Name: analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level at JoVE.com

This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Bireysel reaktifler nasıl hazırlanacağını ilgili ayrıntılar için Reaktifler bölümüne bakın. 1. Etiketleme L1 Probları NOT: Sondalar kimyasal veya PCR etiketleme etiketli olabilir. <ol><li> kimyasal etiketleme <ol><li> etidyum bromür (0.5 ug / ml) ekleyin, sonra eriyene kadar, bir mikrodalga Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu, ısı 0.7-1% agaroz jeli yapmak jeli soğumasına izin verin ve. Jel tepsiye dökülür tarak ekleyin ve jel, oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de CY3 ya FITC ile sneo probu (1-2 ug) etiketleyin. Not: sneo S retrotransposition tam bir döngüsünden sonra ifade Neo Vankomisine geni pliced ​​gösterir. prob boyutu ~ 1000 bp. Sneo PCR herhangi bir vektöre veya genom büyütülmüş edilebiliric DNA. Streptavidin-CY3 / FITC etiketleme reaktif hakkında bilgi almak için Malzemeler ve Reaktifler Tablo bakınız. </li><li> her kuyuya 1x DNA yükleme tamponu, yük ile etiketlenmiş sneo prob çözüm karıştırın ve 15-20 dakika boyunca 75-100 voltta çalışır. </li><li> Ultra-Violet (UV) Aydınlatıcı kullanarak prob bandı gözünüzde canlandırın. Sneo prob boyutu ayarlanabilir olduğu ve Kilit çekirdekler asit (LNA) de (Şekil 2) eklenebilir kullanılabileceğine dikkat ediniz. </li><li> Kesme çözündürülmesi ve imalatçının protokolüne göre, bir PCR Temizleme kiti kullanılarak jelden sneo prob saflaştırılması, temiz bir bıçak ile jelden sneo etiketlenmiş prob. DİKKAT: Kapak koruma kalkanları (yani, laboratuvar mont ve UV şeffaf yüz maskesi) ile vücudun her maruz parçası görüntüleme ve jel keserken. PCR ürünleri arındırmak jel bilgi için Malzeme Tablosu ve Reaktifler bakın. </li><li> Yeniden çalışma sneo 5 ul% 0.7 agaroz jeli üzerinde un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob con (1.1.1 bakınız)firma büyüklüğü artışı ve sinyal yoğunluğu kaybı (Şekil 2). </li><li> Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm&#39;de absorbans ölçümü ile etiketlenmiş sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları -20 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol></li><li> PCR Etiketleme (prob etiketleme için alternatif yöntem) <ol><li> Sneo spesifik primerler birleştirin (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;ve 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;), tek bir tüp içine PCR ile: 13.6 ul nükleaz bilgilerini H2O; 0.1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0.05 ul dTTP (10 nM); 0.05 ul dUTP-biyotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul tampon 5x Tag git; 0.4 ul Etiket Polymerase git; 1 ul sneo şablonu (10 ng). PCR ile ilgili bilgi için Malzeme ve Reaktifler Tablo bakınız. </li><li> Numunelerin toplam sayısı ile çarpılarak her reaktif maddenin miktarını ayarlayın. </li><li> Aşağıdaki PCR bisiklet parametresini kullanıns amplifiye ve etiket sneo Probes: 2 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye, 30 saniye için 62 ° C, 60 sn için 72 ° C, 95 ° C 35 döngü; 2 dakika 72 ° C; belirsiz bir süre 4 ° C&#39;de tutun. Not: bağlanma sıcaklığı ayarlanabilir veya degrade PCR diğer problar için en uygun tavlama belirlemek için tamamlanabilir. </li><li> bölüm 1.1.1, yük gibi 0,7-1% jel yapmak ve bölüm 1.1.4 gibi sonda bandı görselleştirmek. </li><li> Kes ve bölüm 1.1.5 gibi etiketlenmiş sneo probu arındırmak. </li><li> Yeniden çalışma sneo 5 ul (bakınız Şekil 2) boyut artışı ve sinyal yoğunluğu kaybını doğrulamak için un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob. </li><li> Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm&#39;de absorbans ölçebilecek etiketli sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları </li></ol></li></ol> 2. Hazırlama Kromozom Farkları <ol><li> vektör omurgası ifade stabil klonlar oluşturmak (controStandart bir seçim yöntemleri kullanılarak L) veya retrotransposition yetkin L1. epizomal olmayan muhabir transkripsiyon çalışmaları ile bağlantısının kullanıldı birlikte 12,16, epizomal vektörleri de kullanılabilir. Stabil kontrol veya L1 vektör tam büyüme ortamı (gerektiği gibi yapılmış plaka boyutu ayarlamaları ile 10 cm plaka başına 1 x 10 6 hücre) ifade eden hücreleri büyür. HepG2 hücreleri, RPMI-1600,% 10 FBS ve higromisin 200 ug / ml,. 