Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples at JoVE.com

The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

protokol IRST İnsan Araştırmaları Etik Komitesi kuralları takip eder. NOT: Bu protokol, biz bir UCF DNA bütünlüğü analizi gerçekleştirmek için idrar örneklerinden DNA izole edilmiştir. LNCaP ve MRC hücre çizgileri standart oluşturmak için kullanıldı. Örneğin belirli onkogenlerin DNA ekstraksiyonu (kontrol geni için spektrofotometre ve gerçek zamanlı PCR, STOX1) DNA miktar, ve gerçek zamanlı PCR gibi teknikler (Şekil 1) uygulandı. 1. İdrar Toplama ve İşleme <ol><li> Temiz, kuru, plastik bardak temiz bir-catch ilk sabah idrar örneği almak. idrar örneğinin en az 50 mL toplayın. </li><li> 3 saatlik bir süre için 4 ° C sıcaklıkta idrar korumak ve aynı sıcaklıkta laboratuvara gönder. </li><li> iki adet 50-ml konik tabanlı polipropilen tüpler içine laboratuar ve transfer girişte iki kez hemen evirerek her bir örnek karıştırın. </li><li> tüpleri santrifüj4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 850 x g&#39;de. </li><li> Dikkatle hücre peleti üzerinde yüzen kısımların en az 2 mL bırakarak iki adet 5 ml tüpler içine idrar yüzer üst kısmının 10 mL aktarın. Not: yüzer üst kısmı aktarma hücreler ya da hücre döküntülerinin kirlenme riskini azaltır. Üst ve alt parçalar arasında net bir tarif bulunmamaktadır. </li><li> pelet atın ve hemen kullanıma kadar -80 ° C süpernatant dondurmak. </li></ol> İdrar süpernatant ve Hücre Hatları 2. DNA İzolasyonu NOT: Bir hücre hattından DNA izole (örneğin, LNCaP mesane kanseri için prostat kanseri ya da MRC için) bir ticari kit kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek. aşağıdaki gibi idrar süpernatanından DNA izolasyonu değiştirilmiş ticari protokol kullanılarak yapılmalıdır: <ol><li> Oda sıcaklığında idrar yüzer bir kısım çözülme. &lt;/ Li&gt; <li> Vorteks ve idrar örneği karıştırın ve berrak bir 5 ml tüp içine idrar 1 mL süpernatan aktarın. -80 ° C&#39;de rezidüel idrar dondurun. </li><li> doğrudan numune için proteinaz K, 100 uL ekleyin. </li><li> örnek AL tamponu 1 ml ilave edilir ve pipetleme iyice karıştırın. </li><li> tüpleri kapatın ve 15 dakika süreyle 56 ° C&#39;de numune inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, her bir örnek için bir sütun hazırlamak ve üreticinin talimatlarına göre yıkama tamponları, Aw1 ve Aw2, (% 100 etanol belirtilen miktarda ekleyebilirsiniz) hazırlar. </li><li> Lütfen, oda sıcaklığına kadar örnekleri getirin ve mutlak etanol 1 ml. Pipetleme tarafından tamamen karıştırın. </li><li> sütun aşama 2.7 &#39;de elde edilen karışımın 650 uL ilave edilir ve 1 dakika süre ile 6000 x g de o santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü sütun yerleştirin. Numune karışımının tüm (5 kez) kullanılır olmuştur yineleyerek 2.8 ve 2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> Ekle 500# 181; sütunun jant ıslatmadan tampon Aw1 L. 1 dakika boyunca 6.000 xg&#39;de bunu santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin. </li><li> Sütunun çemberinin ıslatmadan tamponu Aw2 500 uL ekleyin. 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 xg) bunu santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin. </li><li> Adımı yineleyin 2.12 herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için. </li><li> Temiz bir 1.5 mL tüp içine sütun yerleştirin. elüsyon tamponu AE 50 mcL ekleyin ve tampon ıslatır o sütunu sağlamak için 7 dakika bekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca 8.000 xg&#39;de bunu santrifüj. </li><li> mini sütuna adım 2.15 den eluent Pipet ve DNA&#39;nın maksimum iyileşme sağlamak için 1 dakika boyunca maksimum hızda bunu santrifüj. </li></ol> 3. DNA sayısallaştırılması ve Seyreltme <ol><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, bot DNA ölçümü gerçekleştirmekH hücre çizgisi ve idrar süpernatan örnekleri. üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir tezgah üstü spektrometresi üzerindeki örnekte 2 uL kullanın. </li><li> 1 ng / ul konsantrasyon elde DNA bütünlüğü analize kadar -20 ° C &#39;de DNA depolamak için Lake Buena Vista DNA örnekleri seyreltilir. Not: DNA miktarı gerçek zamanlı PCR (en az 100 ng) ile devam