Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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이 작품은 SST에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A_135278)에서 교부금에 의해 지원되었다. MOP는 AXA 연구 기금 박사 보조금의 수혜자입니다. 우리는 그림 1의 디자인에 대한 도움말은 패트리샤 Nigg 감사합니다.

전에 시작 주 : 사용 층류 후드 및 적절한 biocontainment을 라이브 바이러스에 작업 할 때. 여기서는 배양 인플루엔자 바이러스 균주 A / WSN / 33에 적합한 성장 조건을 설명한다. 감염의 다중성 (MOI)와 배양 시간은 사용 바이러스 균주에 따라 달라질 수 있습니다. 바이오틴 / WSN / 33 바이러스의 1. 준비 <ol><li> 시드 Madin-다비 송곳니 kindey (MDCK), 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용하여 2 cm의 T175 플라스크에 세포. 약 70 %의 전면 생장까지 37 ℃에서 배양 된 세포로 진행한다. </li><li> 감염 전에 배지 제거하고 세포 단층을 덮도록 충분한 양을 첨가하여 인산염 완충 식염수 (PBS, pH7.0-7.3)으로 세포를 세척 하였다. </li><li> PBS를 제거하고 10-4의 방어와 A / WSN / 33 세포를 감염. PBS에 바이러스를 희석은 0.02 mg의 마그네슘 2+, 0.01 mg의 칼슘 2 + &lt;보충/ SUP&gt;, 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 펜 / 스트렙토 (감염-PBS). T175의 CM 2 플라스크 4 ml로 접종을 사용합니다. </li><li> 세포를 37 ℃에서 1 시간을 품어. 플라스크에 0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 펜 / 연쇄상 구균 보충 열망과 피펫 (10)의 ML의 DMEM에 의해 접종을 제거합니다. </li><li> 다음 수확 뜨는 볼 수 있으며, 세포 변성 효과 (CPE)까지 약 3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품어. CPE는 분리 셀 (14)의 죽음 뒤에 세포의 반올림으로 인식 될 수있다. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 5 분 동안 450 XG에 뜨는 스핀. 새로운 팔콘 튜브에 뜨는을 전송하고이 단계를 한 번 더 반복한다. 알약을 폐기하십시오. </li><li> 초 원심 분리기 튜브 및 NTE 완충액 (10 mM 트리스 [pH 7.4의, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)에 희석 30 % 수크로오스 5 ㎖와 언더 상청액에 넣고 상청액. 초 원심 분리하기 전에 튜브 균형 및 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 채워. 스핀 superna112,398 XG에 tants은 초 원심 분리기 90 분 (SW28 로터 25,000 RPM에 해당). </li><li> 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS에 4 ℃에서 하룻밤 바이러스 펠렛을 흡수. 로 pipetting 아래로 재현 탁 펠렛. 브래드 포드 분석에 의해 정제하여 15 바이러스의 단백질 함량을 측정한다. </li><li> 비오틴은 / WSN / 33을 생성하는 바이오 틸 키트를 사용합니다. 제조업체의 지시를 따르십시오. </li><li> 간단히, 정제 된 바이러스에 비오틴을 적당량 추가하고 얼음에 2 시간 동안 배양한다. 초 원심 분리기 튜브에 바이러스를 옮기고 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 관을 채운다. 초 원심 분리기에서 90 분 동안 112,389 XG에 바이러스를 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 밤새 펠렛을 만끽 해보세요. 분취 량은 최소 24 개월 동안 안정 할 것이다 -80 ° C에 보관 비오틴 바이러스를 저장. 참고 :이 바이오틴 (P)의 역가를 결정하는 데 도움이 될 수표준 상패 분석​​에 의해 IAV의 배상. 그러나, 후속 프로토콜 만 비오틴 바이러스 입자를 측정하는 것을 유의해야한다. 불완전한 바이오 틸 unbiotinylated 입자에 남은 플라크 분석으로 아니라 첨부 / 내재화 분석에서 측정 된 신호에 전염성 역가에 기여할 것이다. </li></ol> 2. 바이오틴 바이러스의 필요한 양을 결정 주 : 부착 / 내재화 분석이 수행되기 전에, 그 시료의 모든 세포를 감염시킬 필요 비오틴 바이러스의 양을 결정하는 것이 중요하다. <ol><li> 문화 및 제조자의 지시에 따라 세포를 Trypsinize A549. 셀 챔버를 사용하여 세포를 카운트. FACS 피펫 200,000 A549 세포 튜브 deepwell. 스핀 450 X g에서 3 분. 200 μL PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 쿨 세포 아래로 얼음에 10 분 동안. </li><li> bioti의 5 배 연속 희석을 준비감염 PBS에서 nylated 바이러스 재고. </li><li> 450 x g에서 3 분 동안 4 ℃에서 세포를 포함하는 스핀 튜브. 100 μL 바이러스 함유 감염 PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 바이오틴 바이러스없이 모의 제어 사용 감염 PBS로. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 고정 용, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 투과성으로 들어, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 0.5 % 트리톤 X-100을 포함하는 100 μl의 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 6 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거PBS가 STV-Cy3에 함유 희석 50 μL, 2 %의 BSA 등. (참고, STV-Cy3에 적절한 농도는 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다 (1)의 농도로 시작합니다. 배 2 희석 최대 1 200 시험 :. 2400 우리의 손에, 1의 희석 : 입증 1,000 최적합니다.) </li><li> 실온에서 어둠 속에서 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에서 설명하지만 PBS에 희석 200 μL 2 % BSA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 16 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. Cy3에 양성 인구에 문입니다. A549 인구를 Cy3 양성 세포의 최대 수의 결과 비오틴 화 바이러스의 최저 농도를 선택한다. </li></ol> 3. 스트렙 타비 딘의 필수 양을 결정 주 : 세포 바이러스로부터 유래 된 차단 신호의 효율 분석의 검출 범위를 결정한다. 따라서, 가능한 한 많이 STV-Cy3에 신호를 폐지하는 것이 중요하다. 목STV의 필요량이 필요 전자는 (섹션 2에서 결정)를 사용 바이오틴 바이러스 주식의 양에 따라 달라집니다. <ol><li> 단계 2.1-2.4를 수행하지만, 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용합니다. </li><li> PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 STV의 5 배 희석액을 준비한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 50 μL STV 희석에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 모의 제어 사용함없이 PBS STV는 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유. 얼음에 30 분 동안 튜브를 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. </li><li> 단계 2.5-2.9를 수행합니다. 국제화 분석의 경우, (더 STV가 존재하지 않는에서 샘플에 비해)를 Cy3 신호의 강력한 블록의 결과 STV의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 이를 위해, CY3 양성 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. 이상적 STV - 처리 샘플의 신호를 Cy3 모의 감염된로부터의 신호에 가까워 야가능한 세포. </li></ol> 4. 첨부 파일 / 내면화 분석 참고 : 분석을 시작하기 전에 모든 시약을 준비해야합니다. 프로토콜에 대한 세 가지 제어 결과 섹션 (모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 사전 처리 된 세포 및 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포)에 제시된 그룹 작은 변화가 필요합니다. <ol><li> 각각 200,000 A549 세포를 함유하는 16 deepwell 튜브를 준비한다. 다음 4 관으로 구성된 실험 세트, 3 제어 조건, 각각의 요구 4 튜브가 : 모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 (NA) -pretreated 세포와 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포. 각 그룹은 &#39;0 분&#39;, &#39;0 분 + STV&#39;, &#39;30 분 &#39;, &#39;30 분 + STV&#39;로 표시 4 관으로 구성되어 있습니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 450 X g에서 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (배양 배지)을 함유하는 200 ㎕의 DMEM에서 등. 37 ℃에서 30 분 동안 품어. 주 : 사용 세균 뉴 라미니다 아제 (시알 리다 아제 예 비브리오 콜레라부터) ml의 세포를 재현 탁하는 배양 배지에서 희석 / 200 무 농도 : 뉴 라미 제어 옵션. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 아래로 그리고,이 단계 시원한 튜브를 한 번 더 반복한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. (감염 PBS에 희석 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용) 바이러스를 비오틴 100 μL에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음에 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. 참고 : 사용하여 감염 PBS 바이러스없이 : 모의에 감염된 제어하십시오. 아 지드 화 나트륨 컨트롤 : 감염 PBS에 희석 사용 바이러스 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> 찬성얼음에 감염 후 샘플의 cessing : <ol><li> 다른 샘플이 고정 될 때까지 &#39;0 분&#39;샘플은 4 ℃에서 단계 2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 0 분 + STV &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 &#39;30 분 &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> &#39;30 분 + STV &#39;샘플 450 x g에서 3 분 동안 4 ° C에서 튜브를 회전. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 그런 다음, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li></ol></li><li> 단계 2.6-2.8에 따라 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 각 샘플에 Cy3에 양성 세포의 비율을 결정한다. </li><li> 비율 부착 바이러스 및 내면화 바이러스의 상대적인 양을 계산합니다. <ol><li> 첨부 된 바이러스의 양을 계산하기 위해,는 Cy3-positi의 비율을 사용하여게이트 된 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도를했습니다. 비교를 위해, 100 % (그림 4B)에 처리되지 않은 세포를 설정합니다. 참고 : 첨부 된 바이러스의 비율이 &quot;0 분&quot;샘플에 의해 설명되어 있습니다. </li><li> 내재화 된 바이러스의 양을 계산하기 위해, &quot;30 분&quot;의 샘플 (도 5B)에 「30 분 + STV &quot;시료의 비율을 취. 주의 : 전술 한 바와 같이, 양의 게이트를 Cy3 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

