Bu yöntem, araştırmacıların kadın üreme sisteminde yaşayan ve enfeksiyonlara neden olan anaerobik bakterilerin biyolojisini ve patofizyolojisini incelemelerine yardımcı olacaktır. Önceki murin vajinal aşılama modelleri, aerobik koşullar altında yetiştirilen ve geri kazanılan bakterilere odaklanmıştır. Yöntemimiz, oksijen maruziyetini en aza indirmek için ek stratejiler gerektiren zorunlu anaerobik bakterilerin aşılanması ve geri kazanılması konusunda talimat verir.
Ne kadar titiz olduklarına bağlı olarak, bu modelde kullanılan yeni bakteri suşları belirli adımlarda değişiklik gerektirebilir. Makalenin birinci tablosunda potansiyel değişiklikler için önerilerde bulunduk. Başlangıç olarak, anaerobik bir odada 800 mikrolitre taze ortam içeren 1.5 mililitrelik bir küvete 200 mikrolitre 16 saatlik bakteri kültürü ekleyin.
Daha sonra, seyreltilmiş kültürün optik yoğunluğunu veya OD'yi, bir spektrofotometrede 600 nanometrede, yalnızca boş olarak ortam bulunan ayrı bir küvet kullanarak ölçtü. Kültürün gerçek OD değerini elde etmek için, spektrofotometre okumasını beşle çarpın, ardından deney için gerekli olan inokulum hacmini belirleyin ve gerekli inokulum yoğunluğunu elde etmek için gereken bakteri kültürünün hacmini hesaplayın. Daha sonra, gerekli bakteri kültürü hacmini steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve bir ila üç dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüj yapın.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, daha önce hesaplanan gerekli inokülum hacmini elde etmek için peleti anaerobik PBS'de yeniden askıya alın. Hazırlanan inokulumdaki bakteriyel koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için, ilk olarak, PBS'de birkaç seri seyreltme yapmak için 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon kullanın ve agar plakalarındaki plaka inokülum seyreltmelerini tespit etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Aynı zamanda, vajinal lavaj tüplerini anaerobik odadaki 70 mikrolitre steril anaerobik PBS'yi fare numaralarıyla etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine pipetleyerek hazırlayın.
Tüpleri sıkıca kapatın ve odadan çıkarın. Vajinal lavaj yapmak için, ilk önce, ön pençeleriyle tutabileceği bir kafesin üstüne bir fare yerleştirin. Ardından, kuyruğun orta kısmını yavaşça tutun ve arka çeyrekler hafifçe yükselecek ve vajinal açıklık açığa çıkacak şekilde kaldırın.
Etiketli yıkama tüpünden 50 mikrolitre PBS çektikten sonra, pipet ucunu vajinal lümenin içine iki ila üç milimetre yavaşça yerleştirin ve üç ila dört kez pipetleyerek PBS ile yıkayın. Ardından, yıkama malzemesini kalan 20 mikrolitre kullanılmayan PBS ile orijinal yıkama tüpüne geri aktarın. Bu vajinal lavajdan hemen sonra, her fareyi vajinal olarak 20 mikrolitre bakteriyel süspansiyon veya araç kontrolü aktararak aşılayın.
İki farklı bakteri suşu ile birlikte aşılama deneyleri için, suşları önceden karıştırmak yerine, her bir bakteriyel süspansiyonun 10 mikrolitresi ile ayrı ayrı aşılayın. Uygulanan hacmin vajinal introitusta hemen birikmesini önlemek için, farenin arka kısmını 10 ila 20 saniye boyunca tutmaya devam edin. Aşılanmış fareyi yeni bir kafese veya önceden aşılanmış kafes arkadaşlarına aktarın ve prosedürü diğer farelerle tekrarlayın.
Tüm fareleri aşıladıktan sonra, anaerobik odadaki inokulumun seri seyreltilerini kaplayarak inokulum sonrası koloni oluşturan birimleri alın. Fare organlarını toplamak için, vajinalar ve serviksler için her tüpe bir mililitre steril anaerobik PBS ekleyerek anaerobik odada beş mililitrelik organ toplama tüpleri hazırlayın. Rahim boynuzları için işaretlenmiş tüplere 750 mililitre PBS ekleyin.
