DN AB 7.ÇP projelerinin PEPDIODE (GA 256672) ve REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157), ve İsrail Bilim Vakfı kişisel bir araştırma bursu (No 268/10) destek kabul eder. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek için Prof. Shmuel Rubinstein, Mühendislik Okulu ve Uygulamalı Bilimler, Harvard Üniversitesi, Cambridge MA, ABD teşekkür ederim.

1. Chl bir stok Çözümler hazırlanması <ol><li> KRİTİK ADIM: ışık zararını minimuma indirmek için yeşil ışık (520 nm) veya karanlıkta altında kimyasal bir kaput klorofil hazırlık tüm adımları. Her depolama için pigmentler dondurma işleminden önce nitrojen veya argon ekleyin. Tüm çözücüler analitik dereceli olduğundan emin olun. </li><li> Tilakoit membranlarda tek Chl A içeren liyofilize Spirulina platensis&#39;in hücreleri veya diğer siyanobakteriyi hücrelerin yaklaşık 5 mg tartılır ve bir havan ve havan tokmağı kullanarak ezmek. </li><li> cam kolonuna ezilmiş hücreleri yükleyin ve karotenoidler uzaklaştırmak için yaklaşık 50-100 ml% 100 aseton ile yıkanır. akıtılarak turuncu / yeşil fraksiyonu atın. Not: turuncu fraksiyonu 100 ml aseton ile yıkanır ise yeşil fraksiyon elüte başlayana kadar aseton ile hücrelerin yıkanması devam eder. </li><li> Değişim% 100 metanol ile aseton ve CHL bir içeren yeşil kısmını toplamak. yıkandı, Fract hacmiiyon 50-100 ml arasında değişebilir. Başlangıçta, Elüe edilen fraksiyon elüsyonun sonunda soluk yeşil dönüşür koyu yeşil bir renge sahiptir. yıkandı, fraksiyonun rengi soluk yeşil içine döndüğünde elüsyon durdurun. </li><li> Ekstre tamamen kuruyana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak metanol buharlaştırın. çözüm ısı uygulamayın; evaporatör su banyosu sıcaklığı 30 ° C&#39;yi aşmayacak şekilde sağlar. Not: buharlaşma süresi buharlaştırılmadan Metanol fraksiyonunun hacmine bağlıdır ve 10-60 dakika arasında değişebilir. Tamamen kurutun önemlidir. </li><li> dietil eter (5-10 ml), küçük bir hacim içinde kurutuldu ekstreden pigmentler çözülür ve pamuk süzülür. pigmentler tam filtrelemeden önce eter emin olun. </li><li> pigmentler (10-30 dk) tamamen kuruyana kadar dietil eter buharlaşır. Not: Kuru pigment ile temizlendi ve nitrojen veya argon altında tutulabilir -20 ° C, daha sonra işlenene kadar karanlıkta. </li><li> her şey tamamen askıya bile, 100% metanol (1 mi) mümkün olan en küçük hacimde, kuru pigment çözülür. çözeltiye 4 ml aseton ekleyin ve tümüyle pigmentleri eritmek için hafifçe cam itin. </li><li> Pasteur pipeti kullanılarak, DEAE sütun% 100 aseton içinde dengelenmiş Sefaroz üzerine yavaşça örnek yüklemek. </li><li> % 100 aseton ile elüte karotenoidler (turuncu-sarı bir bant). 1 h / h oranında aseton / metanol karışımı: Daha sonra, 3 Chl bir (yeşil bant) yıkayın. Not: aseton, aseton / metanol karışımının hacmi sütunu üzerine yüklenmiş Sefaroz DEAE hacmine yaklaşık olarak eşittir. </li><li> Elüent 17 olarak 2 diklorometan / n-heksan / izopropanol / metanol (h / h) karışımı: 25: 5: CHL 68 kullanılarak ince tabaka kromatografisi ile bir saflığa edin. </li><li> Chl tamamen kuruyana kadar (bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılmakta 1060 dakika). Not: Kuru Chl bir nitrojen veya argon ile temizlendi ve karanlıkta -20 ° C&#39;de argon atmosferi altında depolanır. </li><li> % 100 etanol 2-4 ml kuru Chl a yeniden eriterek CHL bir stok solüsyonu hazırlayın. Not: 663 nm&#39;de Chl a ekstinksiyon katsayısı 74.400 cm-1 M-1 (83.3 cm-1 (mg / mL) -1), etanol bulunmaktadır. Tipik bir stok çözeltisi, 25 mM (23 mg / ml) &#39;in bir konsantrasyonuna karşılık gelen 1.860 OD olmalıdır. Chl 10 kat molar fazlası, bir genel ile bir karışım içinde, organik faz 5 ml, ve sulu faz 1 ve sonuçlar ml WSCP 1 mg içeren bir emülsiyon, bu stoğun 20 ul ekleyerek WSCP. </li></ol> 2. Emülsiyon Organik fazın hazırlanması Emülsiyonun Organik faz (h / h) Span 80% 4.5 ihtiva eden mineral yağ oluşur ve% 0.4 (v / v) Tween 80: edin. <ol><li> T bir 50 ml tüp 0.2 g tartılır80 Span 80, 1.8 g, ve mineral yağı 38 g kavuştu. de tüm bileşenleri karıştırın ve buz üzerinde soğumasını. Not: Organik faz, bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Emülsiyonun sulu fazın hazırlanması Not: emülsiyonun sulu fazı saflaştırılmış WSCP veya WSCP Aşırı Sunan Bakteriler ham ekstresi, ya meydana gelebilir. <ol><li> Saflaştırılmış WSCP ihtiva eden bir sulu fazın hazırlanması. <ol><li> 0.3-0.6 OD kadar 37 ° C&#39;de LB ortamı, 1 L WSCP plazmidi 12 içeren E.coli BL21 bakteri büyütün. </li><li> 1 mM IPTG eklenmesi ile, protein ifadesini teşvik eder. İndüksiyondan sonra 12-16 saat boyunca 30 ° C&#39;de bakterileri büyür. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüjleme ile hasat bakteri. </li><li> buz üzerinde tampon ve sonikasyon bağlama pelet (30 sn, 15 sn kapalı, beş kez) eritin. 250 ml santrifüj elde edilen topak tampon için 10 ml,protein aşırı eksprese eden hücrelere sahip LB ortamı. Not: saflaştırma yöntemine bağlı olarak, bağlama tamponu, 100 mM fosfat tamponu, pH 7.2 ya da 50 mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCI, 5 mM EDTA imal edilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de hücre lizatının Spin. </li><li> afinite kromatografisi ile WSCP saflaştınlır. WSCP kaynaşmış etiketi bağlı olarak, üreticinin talimatlarına aşağıdaki protein saflaştırma için uygun ticari olarak mevcut afinite kromatografisi sistemini kullanarak rekombinant proteinleri arındırmak. </li><li> Emülsiyon hazırlanması için, 50 mM saflaştırılmış WSCP fosfat tamponu, pH 7.8 kullanımı. Sulandırma için kullanılan son protein miktarı, 1 ml tampon başına 0.5-1.0 mg olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> WSCP Ham bakteriyel lizat içeren bir sulu fazın hazırlanması. <ol><li> OD 0.3-0.6 kadar 37 ° C&#39;de LB ortamı, 250 ml plazmid ifade WSCP ihtiva eden E. coli BL21 hücrelerinden büyütün. </li><li> protein ifadesini uyarmak1 mM IPTG ve 30 ° C&#39;de gece boyunca bakteri büyür. </li><li> santrifüj ile hasat bakteri hücreleri 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de 1-2 mi 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8, sonikasyon (30 saniye, 15 saniye kapalı, üç kez) ve santrifüj pelet çözülür. </li><li> 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8 içinde 0.875 ml süpernatan 0.125 ml karıştırılarak emülsiyonun sulu fazı hazırlanır. </li></ol></li></ol> Emülsiyon Chl a ile WSCP 4. Montaj <ol><li> Bir cam şişenin içine transfer yağı yüzey aktif madde karışımının 5 ml buz üzerinde soğutulur. pipetleme önce, organik fazın tüm bileşenler iyice karıştırıldığı emin olun ve yüzey aktif maddeler ve mineral yağı ile herhangi bir faz ayrılması bulunmaktadır. </li><li> organik faz 5 ml bölüm 3&#39;te gibi hazırlanan buz soğukluğunda sulu faz 1 ml ilave edilir. </li><li> Buz üzerinde 9,500 rpm&#39;de 2 dakika boyunca, bir doku homojenleştirici kullanarak, her iki faz karıştırılır.</li><li> KRİTİK ADIM: Bu aşamadan sonra, fotohasar en aza indirmek için yeşil ışık (520 nm) altında diğer tüm adımları uygulayın. 25 mM Chl stok çözeltisi 20 ul ekle emülsiyona (bölüm 1.13 bakınız). Flicking ve cam şişe tersini dağılırlar. Chl eşit emülsiyon dağıtılır emin olun. </li><li> karanlıkta buz üzerinde 1-2 saat boyunca emülsiyonun inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g&#39;de 1.5 ml&#39;lik plastik tüplere ve santrifüj emülsiyonun aktarmak organik fazdan emülsiyonu ve ayrı su damlacıklarının parçalamak için. Not: Montaj başarılı olursa, alt sulu faz yeşil bir renge sahip olmalıdır. </li><li> Üst yağ fazı imha ve mineral yağ 1 ml. girdap ya da iyice tüpü çevirerek pelet haline emülsiyon iyi madeni yağ karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g&#39;de örnek Spin. sulu ve madenci ayıran net bir menisküs kadar bu adımı yineleyinherhangi bir ara madde emülsiyon olmayan ark yağ safhaları, elde edilir. </li><li> Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin. Sulu ve mineral yağ safhaları, birbirinden ayrılır sonra madeni yağ çıkarın ve su ile doyurulmuş dietil eter 1 ml. Vortex ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14.000 xg örnek aşağı doğru döndürün. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> İkinci santrifüj işleminden sonra dietil eter uzaklaştırılmış ve kaputu 5-20 dakika açık tüpler bırakın. </li><li> Son olarak, bir tuz giderme kolonu üzerine WSCP / Chl bir kompleks ihtiva eden sulu bir faz yük ve ileri deneyler için uygun bir tampon ile elüte. Not: Protein pH (6.0-7.5) arasında geniş bir aralıkta fosfat ve Tris tampon stabildir. Örnek bir aya kadar ışıktan korunan 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated.">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li><li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria.">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li><li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates.">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li><li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants:+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes.">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li><li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein.">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li><li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+chlorophyll+protein+(WSCP)+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique.">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li><li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants.">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li><li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein.">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li><li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide.">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li><li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein,+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower.">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li><li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives.">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li><li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+(Brassica+oleracea+var.+gemmifera).">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li><li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish.">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li><li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana.">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li><li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls.">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li><li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions.">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li><li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation.">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li><li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a/b-protein+from+brussels+sprouts.">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li><li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum.">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Amacımız, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlama proteinlerinin kurulması için bir yeni genel sistem geliştirmektir. Burada W / O emülsiyon dayalı yeni sulandırma sistemi rekombinant olarak E. ifade Brüksel lahanası, karnabahar, Japon horseradish ve Virginia pepperweed gelen WSCP apoproteinlerden montajı için çalışmaya kanıtlanmış genel bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir E. coli. Burada sonuç Chl, bir 10-misli molar fazlası ile WSCP 1 mg yeniden o...

Bu tür klorofil (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) ve karotenoidler gibi hidrofobik pigmentler elektron taşıma ve ışık enerjisi yakalama ve transfer yürütmek fotosentetik reaksiyon merkezleri ve hafif hasat proteinler birincil kofaktörleridir. Reaksiyon merkezleri ve Chl bağlayıcı ışık toplayıcı komplekslerinin en transmembran proteinlerdir. Olmayan oksijenik fotosentez yeşil-sülfür bakterilerin 1,2 Fenna-Matthews-Olson (FMO), protein, ve dinoflagellatlar 3 peridinin-Chl proteini (PCP) suda çözünür ışık toplayıcı proteinlerin olağanüstü örneklerdir. Suda çözünür klorofil bağlama proteinleri (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae ve Amaranthaceae bitkiler 4, 5, başka bir eşsiz bir örnek, henüz FMO ve PCP aksine, bu hafif hasat ne de birincil fotosentetik reaksiyon herhangi de katılmaktadırlar ve onların kesin physiological fonksiyonları henüz 5-8 belirsizdir. Bunların yüksek Chl-bağlama çekiciliği, geçici Chls taşıyıcıları ve CHİ türevleri 9,10 olarak önerilen bir işleve yol açmıştır. Seçenek olarak ise, bu WSCP zarar hücrelerde Chls tutucu bir rol oynar ve Chl kaynaklı fotooksidatif hasara 7,11-13 karşı koruma olduğu varsayılmıştır. Daha yakın zamanda, bir proteaz inhibitörü olarak bu WSCP işlevleri ileri ve otçul direnci sırasında önemli bir rol oynar gibi çiçek gelişimi 14 esnasında hücre ölümünü düzenlemektedir. WSCPs kendi fotofiziksel özelliklere göre iki ana sınıfa ayrılır. Birinci sınıf (sınıf I, örneğin. Chenopodium albümünden) aydınlatma üzerine Fotoçevrim uğrayabilir. Fotoçevrim 5,10 uğramayan Brassica bitkileri, gelen Sınıf II WSCPs, başka bir sınıfı IIa bölünmüştür (örn., Brassica oleracea, Raphanus sativus elde edilmiş) ve IIb (örn., Lepidium virginicum gelen </em&gt;). Lepidium virginicum Sınıf IIb WSCP yapısı 2.0 Å çözünürlükte 8 X-ışını kristalografisi tarafından çözüldü. Bu protein alt-birimleri, bir hidrofobik çekirdek oluşturan bir simetrik homotetramer ortaya koymaktadır. Her bir alt-birimi, tüm Chl düzenlemesi Chl-protein kompleksleri bağlanmasını ve montaj çalışmaları için WSCPs potansiyel olarak yararlı bir model sistemi sağlar, basit core.This içinde dört yakından dolu Chls sıkı bir düzenleme ile sonuçlanan tek bir CHL ve Chls komşu etkilerini bağlanan ve bireysel Chls spektral ve elektronik özellikleri protein ortamları. Ayrıca, yapay fotosentetik cihazlar ışık hasat modüller için kullanılabilir yapay Chl bağlayıcı proteinler oluşturmak için şablon sağlayabilir. Bitkilerden izole kompleksleri her Chl a farklı kombinasyonları ile tetramerleri heterojen bir karışımı içerdiğinden nativ WSCPs titiz çalışmaları mümkün değildirve Chl b 9. Bu nedenle, in vitro Chls ile rekombinant olarak ifade WSCPs monte edilmesi için bir yöntem olup gereklidir. Bu 15 gösterilmiştir tilakoit membranlarla apoprotein karıştırarak. Imkansız basit sulu çözeltiler içinde pigmentler ile suda çözünür apoprotein karıştırılmasıyla in vitro kompleks montajı yapar Chls ihmal edilebilir suda çözünürlüğü ile in vitro olarak toplanması meydan, ama Bu yöntem, Thylakoid&#39;in nativ Chls mevcut sınırlıdır. Schmidt ve ark. rekombinant olarak E. bir histidin-etiketli proteini ifade ederek karnıbahar (CaWSCP) den WSCP ile birkaç Chl ve BChl türevleri montaj bildirildi E. coli, bir Ni-afinite sütunu üzerine hareketsiz ve deterjanlar 11 içinde çözünür Chl türevleri sokulması. Başarıyla A. Rekombinant WSCPs yeniden oluşturulması thaliana 6, ve Brüksel lahanası (BoWSCP), Japon turp (RshWSCP) birbenzer bir yöntemle D Virginia pepperweed (LvWSCP) bildirilmiştir. Burada, bir roman, proteinler etiketleme gerektirmez WSCP ile Chls montaj veya immobilize genel, basit bir yöntem mevcut. Mineral yağ içinde suda çözünür apoproteinlerden sulu çözeltilerden emülsiyonları hazırlamak dayanır. Proteinleri, hacim oranı 16 su-içinde-yağ (o / w), çok yüksek bir yüzey ile mikro damlacıklar içinde kapsüllenir. hidrofobik kofaktör daha sonra yağ içinde eritilir ve hali hazırda yağ fazından damlacıklar halinde yerleştirilir. Biz rekombinant olarak E. ifade WSCP apoproteinlerden çeşitli türevleri montajı için yöntem kullanılarak rapor Chl bir ile E. coli. Bu yeni Chl bağlayıcı proteinler geliştirmek için bir eleme sistemi olarak kullanılabilir WSCP-aşırı ifade eden bakteriler, ham lizat düzeneğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.</td></tr><tr><td>His Trap HF column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Chromatography medium for chlorophyll purification</td></tr></tbody></table>

water in oil emulsions: a new system for assembling water-soluble chlorophyll-binding proteins with hydrophobic pigments

Klorofil (Chls) ve bacteriochlorophylls (BChls) fotosentez ışık hasat ve elektron taşıma yürütmek birincil kofaktörleridir. Onların işlevselliği eleştirel büyük ve ayrıntılı birden fazla alt transmembran protein komplekslerinin içinde kendi özel organizasyon bağlıdır. Bu kompleksler güneş enerjisi dönüşüm nasıl kolaylaştıracağını moleküler düzeyde anlamak için, protein-pigment ve pigment pigment etkileşimleri ve heyecanlı dinamikleri üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Bu bulgu elde etmenin bir yolu oluşturmak ve basit suda çözünür rekombinant proteinlerle Chls komplekslerini inceleyerek gereğidir. Bununla birlikte, suda çözünür protein halinde lipofilik Chls ve BChls içeren zordur. Ayrıca, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler montajı için kullanılabilir genel bir yöntem vardır. Burada, eşek sağlayan su içinde yağ emülsiyonları dayalı basit ve yüksek verimli sistemi göstermektedirhidrofobik Chls suda çözünür proteinlerin embly. Yeni yöntem Chl, bir ile Brassicaceae bitki (WSCP) suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinin rekombinan versiyonları monte ile doğrulandı. Biz Chl başarılı derleme E. ifade WSCP bir kullanarak ham lizatları göstermek suda çözülebilen yeni bir Chl bağlayıcı proteinler için genetik ekran sistemi geliştirmek için kullanılabilir ve Chl-protein etkileşimleri ve montaj işlemlerinin çalışmalar için edilebilir coli hücre.

Rekombinant WSCP apoproteinler önceki bölümde tarif edilen protokole göre W / O emülsiyonları Chl A ile birleştirildi. Protokol saf WSCPs veya lizatları E. coli hücreleri WSCP aşırı eksprese eden (Şekil 1) ya da ihtiva eden sulu fazlar kullanılarak uygulanmıştır. protokol hızlı, basit ve bir doku homojenleştirici dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu, ilgil...

Watch this Scientific Journal Video about Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments at JoVE.com

Yağ İçinde Su Emülsiyonları: Suda Çözünür Klorofil Bağlayıcı Proteinlerin Hidrofobik Pigmentlerle Birleştirilmesine Yönelik Yeni Bir Sistem | Kimya | Video

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında ​​yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Chemistry

Cellular Processes

Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

14.5K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science.  Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında ​​yöntemin etkinliğini gösteren E. coli. 