우리의 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 바이러스 첨부 파일 및 내재화를 측정하는 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 사용에 비해 더 가깝게 모방하는 바이러스 감염 표지 야생형 바이러스의 사용을 허용한다. 우리 프로토콜 IAV의 부착 및 내재화를 측정하는 데 최적화되어 있지만 이는 다른 바이러스를 쉽게 적용 할 수있다. 유동 세포 계측법은 판독에 사용되는 바와 ...

인플루엔자 바이러스 (IAV)의 엔트리 (1) 표적 세포의 세포막 수용체에 바이러스의 결합으로 시작 다단계 공정이다. IAV의 수용체는 당 단백질과 당지질의 큰 다양성에 존재하는 시알 산이다. 바이러스 엔벨로프에 존재 IAV의 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질은 시알 산에 결합함으로써 표적 세포 (2)의 세포막에 바이러스 입자의 부착을 매개한다. 바이러스는 3-6 설명되었다 클라 트린 매개 엔도 시토 시스를 통하여 세포뿐만 아니라, macropinocytosis 같은 대체 입력 경로를 들어간다. HA 및 시알 산 사이의 상호 작용은 모두 중재 첨부 파일 및 바이러스 입자 (7)의 내재화를 유발하기에 충분한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 엔트리 수용체가 제안되었으며, IAV 항목의 역할은 현재 1,8,9을 연구되고있다. 똥개다발 적 노력 시급 신규 항 바이러스 요법 10-12을 개발 목표로 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 숙주 요인을 파악하게된다. 바이러스 엔트리는 그 최초의 지점에서 바이러스 감염을 차단하기 위해 IAV 성장 타겟팅 유리한 공정이 될 것이다. 바이러스 보통 다량 들어오는 바이러스를 검출하는 데 필요한대로 IAV 항목의 여러 단계를 측정하는 것은 실험적으로 도전. 또한, 바이러스 엔트리의 변화를 검출 범위 인해 바이러스 복제의 부족 만 선형이다. 이것은 고감도 분석에 대한 필요성을 강조한다. 우리는 여기에 제시 분석은 세포 - 관련 바이러스의 총량에 대해서, 세포 표면에 부착 된 바이러스의 검출뿐만 아니라 내면화 바이러스 검출 할 수있다. 비오틴 야생형 바이러스의 사용은 유동 세포 계측법에 의해 STV-Cy3에있는 염색 및 판독을 통해 편리하게 측정 할 수있다. 바이오틴 바이러스는 세포에 냉간 바인딩S는 첨부 파일을 허용하지만, 바이러스 입자의 국제화를 방지합니다. 세포를 고정 및 투과 화 바이러스 부착을 측정하는 STV-Cy3에 염색 할 수있다. 블로킹 단계는 세포가 비 - 표지 된 스트렙 타비 딘 (STV)와 함께 배양 된 정착 전에 적용하는 경우 외, 첨부 된 비리 온으로부터 신호가 폐기 될 수있다. 다음 단계에서, 바이오틴 IAV 부착 다음, 온도는 37 ° C로 시프트하고, 바이러스 입자의 내재화가 일어나는 것이 허용된다. 