etmek için yeterli değildir, yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirmek. </li><li> Farklı konsantrasyonlarda altı standartları elde etmek için hücre çizgisi örnekleri DNA seyreltilir: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5 ve 2 ng / ml, 100 uL hacimde (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2, her biri ve ST6). DNA bütünlüğü analiz edilinceye kadar -20 ° C&#39;de hücre çizgisi DNA standartları saklayın. </li></ol> 4. DNA Bütünlük Testi - PCR <ol><li> primerler (konsantrasyon deneyi türüne bağlıdır), yeşil Supermix, hücre hattı, DNA standartları ve buz üzerinde UCF DNA, seyreltilmiş örnekler çözülme. </li><li> plaka f şerit tüpleri hazırlayınveya 72 oyuklu rotor diski. Kısım her bir standart ve seyreltilmiş örnek negatif kontrol için RNaz içermeyen su, 10 uL, iki kopya halinde 10 uL. </li><li> Her bir primerden 1 ul bir karışımını hazırlamak, (konsantrasyonları, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir), yeşil Supermix 12.5 uL, ve her bir örnek için RNaz içermeyen su 6.5 uL. 2 çoğaltır, 2 çoğaltır için negatif kontrol ve 2 ekstra numuneler için numune 2 çoğaltır 6 standartları, sayı: karışımı hazırlarken, aşağıdaki örneklerin sayısını kullanın. </li><li> her bir kuyunun içine karışımın Kısım 15 uL. pipetle veya tüpleri dönmeye etmeyin. </li><li> Tablo 1 &#39;de gösterilen PCR, aşağıdaki koşullar ile bir protokol başlatın. NOT: 29 x 2 numuneleri + 6 x 2 standartlarına + negatif kontrol x 2 = 72 (UCF DNA değeri): UCF DNA değeri için, 29 DNA örnekleri 72-kuyu rotor diskini kullanarak her gerçek zamanlı deney için işlendi. NOT: UCF DNA bütünlüğü analizi için protokol de olabilir(Başka bir cihaz kullanırken, ROX boya eklenmesi gerekebilir) başka PCR gerçek zamanlı cihazı kullanılarak yapıldı. </li></ol> 5. DNA Bütünlük Testi - Veri Analizi ve Yorumlanması Not: Daha önce 7-9 (Şekil 2) tarif edildiği gibi, her bir örnek için UCF DNA, bir değer, her bir PCR gen değerlendirilmesi için standart bir eğri yapı ile ve standart eğri interpolasyon kullanarak gerçek zamanlı cihazı algılama sistemi yazılımı ile elde edilmiştir. <ol><li> çoğaltır değerlendirin; Örnek bir fark ile çoğaltır ≥1 Ct atılmalıdır ve bir ikinci deneyde yeniden değerlendirildi. </li><li> Her numune için medyan Ct hesaplayın ve 36 ≤ bir Ct değeri örnekleri göz önünde bulundurun. </li><li> erime analizi kullanılarak PCR ürünlerinin özgüllüğünü değerlendirin. </li><li> standart eğri ile enterpolasyon her amplikon konsantrasyonunu değerlendirmek; Her amplikon için konsantrasyon değeri (ng / ml) edinin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer.">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li><li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine:+Sources,+Structure,+Diagnostic+Potential.">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li><li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer:+urine+supernatant+versus+urine+sediment.">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li><li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA.">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li><li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+Integrity,+Applications+for+Cancer+Research.">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li><li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer.">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients.">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).</li><li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis:+a+pilot+study.">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).</li><li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis:+preliminary+data.">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer.">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li><li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2/neu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer.">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li><li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma.">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li><li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer.">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

