Bu protokol, NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının sınırsız biçimde başarılı bir yapı belirlemesini kolaylaştırmaktadır. Ve üretim ve kristalizasyon detayları. Protokol, kristalizasyon ve yapı tayinini kolaylaştıran bobin bağlatan adaptörler aracılığıyla NEMO'nun IKK bağlayıcı etki alanı parçasının yerli teyidinin bu stabilizasyonundan yararlanır.
Nemo yapısal biyoloji, bir hedef olarak, inflamatuar ve otoimmün hastalıklar ve kanser tedavisinde NEMO inhibitörleri gelişiminde önemli bir avantaj sağlar. Bu protokol, ilaç keşfi veya optimizasyonu için peptit veya küçük molekül inhibitörleri ile NEMO komplekslerinin yapı tayini için uzatılabilir. Protein refolding ve konsantrasyon, protein üretim aşamasında, saf bir NEMO dimer elde etmek için temel vardır.
Kristalizasyon koşullarında agregasyonu sınırlandırma ve çözünürlüğü sağlamak. Prosedürleri gösteren Tamar ve Amy, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencileri olacaktır. Müthiş et çözeltisi 20 mililitre ekleyerek başlayın.
Ve mililitre likit çözelti başına 100 miligram lık 20 mikrolitre ampisilin. 125 mililitrelik Erlenmeyer şişesine. Hücre gliserol stok birkaç mikrolitre takip, 80 santigrat depolama, BL21DE3 yetkili hücrelerin.
Vektörle dönüştürülmüştür. Başlangıç kültürü bir gecede sallayarak sonra, dakikada 37 derece santigrat ve 220 rotasyonlar, müthiş suyu 0.1 ve 250 mililitre bir OD600 hücreleri seyreltmek. Ve mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona ampisilin ekleyin.
Kültürün OD600 0,8-1 ulaştığında, 500 mikromolar konsantrasyonuna, kültüre IPTG ekleyin. Ve hücreleri 4 saat boyunca, 37 derecede, OD600 6-10 dereceye ulaşana kadar büyütün. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri tortu.
Ve 40 mililitre likis tamponu yla peleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri 20 ila 25 mililitrelik iki ye bölün. Ve bir Fransız basını kullanarak hücrelere yaklaşık 25,000 pound'luk basınç uygulayın, soğuk bir odada aliquot başına 2-3 kez.
Daha sonra, hücre lysates için üre ekleyin, sekiz azı dakikası son konsantrasyonuna. Ve hücre çözeltisini oda sıcaklığında 2 ila 16 saat boyunca sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, lysates ultra-santrifüj tüpler, en az dörtte üçü tam, tüp başına aktarın.
Ve ulrta santrifüj, lysates için 45 dakika. Süpernatantları 50 mililitrelik konik bir tüpe dönüştürün. Ve üre inkübe süpernatantını dakikada üç mililitre lik bir IMAC sütununa yükleyin.
Tüm supernatant sütun boyunca çalıştırdığında, dakikada üç mililitre de, bağlama arabellek ile 10 sütun birimleri için sütun yıkayın. VE 12 sütun luk hacim degradesi üzerinde, 10 ila 500 milimolar imidazol NEMO-EEAA proteingradient elution gerçekleştirin. Bir mililitre lik aliquot'u bir kesir toplama plakasına toplamak.
SDS sayfa analizinden sonra, saf hedef proteiniçeren fraksiyonları çekin ve standart protokole göre, Bradford tahlil ile protein konsantrasyonunu ölçmek. Protein içeren kaçan fraksiyonları seçin. HIS6 etiketini cleave ve örnekten fazla imidazol kaldırmak için, tev proteaz ekleyin, bir ila 10 ağırlık oranı, TEV cleaved protein, hedef protein örneğine.
Ve 20 milimolar Tris dört litre içinde bir gecede örnek dilate. 150 milimoler sodyum klorür ve iki milimolar DTT çözeltisi. Ertesi sabah, TEV cleaved NEMO-EEAA örneğini dakikada bir mililitre de ikinci bir IMAC sütununa yükleyin.
Bir mililitre kesirler üzerinden akış toplama, bir 96 kase fraksiyonu toplama plakası. 20 milimolar Tris, 150 milimolar sodyum klorür ve 10 milimolar imidazol çözeltisi beş cilt ile sütun yıkayın, dakikada bir mililitre. Son yıkamadan sonra, TEV ve amca 20 milimolar Tris, 150 milimolar sodyum klorür, 500 milimolar imidazol ve iki milimolar DTT çözeltisi üç sütun hacmi ile, 50 mililitrelik bir şişe içine HIS6 NEMO-EEAA, elat.
Yarık NEMO-EEAA yapısı içeren fraksiyonlar üzerinden akışı çekin ve beş mililitre, bir karıştırılmış hücre konsantratörü ile örnek konsantre. Gösterildiği gibi gece diyalizinden sonra, numunenin beş mililitresini 16 milimetre ile 60 santimetre büyüklüğünde dışlama kromatografi sonları üzerine yükleyin. Örnek hacmine göre gerektiği gibi tekrar.
Dakikada bir mililitre, ve iki milimolar Tris, 100 milimolar sodyum klorür ve iki milimolar DDT çözeltisi. Kesirleri çektikten sonra, dimerik NEMO-EEAA'ya karşılık gelen, numuneyi karıştırılan hücre konsantratöründe, moleküler ağırlığı üç kilodalton luk bir zardan 113 mikromolar nihai konsantrasyona yoğunlaştırın. Sonra, bir aya kadar, dört santigrat derecede depolama için protein aliquot.
Seyrek matris taraması için, iki damla oda kristalizasyon plakasının 96 kuyunun her birine 60 mikrolitre seyrek matris çözeltisi ekleyin. Oturup buhar difüzyonu için. Ve protein çözeltisini robotik bir damla ayarlayıcısına ekleyin.
Daha sonra, bir robot damla ayarlayıcı kullanın, mililitre başına 1,65 miligram protein çözeltisi 100 nanolitre dağıtmak için, damla bir rezervuar çözeltisi ile bire bir oranında, 200 nanolitre son hacmi. Ve 134 nanolitre rezervuar çözeltisi ile 66 nanolitre protein çözeltisi ekleyin, 200 nanolitrelik son bir hacim damla iki. Sonra, hemen üç inç genişliğinde sızdırmazlık bandı ile plaka mühür.
Daha sonra, 20 santigrat derece bir kristalizasyon görüntüleyici depolama tepsileri saklayın. Plakaların saklanmasından iki gün sonra başlayan kristallerin varlığı için otomatik olarak toplanan görüntüleri kontrol etmek. Tohum stok üretimi için, bir tohum üretim kiti, sağlanan şişe kristalizasyon durum çözümü 50 mikrolitre içine, ilgi kristalkristali içeren tüm damla aktarın.
Ve tohum stoku girdap, 20 saniye nabız ve 10 saniye dinlenme ile, üç dakika boyunca. Daha sonra, seri tohum stokseyreltmek, bir ila 10 artışlarla, aşağı bir 10, 000. Ve seyreltmeleri daha fazla kullanılana kadar, 4 santigrat derecede saklayın.
Synchrotron'a gönderilmeden 1-2 gün önce, çeyiyi tepeden, ilgi kristaliyle kes. Ve 0.5 mikrolitre kristalizasyon çözeltisi içeren ekleyin 12% bir, iki propan DiO kriyoprotektif, doğrudan kuyuya. Yavaşça bir kriyo döngü ile kristal yerinden.
Kristali kuyudan toplayın ve kriyo halkası içeren kristali sıvı nitrojene batırılmış bir diskte saklayın, ta ki X-ışını kırınımı için sevkiyat yapılana kadar. X-ışını kırınım verilerini aldıktan sonra, STAR ve ISO sunucusundaki ölçeklenmiş yoğunlukları işleyin. Bir X-ışını kristalografi indeksleme kullanarak veri için kırınım limit yüzeyi için 1,2 ortalama kesilmiş.
Ve Phoenix'e yüklenin. Yapıyı belirlemek için, Phoenix'teki MRage'i kullanarak GCN4'ün X-ışını yapısını moleküler değiştirme için bir arama modeli olarak kullanın. 4DMD yapısı, bir topluluk olarak tanımlanacaktır.
Ve MRage çözümü, NEMO-EEAA'nın son terminal sarmal bobin adaptörüne karşılık gelen yapı kısmına başarıyla inşa edilecektir. arama modeline, dimer her iki zincir için. Aşırı ifade protein bir bant görünür, yaklaşık 14 kilodalton molekül ağırlığı marker, ilk IMAC sütun saflaştırma önce.
Ve bir monomer bant ve bir dimer bant görüntüler, 14 ve 28 kilodaltons, sırasıyla, ilk elution sonra. TEV dekoltesi, elüsasyonu takiben, ikinci IMAC sütunu aracılığıyla neredeyse tamamlanır. Neredeyse tamamen bir dimer olarak, beklenen molekül ağırlığı.
Boyut dışlama kromatografisi, tek bir tepe görüntüler, arasında kaçan 60 için 65 mililitre, kim dimer yanıt veriyor. İnce tarama veri toplama için, NEMO-EEAA kristallerinin üretimi için bir tohum stok üretmek için kullanılabilir kristaller üretir. Burada temsilci NEMO-EEAA kristalleri kırınım profilleri gösterilmiştir.
NEMO-EEAA proteininin yapısal analizi, homodimerik düzensiz paralel sarmal bobin, yaklaşık 175 angstrom uzunluğunda ortaya koymaktadır. Normal bobin bölgesi, son terminusta ideal bobin bağlaç adaptör dizisini kapsar. Ve NEMO'nun ilk iki heptads'ı uygun bir dizilim.
Düzenli bir sarmal bobin, C terminus da mevcuttur. NEMO kalıntı 97'den başlayıp C terminalini kapsayan ideal sarmal bobin adaptörü. IKK beta ciltli yapısı, ligand karşılamak için, daha açık bir bobin onay görüntüler.
Bu bölgede 1-2 angstroms tarafından daha büyük bir interhelical boşluk ile. NEMO'da bir ligand yapısı, hesaplama yöntemleri ile inhibitörlerin tasarımı için yeni bir hedef sunuyor. Ve küçük molekül kütüphaneleri ile bağlayıcı ceplerin görsel tarama için.
Şimdi küçük molekül ligandlar ile karmaşık mühendislik NEMO yapıkristalizasyon için bir yol var. Yeni bir inhibitör sınıfının geliştirilmesine ve optimize edilmesine yardımcı olmak.