내면화 입자함으로써 외의의 뜻과 세포 내 바이러스 사이의 차별을 허용하는 STV의 결합으로부터 보호됩니다. 실험 조건 당 4 개의 샘플이 필요한 &#39;0 분&#39;첫번째 샘플, 표지 된 &#39;0 분&#39;, 세포 표면에 결합 된 초기 바이러스를 측정하는 방법이다. &#39;0 분 + STV&#39;: 제 2 샘플, &#39;0 분 + STV&#39;표시는, 실험의 기준 신호 강도를 제공한다. 첨부 된 바이러스는 재치 차단시간 STV와 STV-를 Cy3와 신호 다음 염색 &#39;0 분&#39;샘플에 비해 훨씬 낮은해야합니다. &#39;30 분 &#39;세 번째 샘플, &#39;30 분&#39;이 때문에 30 분 동안 37 ° C의 온도 변화에 부착 바이러스를 내면화 포함되어 있습니다. &#39;30 분 + STV &#39;네 번째 샘플, &#39;30 분 + STV&#39;조치 바이러스의 세포 내 부분. STV 차단 단계는 30 분 잠복기 후에 적용됩니다. 결과적으로, 세포 표면에 바이러스 입자가 STV-Cy3에 염색 만 내재화 바이러스 가능한 이탈 STV에 구속된다. 내재화 바이러스의 상대적인 양은 &#39;(샘플 &#39;30 분 설명) 바이러스의 총량으로 나눈 값 (샘플 &#39;30 분 + STV 측정)&#39;내재화 바이러스의 비율로 계산 될 수있다. 컨트롤로서 우리는 모의 감염된 세포를 포함하는 것이 좋습니다. 모의 - 감염된 세포의 STV-Cy3에 염색 다음 신호는 배경을 준다염색 프로토콜의 결과. IAV 부착용 제어 세균 뉴 라미니다 제 (NA)와 세포의 전처리이다. 세포 당 단백질의 시알 산 오프 NA 클리브는함으로써 세포 표면 수용체에서 부착을 제거하는 단계를 포함한다. 아 지드 화 나트륨 (SA)의 강력한 억제제 인 대사시켜 블록 (13)은 세포 내 이입. 아 지드 화 나트륨으로 처리 된 세포는 국제화를위한 바인딩 바이러스 양성하지만 부정적인해야한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

네 개의 다른 실험 조건을 나타내는 만화는도 1에 도시되는 대표적인 실험의 결과는도 2에 제시된다 -. 5. &quot;0 분&quot;샘플에서 바이오틴 바이러스 초기 바인딩 된 STV-Cy3에 염색으로 가시화 될 수있는 세포를 대상으로 (도 1 및도 2). ( &quot;0 분 + STV&quot;샘플에서) 차단하는 단계가 적용되는 경우, 세포 표면에서 바이러스가 더 이상 STV-Cy3에 염색에 ?...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K 조회수.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

생물학

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 숙주 세포에 대한 박테리아 부착 감지)

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...