UCF DNA bütünlüğü analizi idrar DNA bütünlüğünü değerlendirmek için yeni bir non-invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda mesane 9 ve prostat kanserleri 7,8 erken teşhisi için önerilmiştir. avantajları ve UCF DNA bütünlüğü testi dezavantajları bir dizi birlikte geleceği ile burada tartışılır. yaklaşımın ana avantajı ucuz, non-invazif bir yöntem ve moleküler biyoloji teknikleri sadece temel bilgi gerektiren biyomarkerların potansiyel bir...

Hücresiz bir DNA ya apoptotik ya da nekrotik mekanizma ile kan ve hücre ölümüne bağlı idrarda tespit edilebilir. Kandaki hücre-serbest DNA çok çeşitli hastalıklarda tanısal ve prognostik amaçlarla özellikle kanser 1 çalışılmıştır. Ancak, daha az idrar hücre içermeyen (UCF) DNA&#39;nın rolü hakkında bilinmektedir. UCF DNA glomerüler filtrasyon sistemi aracılığıyla ya da bu vücut sıvısı 2 (örn ürotelyal hücreler veya prostat hücreleri) ile doğrudan temas içine gelen hücrelerden kan geçen kaynaklanabilir. Biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA kullanımı esas olarak idrar yolu hücrelerinden 3,4 doğrudan gelen UCF DNA yüksek yüzdesi böbrek, mesane ve prostat kanserinin erken tanısı için incelenmiştir. Küçük UCF DNA ve izole ve karakterize etmek için en iyi yöntemler hakkında bilinmektedir. Değerlendirme tümör hücreleri normal hücrelerden daha uzun DNA fragmanlarını serbest hipotezi göz önüne alındığındahücresiz DNA bütünlüğünü Kan dolaşımı, 5 DNA kökenini aydınlatmak için bir girişim olarak ele alınmıştır. Bazı çalışmalar kanda hücresiz DNA bütünlüğü kanseri 6 birçok türleri iyi bir tanı testi temsil eder ve aynı hipotez idrar 7-9 ile ilişkili olarak önerilmiştir olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, mesane ve prostat kanserinin tespiti için potansiyel bir uygulama ile UCF DNA bütünlüğü analizi için yeni bir yöntem tarif eder. Özellikle, UCF DNA bütünlüğü daha uzun 250 bp prostat ve mesane kanseri dahil olmak üzere katı tümörlerin, artan bir DNA kopya numarası olduğu bilinen 4 bölgelerde test edildi fragmanları: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) ve Ar (Xq12) 10-14. Belirli onkogenler yerine rastgele diziler, kanser hastalarının hücresiz fraksiyonu bularak olasılığını arttırmak için seçilmiştir. ana avantajlarından biri,bu yöntem, esnek olduğu ve diğer bölgelerde tümör tipi ve özellikleri temelinde seçilebilir olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

plazma ya da serum içinde hücresiz DNA devrede olmasına yaygın birçok kanser türü için biyolojik belirteçler, uygun bir kaynağı olduğu gösterilmiş olmakla birlikte, çok az çalışma idrar hücresiz (Lake Buena Vista) DNA potansiyel kullanımı üzerinde de yoğunlaşmıştır. uzun DNA, prostat veya mesane kanseri ve sağlıklı bireyler olan hastaların ayırt edebilen bir erken tanı markeri olarak değerlendirildi UCF DNA bütünlüğü potansiyel rolü, normal apoptotik hücreler son derece parçalanmış DNA üretmek hipotez ve kanser hücrelerinden serbest bırakılmasına başlatılıyor. C-myc, BCAS1, HER2 ve Ar: Bir Lake Buena Vista DNA bütünlüğü analizi 250 bp daha uzun dört dizilerin dört gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri bazında önerilmiştir. Sık sık, mesane ve prostat kanserleri artan bir DNA kopya numarası dizileri analiz için seçilmiştir, ancak yöntem esnektir ve bu genler, entegrasyon bölgesinin diğer genler ile ikame edilebilirdinlenme. biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA&#39;nın potansiyel yarar zaten böylece UCF DNA karakterizasyonu üzerine ileri çalışmalar için önünü, ürolojik maligniteler için ortaya konmuştur. UCF DNA bütünlüğü testi non-invaziv, hızlı ve kolay uygulanabilir, analiz gerçekleştirmek için gerekli idrar sadece birkaç mililitre olma avantajına sahiptir.

Tüm numuneler 1.51 ila 138 ng / uL bir dizi gösteren analiz için toplam serbest DNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak ölçülebilir oldu. Beş kontrol numuneleri verilerin yeniden üretilebilirlik için kullanılmıştır: iki bağımsız gerçek zamanlı deneyleri, c-myc, HER2, BCAS1, AR ve STOX1 yapıldı. Varyasyon (CV) katsayılar, daha sonra, iki bağımsız deneyin arasında yeniden iyi bir derecede (Tablo 2), ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples at JoVE.com

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K Görüntüleme.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Video: Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetik

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Kanser Araştırmaları

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Biyokimya

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kanser Teşhisi için CRISPR-Cas Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Yazar Spotlight: Hastalık Tespiti ve Görüntüleme için Mühendislik Moleküler Araçları

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi