Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından desteklenen HL56237, Diyabet, Sindirim Ulusal Enstitüsü ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü DK97391-03, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1227359 ve EPS-1003907) verir.

1. mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon <ol><li> Bir SU-8 50 Ana Kalıp Standart Fotolitografi İmalatı <ol><li> Spin-kaplama öncesi silikon gofret temizleyin. 15 dakika boyunca, izopropil alkol (IPA) ve ardından 15 dakika boyunca aseton ile çıplak 2 inç silikon gofret durulayın. 1 saat süre ile 150 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde yerleştirerek gofret kurutmak. Dehidrasyon sonra, oda sıcaklığında, gofret soğutulur. </li><li> Spin-kat SU-8 fotorezist ile silikon gofret. gofret üzerine 2 ml SU-8 ışığa ekleyin. 30 saniye için 300 dev / san hızlanma 1.000 rpm, ardından 10 saniye boyunca 100 rpm / saniye hızlanma 500 rpm e gofret rampası. (İlave video 1&#39;e bakınız) </li><li> Ön fırında 30 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 10 dakika, daha sonra yumuşak bir fırında 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret. </li><li> Spin-kaplı paslanmaz çeliğin bir filmin maskesi tasarlanmış desen dönüştürmek için UV ışınlarına maruz kalma kullanın. film maskesi gibi ince şeffaf film desen yazdırın. üstüne bir film maske yerleştirinışığa kaplı-spin ve 300 mJ / cm2 dozda UV maruz. (İlave video 2&#39;ye bakınız) Not: Bu protokol, mikrokanal ağı deseni (159 mikron genişliğinde anne kanalları dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına dallanma) CAD yazılımları ile tasarlanmıştır. Filmde desen net bir alan olarak gösterir ve filmin geri kalanı siyah mürekkep ile kaplıdır. SU-8 negatif fotorezist olduğundan, UV maruz fotorezist kısmı çapraz olacak ve kalıp geliştirme (adım 1.1.6) sırasında solvent çözünmez hale gelecektir. geliştikten sonra, bu çözülmeyen kısım tasarlanmış ağ deseni çoğaltılacak ve bir ana kalıp olarak hizmet vermektedir. </li><li> Mesaj fırında 1 dakika, 10 dakika boyunca, sonra 95 ° C, 65 ° C &#39;de sıcak bir plaka üzerinde ortaya gofret. </li><li> ana kalıp geliştirin. çözücü olarak kullanın SU-8 geliştirici un çapraz bağlı fotodirencin kaldırmak için. 3 dakika SU-8 geliştirici gofret daldırın ve IPA ile durulayın1 dakika karıştırıldı. </li><li> IPA durulama sonra hiçbir beyaz bir çizgi oluşumu (non-tedavi fotorezist kalıntısı) kalmayıncaya kadar bu gelişen döngüsü 2-3 kez tekrarlayın. Yavaşça nitrojen gazı ile gofret kurulayın ve mikroskop altında desen küçük özelliklerini incelemek. Gerekirse ek gelişmekte döngüleri tekrarlayın. </li><li> Sert 15 dakika boyunca 150 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde gofret fırında. </li></ol></li><li> yumuşak Litografi <ol><li> El ile bir ağırlık iki parça polidimetilsiloksan (PDMS) elastomer (taban ve sertleştirici) karıştırın. 10: 1 oranındadır. </li><li> Gazlardan, 15 dakika boyunca, bir ev tipi vakum ile bağlı bir desikatör PDMS karışımı ile gerçekleştirilmektedir. fotorezist ana kalıp üzerinde PDMS çözüm Cast. PDMS kalınlığı giriş / çıkış boru istikrarlı bir tutma sağlamak için fazla 3 mm olması gerekir. Gazlardan, 15 dakika boyunca daha PDMS ve gerekirse azot gazı ile kalan hava kabarcıklarını çıkarmak. 3 saat 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde döküm PDMS Cure. </li><li> yüzeyini temizleyinBir kapaklar ve plazma temizleyici (30 sn plazma tedavisi) ile cam lamel. 30 sn 500 devir / sn hızlanma hızında 4,000 rpm ramping cam lamel Spin-kat un tedavi PDMS (0.5 ml). En az 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde PDMS spin kaplı lamel Cure. </li><li> Kes ve ana kalıp tedavi PDMS serbest bırakın. Daha sonra bir giriş ve ana kanal uzak ucunda bir 1 mm çapındaki bir delik zımba ile bir çıkış oluşturur. </li><li> PDMS spin kaplı cam lamel cihazı Bond. PDMS yüzeyleri oksitlenmesi ve 1 dakika süre ile ve plazma ile lamel. oksijen plazma muamelesinden sonra, yapışma yüzeyi deiyonize su (Di su) bir damlacık yerleştirin ve iki parçayı yerleştirin. sürekli bir bağlantı sağlamak için 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde cihazı pişirin. </li></ol></li></ol><img alt="Ek Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Ek Video 1 (Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Ek Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Ek Video 2 (Sağ indirmek için tıklayın).</a> 2. Endotel Hücre Tohum ve Kültür <ol><li> Cihaz Sterilizasyon ve Fibronektin Kaplama <ol><li> oksidasyondan giriş / çıkış çevresinde en PDMS yüzeyinin hidrofobik özelliği korur. giriş etrafında PDMS yüzeyini kaplayan ve oksidasyonu önlemek için kapaklar küçük çizgili çıkış. Bu prosedür doldurma aşamasında (2.1.3) sırasında cihazın üst yüzeyi üzerinde her yayılmasını distile su önleyebilir. </li><li> oksijen plazma fo ile PDMS cihaz tedaviR5 dakika, böylece yüzeyi hidrofilik olacak şekilde değiştirin mikrokanal sıvı akışını kolaylaştırmak ve doldurma prosedürü (2.1.3) &#39;de bindirme kabarcık önler. </li><li> girişten DI suyla cihazı doldurmak için bağlı bir iğne veya bir pipet ile bir şırınga kullanabilirsiniz. çıkışında kartı DI su (30-50 ul), bir damla olana kadar doldurmaya devam edin. Mikrokanallı içinde sıkışıp kabarcıklar olup olmadığını kontrol etmek mikroskop altında cihazı inceleyin. Bir kağıt mendille giriş ve çıkışında aşırı su damlacığı çıkarın. </li><li> laminer biyo-güvenlik başlığı içinde, 3 saat içinde en az UV ile bir petri ürünü sterilize. , Buharlaşmayı önlemek PDMS ince bir parça ile giriş / çıkış karşılamak için çanak içinde ıslak kağıt mendil koymak ve Parafilm çanak sarın. </li><li> Coat fibronektin cihaz. (Buzdolabı / ml fibronektin gece boyunca 100 ug ile kat daha sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile ilk önce cihaz yıkayın4 ° C). girişinde bir çözelti damla yerleştirin ve daha sonra bir ev tipi vakum, bir iğne ya da bir pipet ile bir şırınga ile çıkışında negatif bir basınç oluşturur. </li><li> Hücre kültür ortamı cihazı doldurun. Hücre kültürü ortamını yüklemeden önce 3 kez elle PBS ile cihazı durulayın. 