37 ° C&#39;de% 70 ortak akışa kadar büyümeye ve kültürler% 5 CO2. Not: büyüme ortamının seçimi, hücre tipine bağlıdır. Burada kullanılan plazmidler higromisin ve neomisin hem seçim kaseti taşıyan göz önüne alındığında, klonların stabil bir seçim higromisin seçimi neomisin ile yapılabilir, ancak neomisin miktarı, her hücre türü için tolerans seviyelerinin tutturulması için optimize edilmesi gerekmektedir. </li><li> Kültür ortamına colcemid (0.4 ug / ml) ilave edin ve 90 dakika metaph hücreleri yakalamak için inkübease. Farklı hücre tipleri kullanıldığında, deneysel olarak uygun metafaz tutuklama colcemid ve maruz kalma süresi (60, 90 ve 120 dakika) optimal konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Yıkama hücreleri, hücreler 3-5 mL% 0.25 tripsin solüsyonu eklenip hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübe 1X Dulbecco PBS (DPBS), tripsinize 10 ml 2x. % 10 FBS ihtiva eden ortamın eşit miktarda tripsin inaktive. </li><li> , 4 ° C&#39;de 1000 x g&#39;de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj hücre topağından orta aspire ve DPBS ile yıkama hücreleri. hücrelerin yeniden askıya DPBS 200 ul bırakarak aspire tüm DPBS. Sağlamak hücreler iyice karıştırılır ve kümeleri dağılmış olduğu. mix ve kümeleri dağıtmak ve vorteks önlemek için titrek ve nazik pipetleme kullanın. </li><li> Hipotonik çözelti 5 ml (yani, 75 mM KCI) yatay olarak 15 ml tüp dönerken 37 ° C&#39;de damla damla önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Malzeme ve Reagen Tablosu görünelde edilir ve hipotonik bir çözüm nasıl yapılacağı hakkında bilgi almak için ts. </li><li> Her yıkamadan sonra hücrelerin yeniden askıya hipotonik solüsyon yaklaşık 200 ul bırakarak 2.5 3x - 5 4 ° C&#39;de dakika ve yineleme için 120 xg&#39;de Santrifüj hücreleri 2.4 adımları. 3 yıkar sonunda, pelet gözle görülür beyaz ve şişmiş olduğundan emin olun. </li><li> Carnoy Sabitleme çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya artı 1: Carnoy Sabitleme çözeltisi içinde 8, 1:16 seyreltme: 2, 1: 4, 1. üzerinde yaklaşık 1 cm bir kuru, temiz slayt üzerine her seyreltme 10 ul damla ve hemen 30 saniye süreyle kaynar su sıcak buhara yayılmış serbest tarafını ortaya çıkarmak. Carnoy Sabitleme çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız. </li><li> 0.1 ug / ile, oda sıcaklığında, leke yayılır Kuru mi Hoechst-33342 Coplin kavanoza 15-20 dakika boyunca daldırma ile ve yıkama DPBS ile 3 kez. Hoechst-33342 çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız. </li> &lt;li&gt; Görünüm 40X büyütmede floresan / faz-kontrast mikroskop yayılır. Yayılma hazırlık optimize sonra, formalar Hoechst-33342 ile boyanmış olması gerekmez. Görünüm Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi yayılmış kalite ve ayırma belirlemek için 10X büyütmede faz-kontrast mikroskop yayılır (Şekil 3). </li><li> Seçip sürgünün karşı tarafında bir elmas noktası Marker iyi yayılır daire (örneğin, yayılabilir içermeyen tarafı). </li><li> Mağaza bir aya kadar -20 ° C&#39;de yayılır. neme maruz kalmaktan kaçının. </li></ol> Yerinde Hibridizasyon 3. Floresan (FISH) <ol><li> Yayılır, stabilize edici ve dehidre Not: -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde dengeye metafaz kromozom, oda sıcaklığına kadar yayılır. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız. <ol><li> Inkübe metafaz kromozom 200 ul RNaz A ile yayılır37 ° C&#39;de 1 saat. </li><li> Yıkama her biri 10 mm HCI çözeltisi ile durulama, ardından 5 dakika boyunca iki kez 2 x SSC tamponu-slaytlar. </li><li> Deiyonize H2O ile yıkayın ve her biri 5 dakika için 2X-SSC tamponu ile iki kez yıkanır, 37 ° C&#39;de 10 dakika süre ile% 1 pepsin ile yayılır inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile yayılır inkübe ve her biri 5 dakika iki kez 2 x SSC tamponu içinde yıkayın. </li><li> % 70,% 80 ve% 95 etanol: etanol seri 2 dakika süreyle inkübe edilerek yayılır dihidrat. </li><li> Hava kuru slaytlar. </li></ol></li><li> Melezleme L1 -etiketli retrotransposition probları ile yayılır (yani, sneo) DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız. <ol><li> 10 dakika süre ile 72 ° C&#39;de hibridizasyon tamponuna sneo 30 ng, ısıtılır ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca soğutulur. </li><li> e sneo prob çözeltisi 30 ul ekleach yaymak, lamel ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kenarları mühür. hiçbir kabarcık oluşumunu sağlamak. </li><li> yavaş yavaş 37 ° C&#39;ye kadar sıcaklık düşüşü ve 37 ° C de karanlık bir nemlendirilmiş oda içinde bir gece boyunca inkübe bir sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 72 ° C&#39;de slayt ısıtın. </li></ol></li><li> Yıkama ve Görüntüleme (veya İkincil Antikor ilavesi) DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun. NOT: Malzeme ve nasıl hazırlanacağı konusunda bilgi almak için Reaktifler Tablo bakınız. tüm kromozom yayılmasını karşılamak için yeterli hacimde kullanılması tavsiye edilir. lamel eklendiğinde fazla hacim kaybolur unutmayın. <ol><li> lamelleri kaldırmak için 2x SSC tamponu slaytlar daldırın. </li><li> 5 dakika boyunca 45 ° C&#39;de 2x SSC tamponu-batırılarak slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika sonra 2x 45 ° C&#39;de yıkama tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 45 ° C&#39;de 0.1X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın. </li><li>10 dakika boyunca 45 ° C &#39;de 2X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın. Not: Talep bir su banyosu içinde önerilen tamponu ihtiva eden bir Coplin Kavanoz, 45 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlanır. </li><li> Soğuk oda sıcaklığına kadar slaytlar ve algılama tampon slaytlar dengeye. </li><li> direkt etiketli problar için, 3.4.10 adıma geçin. </li><li> Dolaylı etiketli problar için, 20-30 dakika süreyle ve tampon engelleme blok DPBS 3x yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca (blokaj tamponu örneğin, 5 ug / ml streptavidin-FITC veya αCY3) ikincil antikor, 50 ul inkübe edin. </li><li> iki kez 5 dakika süreyle 2x SSC slaytlar yıkayın. </li><li> 10 dakika süre ile Hoechst-33342 solüsyonuna (0.1 ug / ml) ile karşıt. NOT: Bu boyama prob ile eş-lokalizasyonu için kromozom leke yapılır. </li><li> , Montaj orta bir damla ekleyin, DPBS 3x yıkayın lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür. </li><li> 40X ma floresan mikroskop kullanılarak L1 retrotransposition analizgnification. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li><li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition.">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li><li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+LINE-1+reverse+transcriptase:effect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain.">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li><li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition.">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li><li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition.">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li><li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1.">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li><li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells.">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li><li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA.">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li><li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro.">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li><li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome.">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome.">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li><li>Bojang, P., Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1.">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li><li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate.">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li><li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses.">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li><li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells.">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li><li>Bojang, P., Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13.">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li><li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes.">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li><li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved.">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li><li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators.">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li><li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe.">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li><li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin.">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li><li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize.">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li><li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine.">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li><li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells.">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li><li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma.">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li></ol>

Yazarlar potansiyel rakip çıkarları beyan ederim.

Böyle tüm genom dizileme, ters PCR ve güney blot olarak metodolojileri L1 retrotransposition incelemek için istihdam edilmiştir. Bu metodolojiler L1 eklemeleri genomları içinde meydana nerede yerini son derece değerli olmasına rağmen, hepsi için bir karıştırıcı zorluk dizileri yeniden birleştirmek için-siliko programlama için ihtiyaçtır. Burada açıklanan BALIK yöntemi, özellikle kültür hücrelerinde ektopik L1 retrotransposition analizleri gerektiren çalı?...

İnsan Uzun Interspersed Nükleer Element-1 (Hat-1 veya L1) retrotransposition mekanizmasını bir geçiş genomu içinde yayılır &quot;kopya ve yapıştır&quot; özerk mobil unsurdur. Tipik bir insan L1 ~ 6 kb uzunluğundadır ve bir promoter olarak hizmet veren bir 5&#39;UTR (çevrilmemiş bölgesinin) oluşur, iki açık okuma çerçevesi (ORF): L1 -ORF1 L1 -ORF2 ve polyA bir 3&#39;UTR . bobin bobin alanı, bir RNA tanıma motif ve C-terminal sahası, L1 -ORF2 proteini endonükleaz sahipken, transkriptaz ve sistin zengin alanları 1,2,3,4,5 tersine: yükleme L1 -ORF1 proteini üç farklı etki vardır. L1 -ORF2 retrotransposition 1,2,6 için gerekli iki proteinler ile, enzimatik aktiviteleri sağladığına; L1 -ORF1, nükleik asit şaperon aktivitelerini sergiler. L1 retrotransposition bir döngü L1 5&#39;UTR transkripsiyon ile başlar </em&gt; RNA polimeraz II, translokasyon sitoplazmaya ve çeviri tarafından bicistronic mRNA. Sitoplazma L1 -ORF1 sergiler, ya diğer RNA paketleri kendi RNA paketleri sis bağlayıcı eksojen veya trans bağlayıcı eksojen (örneğin, sinüs / SVAS / sözde genlerin) L1 -ORF2p 7 olan bir ribonükleoprotein parçacık (RNP) oluşturmak için, 8. Bu ana ters transkriptaz tarafından kullanılan da gruptur, 9 ve 3 &#39;ucundan DNA sentez RNA ters - RNP L1 -ORF2p çentik genomik DNA (gDNA) arasında endonükleaz aktivitesi, OH ortaya çıkarmak için çekirdek içine. Ters sentezi sırasında, DNA&#39;nın ikinci şerit imzası L1 ekleme dizileri (örneğin, TTTTAA) olarak adlandırılan hedef site duplikasyonları (TSD) 9,10 oluşturmak için doldurulur sendeleyerek kesmeleri oluşturmak için orijinal nick sitesinden 7-20 bp nicked edilir. Bu işlem, hedef ana ters transkripsiyon (TPRT) olarak bilinir ve inserti neden olduğueklenen dizinin her iki ucunda TSDs L1 / diğer DNA&#39;lar tam ya da tepe bölümü kesik kopya ile. L1 retrotransposition aracılığıyla da aracılık ettiği gösterilmiştir homolog olmayan uç birleştirme bazı hücre tiplerinde 11 TPRT benzeri. Çalışmalarımızda kullanılan L1 retrotransposition vektör epizomal olmayan ve etiketli L1 -ORF1 ve 2p Birleştirilen CMV L1-5&#39;UTR promoterler tarafından tahrik (şekil 1) 12 oluşur. Bu yapının önceki versiyonları maya ve insan hücre kültürleri 13,14,15 kullanıldığı çalışmalarda tarif edilmiştir. 3 &#39;ucu yapıştırma ve entegrasyon sonrasında neomisin ekspresyonunu tahrik etmek için ters yönde yerleştirilmiş olan 5&#39; ve 3 &#39;yer alan iki ayrı CMV promoterler, vektörün sona erer. 3 &#39;ucunda retrotransposition göstergesi kaseti L1 -ORFs bir neomisin geni yerleştirilmiş antisens oluşur ve topak iki parçaya ayrılması ile aktif olmayan haleeklenmiş verici (SD) ve eklenmiş alıcı (SA) siteleri (Şekil 1) introna, uygun olarak. Bir kromozom içine entegrasyon üzerine, L1 bir bicistronic mRNA ve inaktif neomisin mRNA oluşan bir mRNA üretmek için ortak promotör transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron tamamen işlevsel bir neomisin geni geri neomisin genin dışında birleştirilir. Hibrid mRNA cis bir RNP içine paketlenmiş ve TPRT kullanılarak tam uzunluklu ya da kesilmiş ya da sokulmasını genomuna entegre edilir çekirdeğe transloke edilmiştir. Burada tek çekirdek düzeyinde L1 -retrotransposiition desen ve yerleştirme oranlarını izlemek için özel olarak eklenmiş neomisin geni (sneo) yönelik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanan bir metodoloji tarif eder. verimlilik ve algılama özgüllüğü det yetkili retrotransposition ve beceriksiz yapıları ve problar kullanılarak teyit edildiEKT sneo veya intron kavşağı 16 globin neomisin ve. Bu metodoloji, çoklu eklemeler, koloni direnci ve olumlu klon genişleme olarak hücre kültürü temelli retrotransposition deneyleri, eksikliklerin bazıları oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Labeling Probes&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x colorless buffer</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2&amp;nbsp;mM and dTTP to 1.5&amp;nbsp;mM in nuclease free water.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotin (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&amp;nbsp;mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labeling Kit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td></td><td></td><td>Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Preparing chromosome Spreads&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Dilute 1&amp;nbsp;M KCl solution to 75&amp;nbsp;mM solution to make Hypotonic Solution</td></tr><tr><td>Carnoy Fixative Solution</td><td></td><td></td><td>Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Diamond Point Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>R001100</td><td>To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.</td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.</td></tr><tr><td>Beaker (600&amp;nbsp;ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.</td></tr><tr><td>Nikon Microscope</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Any microscope can be used to look at spread quality.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Materials for FISH&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Rubber Cement/Cytobond Sealant&amp;nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Dark Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Cover slides</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Dry Digital Heat Block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Combine 175 g of NaCl, and 88.2&amp;nbsp;g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 &amp;micro;m Filter paper. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mg/ml of Rnase A</td><td></td><td></td><td>Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1&amp;nbsp;mg/ml. Make fresh solution every time.</td></tr><tr><td>1% Pepsin</td><td></td><td></td><td>Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60&amp;nbsp;&amp;deg;C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100&amp;nbsp;ml, filter through 0.22 &amp;micro;m Filter paper and store 5 ml aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Thaw aliquot of PFA at 37 &amp;deg;C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.</td></tr><tr><td>Detection Buffer</td><td></td><td></td><td>Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.</td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td></td><td></td><td>Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.</td></tr><tr><td>Dehydrating Solution</td><td></td><td></td><td>Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.</td></tr></tbody></table>

analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

L1 retrotransposition vektörünün şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 &#39;de sunulmuştur. Vektörü sens yönlenmede bir globin intronu ile kesilmiş ve SD ve SA siteleri tarafından sandviç L1 ORF antisens yönlenmede bir neomisin geni içerir. Kararlı biçimde bir kromozomda entegre olduğunda, L1 mRNA Birleştirilen CMV ve L1-5&#39;UTR promotörünün (Şekil 1) transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin int...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level at JoVE.com

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır.

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Görüntüleme.  University of Arizona College of Medicine.  Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır. 

Video: Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Genetik

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Gelişim Biyolojisi

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so by a process called retrotransposition wherein they transcribe to form an mRNA intermediate which is then consequently inserted into the genome by reverse transcription. Despite being silent in normal cells, LINE-1s are highly active in different epithelial tumors. De novo LINE-1 insertions can potentially drive tumorigenesis, and hence it is important to systematically study LINE-1 retrotransposition in cancer. Out of ~150 retrotransposition-competent LINE-1s present in the human genome, only a handful of LINE-1 loci, also referred to as &#34;hot&#34; LINE-1s, account for the majority of de novo LINE-1 insertion in different cancer types. We have developed a simple polymerase chain reaction (PCR)-based method to monitor retrotransposition activity of these hot LINE-1s. This method, based on long-distance inverse (LDI)-PCR, takes advantage of 3&#180; transduction, a mechanism by which a LINE-1 mobilizes its flanking non-repetitive region, which can subsequently be used to identify de novo LINE-1 3&#180; transduction events stemming from a particular hot LINE-1.

This article outlines a simple PCR-based assay to monitor the activity of an active LINE-1 retrotransposon and to map de novo retrotranspositions in a given genome. Using the MCF7 cell line, we demonstrate herein how this method can be applied to detect activity of a LINE-1 located at 22q12.1.

Uzun mesafe ters PCR tarafından sıcak hat-1s Retrotransposition aktivitesinin tespiti

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Kanser Araştırmaları

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and mutagenesis. Understanding the expression patterns of L1 loci at the individual level will lend to the understanding of the biology of this mutagenic element. This autonomous element makes up a significant portion of the human genome with over 500,000 copies, though 99% are truncated and defective. However, their abundance and dominant number of defective copies make it challenging to identify authentically expressed L1s from L1-related sequences expressed as part of other genes. It is also challenging to identify which specific L1 locus is expressed due to the repetitive nature of the elements. Overcoming these challenges, we present an RNA-Seq bioinformatic approach to identify L1 expression at the locus specific level. In summary, we collect cytoplasmic RNA, select for polyadenylated transcripts, and utilize strand-specific RNA-Seq analyses to uniquely map reads to L1 loci in the human reference genome. We visually curate each L1 locus with uniquely mapped reads to confirm transcription from its own promoter and adjust mapped transcript reads to account for mappability of each individual L1 locus. This approach was applied to a prostate tumor cell line, DU145, to demonstrate the ability of this protocol to detect expression from a small number of the full-length L1 elements.

Here, we present a bioinformatic approach and analyses to identify LINE-1 expression at the locus specific level.

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA Replikasyonu ve Çatal Durma Olaylarını Analiz Etmek için 2D Jel Elektroforezi

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Replikasyon Çatalı Durma ve Genişleme Mekanizmalarını Ortaya Çıkarmak için Patojenik Tekrarların DNA Replikasyonunu Karakterize Etme

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Tek Hücre Çözünürlüğünde Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Epigenom ve Gen İfadesi Profili Oluşturma için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Uzun mesafe ters PCR tarafından sıcak hat-1s Retrotransposition aktivitesinin tespiti

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu