Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31003A_135278) para SSt. MOP es el beneficiario de una beca de doctorado del Fondo de Investigación AXA. Agradecemos a Patricia Nigg en busca de ayuda con el diseño de la figura 1.

Nota antes del comienzo: la campana de flujo laminar y Uso biocontención adecuada cuando se trabaja con virus vivo. A continuación, describimos las condiciones de crecimiento adecuadas a la tensión virus de la influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidad de infección (MOI) de incubación y tiempos pueden variar dependiendo de la cepa de virus utilizada. 1. Preparación de biotinilado A / WSN / 33 Virus <ol><li> Las células en un matraz T175 cm 2 utilizando Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby Seed kindey canino (MDCK). Células de cultivo a 37 ° C hasta aproximadamente el 70% de confluencia se alcanza. </li><li> Antes de la infección, retire medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.0-7.3) mediante la adición de un volumen lo suficientemente grande como para cubrir la monocapa de células. </li><li> Retire PBS e infectar las células con A / WSN / 33 con una MOI de 10 -4. Diluir virus en PBS suplementado con 0,02 mg de Mg 2 +, 0,01 mg de Ca2 + &lt;/ sup&gt;, 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1% Pen / Strep (infección-PBS). Utilice un inóculo de 4 ml para un matraz T175 cm 2. </li><li> Se incuban las células 1 hora a 37 ° C. Retire inóculo por aspiración y pipeta 10 ml de DMEM suplementado con 0,3% de BSA, 20 mM HEPES, y el 1% penicilina / estreptomicina en el matraz. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante aproximadamente 3 días hasta que el efecto citopático (CPE) es visible, y después de la cosecha sobrenadante. CPE puede ser reconocido como el redondeo de las células seguido de desprendimiento y muerte de las células 14. </li><li> Girar sobrenadante a 450 xg durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon y repita este paso una vez más. Deseche los pellets. </li><li> Sobrenadantes de transferencia en tubos de ultracentrífuga y sobrenadantes de capas de base con 5 ml de sacarosa al 30% diluido en tampón NTE (10 mM de Tris [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibre los tubos antes de la ultracentrifugación y se llenan con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Girar supernatantes en 112.398 xg (correspondiente a 25.000 rpm para un rotor SW28) durante 90 min en una ultracentrífuga. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con la pipeta y disfrutar sedimento de virus durante la noche a 4 ° C en 250 l de PBS. Resuspender pellet pipeteando arriba y abajo. Mida el contenido de proteínas del virus purificado por Bradford ensayo 15. </li><li> Utilice un kit de biotinilación para generar biotina A / WSN / 33. Siga las instrucciones del fabricante. </li><li> En resumen, añadir la cantidad apropiada de biotina para el virus purificado y se incuba durante 2 h en hielo. Transferencia de virus a un tubo de ultracentrífuga y llenar el tubo con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Haga girar virus a 112.389 xg durante 90 minutos en una ultracentrífuga. Aspirar el sobrenadante con la pipeta y añadir 250 l de PBS. Remoje pellet durante la noche a 4 ° C. Alícuota y almacenar el virus biotinilado se almacenó a -80 ° C donde va a ser estable durante al menos 24 meses. NOTA: Puede ser útil para determinar el título de la p biotiniladoreparación de IAV por ensayo de placa estándar. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el protocolo posterior sólo medir partículas de virus biotinilado. Restante partículas no biotinilados debido a biotinilación incompleta contribuirá a la título infeccioso mediante ensayo en placa pero no a la señal medida en el ensayo de unión / internalización. </li></ol> 2. Determinar la cantidad necesaria de Biotinylated Virus NOTA: Antes de realizar el ensayo de unión / internalización, es importante para determinar la cantidad de virus requerida para infectar biotinilado todas las células de una muestra. <ol><li> Cultura y células A549 trypsinize de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Contar las células por medio de una cámara de celular. Pipeta células 200.000 A549 en FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 200 l de PBS. Hacia abajo en hielo durante 10 min Super células. </li><li> Preparar 5 veces diluciones seriadas del biotistock de virus en la infección por nylated-PBS. </li><li> Centrifugar los tubos que contienen las células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l infección PBS que contiene el virus. Como el uso de control de la infección maqueta-PBS sin virus biotinilado. Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más. </li><li> Para la fijación, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l de 3,7% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4). </li><li> Para permeabilización, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 l de PBS que contiene 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4). </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet en 50 l 2% de BSA diluido en PBS que contenía STV-Cy3. (Tenga en cuenta que la concentración apropiada de STV-Cy3 debe determinarse antes de iniciar el experimento Comience con una concentración de 1:. 200 y la prueba 2 veces diluciones de hasta 1:. 2400 En nuestras manos, una dilución de 1: 1000 probado a ser óptimo.) </li><li> Incubar 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4, pero resuspender el precipitado en 200 l 2% de BSA diluido en PBS. </li><li> Analizar muestras por citometría de flujo 16. Puerta de la población Cy3-positivo. Elige la concentración más baja de virus biotinilado resultante en el número máximo de células Cy3-positivas en la población A549. </li></ol> 3. Determine la cantidad necesaria de estreptavidina NOTA: La eficiencia de bloquear la señal derivada de virus extracelular determina el rango de detección del ensayo. Por lo tanto, es importante que se suprime la señal de STV-Cy3 tanto como sea posible. The cantidad necesaria de STV necesario depende de la cantidad de stock de virus biotinilado utilizado (determinado en la sección 2). <ol><li> Siga los pasos 2.1-2.4, pero el uso de concentración del virus determina en el apartado 2. </li><li> Preparar diluciones seriadas de cinco veces de STV diluidos en PBS que contenía 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV dilución. Como el uso de control de simulacro de PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio y sin STV. Incubar los tubos durante 30 min en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4. </li><li> Siga los pasos 2,5-2,9. Para el ensayo de internalización, elegir la concentración más baja de STV que resulta en un fuerte bloque de la señal de Cy3 (en comparación con la muestra en la que no estaba presente STV). Para ello, el porcentaje de células Cy3-positivo o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. Idealmente, la señal de Cy3 de muestras tratadas con STV debe ser lo más cercano a la señal de infectados por el simulacrocélulas como sea posible. </li></ol> 4. Adjunto / Ensayo Internalización NOTA: Asegúrese de preparar todos los reactivos antes de comenzar el ensayo. Para los tres grupos de control que se presentan en la sección de resultados (células infectadas simuladas, las células pre-tratadas de la neuraminidasa y células azida sódica tratados) pequeñas alteraciones en el protocolo son obligatorios. <ol><li> Preparar 16 tubos para pozos profundos que contienen cada 200.000 células A549. Al lado del conjunto experimental que consta de 4 tubos, hay 3 condiciones de control, cada uno que requieren 4 tubos: las células infectadas, la neuraminidasa (NA) células -pretreated y células tratadas con azida de sodio. Cada grupo consta de 4 tubos etiquetados como &quot;0 min&quot;, &quot;0 min + STV &#39;, &#39;30 minutos&#39;, &#39;30 minutos + STV &#39;. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet 200 en DMEM que contiene 0,3 l% de BSA, HEPES 20 mM y 1% (medio de incubación) penicilina-estreptomicina. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. NOTA: Para el control de la neuraminidasa: Uso neuraminidasa bacteriana (por ejemplo, la sialidasa de Vibrio cholera) a una concentración de 200 mU / ml diluido en medio de incubación para resuspender las células. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más, a continuación, los tubos se enfríe en hielo durante 10 min. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l virus biotinilado (utilizar la concentración de virus determina en el apartado 2 diluido en la infección-PBS). Incubar 1 hora en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4. NOTA: Para el control de modelo de infectados: Uso infección PBS sin virus. Para el control de azida de sodio: Uso virus diluido en PBS-infección suplementado con 0,1% de azida de sodio. </li><li> Proprocesamiento de las muestras después de la infección en hielo: <ol><li> Para las muestras &#39;0 min&#39;, siga el paso 2.5 y almacenar las muestras a 4 ° C hasta que se fijan las otras muestras. </li><li> Para el &#39;0 min + STV&#39; muestras, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. </li><li> Para las muestras de &#39;30 minutos &#39;, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C. </li><li> Para el &#39;30 min + muestras STV &#39;giran tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Entonces, los tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Siga los pasos 2.6-2.8 y analizar muestras por citometría de flujo. Determinar el porcentaje de células Cy3-positivos en cada muestra. </li><li> Calcular el porcentaje adjunta virus y la cantidad relativa de virus internalizado. <ol><li> Para calcular la cantidad de virus adjunto, utilice el porcentaje de Cy3-positive células cerradas o la intensidad de fluorescencia media de la señal de Cy3. Para la comparación, establezca las células no tratadas a 100% (Figura 4B). NOTA: El porcentaje de virus adjunto se describe por la muestra &quot;0 min&quot;. </li><li> Para calcular la cantidad de virus interiorizado, tomar la relación entre el &quot;30 min + STV&quot; muestra al &quot;30 minutos&quot; de la muestra (Figura 5B). NOTA: Como se mencionó anteriormente, el porcentaje de células cerradas positivos Cy3 o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nuestro protocolo describe una manera fácil de medir la fijación del virus y la internalización por citometría de flujo. Se permite el uso de virus de tipo salvaje marcado que imita más estrechamente las infecciones de virus en comparación con el uso de partículas similares a virus (VLP). Mientras que nuestro protocolo se ha optimizado para medir unión e internalización de IAV puede ser fácilmente adaptado para otros virus. Además, como la citometría de flujo se utiliza para la lectura, los compañeros de ti...