Video: Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

A 'Plug and Play' Method to Create Water-dispersible Nanoassemblies Containing an Amphiphilic Polymer, Organic Dyes and Upconverting Nanoparticles

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate amphiphilic polymers in situ, and describe a protocol to encapsulate the prepared UCNPs and different organic dye molecules (porphyrins and diarylethenes) using polymer shells to form stable water-dispersible nanoassemblies. The nanoassembly samples containing both the UCNPs and the diarylethene organic dyes have interesting photochemical and photophysical properties. Upon 365 nm UV irradiation, the diarylethene group undergoes a visual color change. When the samples are irradiated with visible light of another specific wavelength, the color fades and the samples return to the initial colorless state. The samples also emit visible light from the UCNPs upon irradiation with 980 nm near-infrared light. The emission intensity of the samples can be tuned through alternate irradiation with UV and visible light. Modulation of fluorescence can be performed for many cycles without observable degradation of the samples. This versatile encapsulation procedure allows for the transfer of hydrophobic molecules and nanoparticles from an organic solvent to an aqueous medium. The polymer helps to maintain a lipid-like microenvironment for the organic molecules to aid in preservation of their photochemical behavior in water. Thus this method is ideal to prepare water-dispersible photoresponsive systems. The use of near-infrared light to activate upconverting nanoparticles allows for lower energy light to be used to activate photoreactions instead of more harmful ultraviolet light.

Organic dye molecules and oleic acid coated upconverting nanoparticles are not water-soluble. This protocol describes a &#8216;plug and play&#8217; method that enables the transfer of organic dye molecules and upconverting particles from their initial hydrophobic solvent to water.

A &#39;Tak ve&#39; Yöntem, bir Amfifilik Polimer, Organik maddeler ve upconverting Nanopartiküller İçeren Su dağılabilir Nanoassemblies oluşturma

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate ...

Kimya

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biyokimya

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Biyomühendislik

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic properties allow them to dissolve hydrophobic compounds in the aqueous environment of the human body. However, self-assembling peptide solutions have poor blood compatibility (e.g., low osmolarity), hindering their clinical application through intravenous administrations. We have recently developed a generalized platform for hydrophobic drug delivery, which combines SAPs with amino acid solutions (SAP-AA) to enhance drug solubility and increase formulation osmolarity to reach the requirements for clinical uses. This formulation strategy was thoroughly tested in the context of three structurally different hydrophobic compounds &#8211; PP2, rottlerin, and curcumin &#8211; in order to demonstrate its versatility. Furthermore, we examined effects of changing formulation components by analyzing 6 different SAPs, 20 naturally existing amino acids at low and high concentrations, and two different co-solvents dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethanol. Our strategy proved to be effective in optimizing components for a given hydrophobic drug, and therapeutic function of the formulated inhibitor, PP2, was observed both in vitro and in vivo. This manuscript outlines our generalized formulation method using SAP-AA combinations for hydrophobic compounds, and analysis of solubility as a first step towards potential use of these formulations in more functional studies. We include representative solubility results for formulation of the hydrophobic compound, curcumin, and discuss how our methodology serves as a platform for future biological studies and disease models.

This protocol describes a clinically-applicable means of dissolving hydrophobic compounds in an aqueous environment using combinations of self-assembling peptide and amino acid solutions. Our method resolves a major limitation of hydrophobic therapeutics, which lack safe, efficient means of solubility and delivery methods into clinical settings.

Çözünürlük sulu çözüm peptid ve Amino asit kendi kendine montaj bileşimlerini kullanarak hidrofobik bileşiklerin

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Tıp

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

A 'Tak ve' Yöntem, bir Amfifilik Polimer, Organik maddeler ve upconverting Nanopartiküller İçeren Su dağılabilir Nanoassemblies oluşturma