Son lavajı kurban olarak toplamak için, daha önce gösterildiği gibi başka bir vajinal lavaj tüpü seti hazırlayın. Ayrıca, diseksiyon aletlerini durulamak ve sterilize etmek için, 50 mililitrelik deiyonize su kabı ve% 70 ila% 90 etanollük 50 mililitrelik bir beher hazırlayın. Fareleri kurban etmeden hemen önce veya sonra, daha önce gösterildiği gibi son lavajı gerçekleştirin.
Fedakarlıktan sonra, bir farenin karnını ve sırtını% 70 etanol ile püskürtün. Daha sonra, farenin karın pelvik boşluğunu dikey kesiklerle açmak için etanol sterilize edilmiş ve kurutulmuş makas kullanın. Ardından, cildi geri çekmek için forsepsleri kullanın.
Üreme sistemini açığa çıkarmak için, bağırsakları vücut boşluğundan açık alanın yanına yavaşça itin ve üreme sisteminin alt kısmına erişmek için mesaneyi fareden çıkarın. Bundan sonra, vajinayı kesmeden kasık kemiğinin merkezini makasla klipsleyin. Daha sonra, pelvisin her iki tarafını tutmak için iki set forseps kullanın ve vajinanın alt kısmını altına maruz bırakmak için pelvisi yanal olarak açın.
Serviksi forseps ile yavaşça tutun ve kolonu ortaya çıkarmak için yukarı çekin. Bundan sonra, vajinayı dış bağ dokularından serbest bırakmak için küçük makas kullanın. Bağırsak sistemini delmeden vajinayı kolondan dikkatlice serbest bırakın.
Vajina kolondan tamamen serbest bırakıldığında, vajinayı introitusa sarmak için makas kullanın ve ardından fare gövdesinden çıkarmak için kırpın. Serviks üzerinde nazik bir tutuş sağlayarak, uterus boynuzlarını daha görünür hale getirmek için yukarı doğru çekin ve uterus boynuzlarını serbest bırakmak için sağ ve sol taraftaki yumurtalıkların hemen altında kesin. Ardından, üreme sistemini fare gövdesinden çıkarın ve steril bir Petri kabına yerleştirin.
Daha sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak, uterus boynuzlarını, serviksi ve vajinayı ayırın. Her dokuyu kendi etiketli toplama tüpüne yerleştirin. Organların homojenizasyonu için, bir biyogüvenlik kabininde el tipi homojenizatörü hazır bulundurun.
İlk olarak, her organı homojenize ettikten sonra homojenizatör bıçaklarını yıkamak için sırasıyla deiyonize su,% 70 etanol ve PBS içeren üç adet 50 mililitrelik tüp seti hazırlayın. Homojenizatörü temizlemek için, bıçağı su borusuna batırın ve makineyi yaklaşık üç saniye boyunca tam hızda açın. Ardından, fazla suyu gidermek için bıçağı bir kağıt havlu üzerinde sallayın.
Bıçağı art arda %70 etanol ve PBS ile durulayın. İlk durulamadan sonra, homojenizatör probunu, altındaki dokuyu yakalamak için organları olan bir tüpün dibine indirin. Ardından, dokuyu öğütmek için homojenizatörü açın ve probu yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek suya batırılmış halde tutun.
Homojenizatörü kapatıp çıkarın ve görsel olarak dokunun tamamen bozulmasını sağlayın. Homojenizasyondan sonra, numuneyi anaerobik odaya geri döngüleyin ve CFU geri kazanımı için seri seyreltme gerçekleştirin. Bu protokolü takiben, canlı bakterilerin geri kazanımı ve vajinal yıkamalardan koloni oluşturan birimlerin sayımı, bakteriyel suşlar, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için başarıyla yapılabilir.
Ayrıca, vajinal yıkamalardan elde edilen Gardnerella vaginalis koloni oluşturan ünitelerin sayısı, vajinal doku homojenatlarından elde edilenlerle korelasyon göstermiştir. Bu yöntem aynı zamanda Prevotella bivia titrelerinin ve fare uterus dokularının, Gardnerella vaginalis ile birlikte enfeksiyon sırasında Prevotella mono-enfeksiyonuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, bu yöntem, mutant bir Fusobacterium nucleatum suşunun vajinal kalıcılığını, aşılamadan 24 ve 72 saat sonra vahşi tipinkiyle karşılaştırmak için başarıyla kullanılabilir.
Vajinal bakteriyel aşılamaya karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için, doku homojenatları üzerinde sitokin testleri yapılabilir. Alternatif olarak, dokular inflamasyon belirtilerini değerlendirmek için histolojik inceleme için saklanabilir.