La entrada de los virus de influenza A (IAV) es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a los receptores en la membrana plasmática de las células diana 1. El receptor para IAV es el ácido siálico que está presente en una gran variedad de glicoproteínas y glicolípidos. La hemaglutinina (HA) de proteína de IAV que está presente en la envoltura viral se une al ácido siálico y por lo tanto media en la unión de las partículas virales a la membrana plasmática de las células diana 2. El virus entra en las células a través de endocitosis mediada por clatrina, sino también a las vías de entrada alternativos, como macropinocitosis, se han descrito 6.3. La interacción entre HA y ácido siálico parece ser suficiente para mediar tanto, el apego y desencadenar la internalización de las partículas virales 7. Sin embargo, se han propuesto los receptores de ingreso alternativas y sus roles en la entrada IAV están siendo investigados 1,8,9. Canallatualmente, se hacen esfuerzos para identificar los factores del huésped que están involucrados en el ciclo de vida viral con el objetivo de desarrollar urgentemente necesarias nuevas terapias antivirales 10-12. La entrada del virus sería un paso favorable para orientar el crecimiento IAV con el fin de bloquear la infección viral en su punto más temprano. Medición de las diferentes etapas de la entrada IAV experimentalmente es un reto ya que se requieren por lo general grandes cantidades de virus para detectar virus entrante. Además, el rango de detección de los cambios en la entrada del virus es solamente lineal debido a la falta de replicación viral. Esto pone de relieve la necesidad de ensayos con alta sensibilidad. El ensayo que aquí presentamos permite la detección de virus unido a la superficie celular, así como la detección de virus internalizado en relación con la cantidad total de virus asociado a células. El uso de virus de tipo salvaje biotina permite la medición conveniente a través de tinción con STV-Cy3 y lectura por citometría de flujo. Virus biotinilado es frío ligado a la células para permitir la unión, sino evitar la internalización de las partículas virales. Las células pueden ser fijos, permeabilizaron y se tiñeron con STV-Cy3 para medir virus adjunto. La señal procedente de viriones extracelulares, adjuntos puede ser derogada si se aplica una etapa de bloqueo antes de la fijación en la que las células se incuban con estreptavidina no marcada (STV). En un siguiente paso, después de la fijación de biotina IAV, la temperatura se desplaza a 37 ° C y la internalización de las partículas virales se dejó que tuviera lugar. Partículas internalizadas están protegidos de la unión de STV permitiendo así que la discriminación entre virus extra e intracelulares. Por condición experimental, se requieren cuatro muestras: &#39;0 min&#39;: La primera muestra, con la etiqueta &quot;0 min &#39;, es medir el virus frío con destino en la superficie celular. &#39;0 min + STV&#39;: La segunda muestra, con la etiqueta &quot;0 min + STV &#39;, da la intensidad de la señal de referencia del experimento. Virus adjunto se bloquea ingenioh STV y la señal después de la tinción con STV-Cy3 deberían ser mucho menor en comparación con la muestra &#39;0 min&#39;. &#39;30 Minutos &#39;: La tercera muestra, &#39;30 minutos&#39; contiene adjunta y el virus internalizado debido al cambio de temperatura a 37 ° C durante 30 minutos. &#39;30 Min + STV &#39;: La cuarta muestra, &#39;30 minutos + STV&#39; mide la fracción intracelular de virus. La etapa de bloqueo STV se aplica después del período de incubación 30 min. Como resultado, las partículas virales en la superficie celular están obligados por STV dejando solamente los virus internalizados disponible para la tinción con STV-Cy3. La cantidad relativa de virus internalizado se puede calcular como la relación de virus internalizado (medido en el &#39;30 min + STV &#39;muestra) dividido por la cantidad total de virus (descrito por el &#39;30 min&#39; muestra). Como controles se sugiere incluir las células infectadas. La señal después de la tinción STV-Cy3 de células infectadas da el fondoresultante de el protocolo de tinción. Un control para la fijación IAV es el pre-tratamiento de las células con neuraminidasa bacteriana (NA). Escinde NA fuera de ácido siálico de las glicoproteínas celulares, eliminando de este modo los receptores de unión de la superficie celular. La azida de sodio (SA) es un potente inhibidor metabólico y por lo tanto bloquea la endocitosis 13. Las células tratadas con azida de sodio deben ser positivos para la unión virus pero negativo para la internalización.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Un dibujo animado que describe las cuatro condiciones experimentales diferentes se muestra en la Figura 1 Los resultados de un experimento representativo se presentan en las Figuras 2 -. 5. En la muestra &quot;0 min&quot;, virus biotinilado es frío unida a células que pueden ser visualizadas por tinción STV-Cy3 objetivo (Figuras 1 y 2). Cuando se aplica una etapa de bloqueo (en el &quot;0 min + STV&quot; muestra), el...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K vistas.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biología

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

Medición de la activación de las funciones efectoras mediadas por Fc por anticuerpos HA

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Detección de la adherencia bacteriana a las células huésped mediante imágenes de fluorescencia

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...