注：上記のように、Cy3の正のゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーにより、ウイルスの付着および内在化を測定する簡単な方法を説明します。これは、ウイルス様粒子（VLP）の使用と比較して、より厳密に模倣ウイルス感染標識野生型ウイルスの使用を可能にします。我々のプロトコルは、IAVの付着および内在化を測定するために最適化されているが、容易に他のウイルスに適合させることができます。フロー?...

インフルエンザAウイルス（IAV）のエントリは、標的細胞1の細胞膜上の受容体へのウイルスの結合で開始する多段階プロセスです。 IAVの受容体は、糖タンパク質および糖脂質の多種多様に存在するシアル酸です。ウイルスエンベロープ中に存在するIAVのヘマグルチニン（HA）タンパク質は、シアル酸に結合し、それによって標的細胞2の原形質膜へのウイルス粒子の付着を媒介します。ウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して細胞に入るだけでなく、マクロピノサイトーシスなどの代替エントリー経路は、3-6に記載されています 。 HAとシアル酸との間の相互作用は、付着およびウイルス粒子7の内在化をトリガ両方を媒介するのに十分であるように見えます。それにもかかわらず、代替エントリー受容体が提案されているとIAVエントリにおける役割は、現在、1,8,9を検討されています。 CURrently、努力が緊急に必要とされる、新規な抗ウイルス治療法10-12開発を目的としたウイルスのライフサイクルに関与する宿主因子を同定するために行われます。ウイルス侵入は、その最も早い時点でウイルス感染を阻止するために、IAV増殖を標的とするための有利なステップになります。ウイルスの通常大量の着信ウイルスを検出するために必要とされる実験IAVエントリの異なる段階を測定することは困難です。加えて、ウイルス侵入の変化の検出範囲のみによりウイルス複製の欠如に線形です。これは、高感度のアッセイのための必要性を強調する。 ここで本発明のアッセイは、細胞表面に付着したウイルスの検出ならびに細胞関連ウイルスの合計量に対する内在ウイルスの検出を可能にします。ビオチン化野生型ウイルスの使用は、STV-Cy3およびフローサイトメトリーによる読み出しに染色を通じて便利な測定を可能にします。ビオチン化ウイルスは、細胞に冷結合していますSを付着させるが、ウイルス粒子の内在化を防止することができます。細胞は、固定された透過性および添付のウイルスを測定するために、STV-Cy3で染色することができます。ブロッキング工程は、細胞が非標識ストレプトアビジン（STV）と一緒にインキュベートされた固定の前に適用される場合、細胞外、添付ビリオンからの信号を排除することができます。次のステップでは、ビオチン化IAVの取り付け後、温度を37℃にシフトされ、ウイルス粒子の内部移行を行わせます。内在粒子は、それによって細胞外および細胞内のウイルスとの識別を可能STVの結合から保護されています。 実験条件ごとに、4つのサンプルが必要とされている：「0分」：最初のサンプルは、標識された「0分」、細胞表面で冷間結合ウイルスを測定することです。 「0分+ STV &#39;：&#39; 0分+のSTV「標識された第二のサンプルは、実験のベースライン信号強度を与えます。添付ウイルスはウィットをブロックされていますSTV-Cy3で染色以下の時間STVと信号が「0分」のサンプルと比較してはるかに低いことが必要です。 &#39;30分 &#39;：第三のサンプル、&#39;30分&#39;が原因で30分間、37℃に温度シフトに取り付けられ、ウイルスを内在化含まれています。 &#39;30分+ STV &#39;：第4のサンプル、&#39;30分+ STV」対策ウイルスの細胞内画分。 STVブロッキング工程は、30分のインキュベーション期間の後に適用されます。その結果、細胞表面でのウイルス粒子は、STV-Cy3で染色するための唯一の内在化ウイルスは、利用可能な脱離STVによって結合されます。内在化ウイルスの相対的な量は、「（サンプル&#39;30分によって記述）ウイルスの総量で割った（サンプル&#39;30分+ STVで測定される）「内在ウイルスの比として計算することができます。 コントロールとして、我々はモック感染した細胞を含むことを示唆しています。モック感染細胞のSTV-Cy3の染色以下の信号はバックグラウンドを提供します染色プロトコルに起因します。 IAV結合のためのコントロールは、細菌ノイラミニダーゼ（NA）を用いた細胞の前処理です。細胞性糖タンパク質からシアル酸をオフNAを切断し、それによって細胞表面から付着受容体を除去します。アジ化ナトリウム（SA）は、強力な代謝阻害剤であり、それによって、ブロックが13をエンドサイトーシス。アジ化ナトリウムで処理した細胞は、内在化のための結合ウイルスに陽性であるが負でなければなりません。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

四つの異なる実験条件を説明する漫画は 、図1に示されている代表的な実験の結果を図2に提示されている- 。5。 「0分」のサンプルでは、ビオチン化したウイルスは、低温結合であるSTV-Cy3の染色によって可視化することができる細胞を標的とするために（ 図1および 2）。 （ &quot;0分+ STV」サンプルで）ブロッキング?...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K ビュー.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

HA抗体によるFc媒介エフェクター機能の活性化の測定

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

特性評価と機能分析

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

蛍光イメージングによる宿主細胞への細菌付着の検出

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...