37 ° C&#39;de bir kuluçka cihazı ısıtın. </li></ol></li><li> EC Tohum ve Uzun Vadeli Perfüzyon Not: geleneksel statik 2D AK kültürü ile karşılaştırıldığında, sürekli perfüzyon ile in vitro mikrovasküler ağ modeli daha yakın in vivo koşullara hücre kültür ortamı yaptı. Bu protokolde ortaya konulabilir, in vitro mikro-damar ağı iki hafta kadar muhafaza edilebilir. iyi kontrol perfüzyon sürekli besin doldurmak atıkları kaldırmak ve aşırı izdiham AT tek tabaka önleyecektir. Bu nedenle, farklı physiologica altında cep ve hemodinamik ortamı taklit eden, daha uzun süreli çalışmalar uzatılabilirL ve patolojik durumlar. <ol><li> % 8 dekstran (ağırlıkça mol 70,000) ile HUVEC kültür ortamı birincil HUVECler (MCDB 131) karıştırın. dekstran ortam yükleme viskozitesini arttırır ve daha iyi bir hücre ekim sonucu elde etmek için kullanılır. Tavsiye hücre yoğunluğu yaklaşık 2-4 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. </li><li> cihazın içine hücreleri tohumu. giriş üzerinde bir hücre 10-20 ul damlacık yerleştirin. Her iki cihaz eğerek ya da kılcal eylem çıkışında bir cam Pasteur pipeti kullanarak yumuşak bir akış tanıtmak. Başarılı bir hücre yükleme için temel akış hızı küçük kanalları içinde en az 1 mm / sn kontrol etmektir. </li><li> hücre tohumlama kontrol edin. İlk tohumlama sonra, mikroskop altında tohumlama durumunu kontrol etmeden önce 15-20 dakika (37 ° C&#39;de% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosfer) Cihazı kuluçkaya yatmaktadır. Gerekirse arzu edilen bir hücre yoğunluğu elde etmek için ek hücre yükleme yapar. </li><li> Yavaşça (37 hücre kültür ortamı ile yıkayın cihazı° C) dekstran kaldırmak için. Kültür (37 ° C&#39;de% 5 CO2) bir kuluçka makinesi içinde, ilk 6 saat akış yokluğunda cihazı. </li><li> Uzun vadeli perfüzyon için boru bağlantısı kurmak. hareket etmesini önlemek için bir petri çanağı içine cihazı kaydet. giriş ve çıkış boru eklemeler için Petri kabı kapağına küçük delikler oluşturun. hücre kültür ortamı perfüzyon için bir iğne ile bir şırıngaya giriş boru bağlayın. Bir atık toplayıcıya çıkış tüpünü bağlayın. Not: Yer cihaz ve bir hücre kültürü inkübatör atık toplayıcısı, inkübatör dışında bir perfüzyon pompası yerleştirerek ve uzun giriş boru ile cihazla bağlayın. perfüzyon oranı deney tasarımı ile belirlenir. Bu cihazda, 0.35 ul / dk&#39;lık bir perfüzyon oranı ve 1-2 din / cm2 arasında bir kesme stresi aralığı kullanın. Bu perfüzyon koşul altında, HUVECler yaklaşık 3-4 gün içinde izdiham ulaşmak. </li></ol></li></ol> 3. Benmmunofluorescent Boyama <ol><li> 30, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında durulama 1x PBS ardından 4 ° C&#39;de dakikada, ve 30 dakika için bloke% 1 BSA,% 2 paraformaldehit perfüzyon cihazı ECS sabitleyin. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile antikor boyama için sabit ECS geçirgenliği. etikete 5-7 dakika süreyle Triton cihazı serpmek-VE kaderin ve etiket F-aktin 3 dk. </li><li> cihazın içine antikorlar yükleyin. Önceki çözümler yıkamak için 15 dakika süreyle 1x PBS ile cihazı serpmek. El ile 2 ug / ml (toplam hacim 20-50 ul) konsantrasyonda cihaza VE-cadherin (anti-keçi) karşı birincil antikor yükleyin. 4 ° C&#39;de bir buzdolabı içinde gece boyunca cihazı tutun. 45-60 dakika boyunca 7 ug / ml konsantrasyonunda da bir şırınga pompası ile ikincil antikoru (eşek anti-keçi) serpmek. </li><li> AK F-aktin Etiket Phalloidin ile. 1x PBS Besin cihazı serpmekEl 7-10 dakika boyunca Phalloidin (10 ug / ml) yüklemeden önce R15 Min. </li><li> Etiket AK çekirdekler (Malzeme Listesine bakınız). </li><li> 1X PBS ile durulayın cihaz ve görüntüleme kadar 4 ° C &#39;de muhafaza. </li></ol> Endotel 4. Floresans Görüntüleme [Ca2 +] i <ol><li> albümin ile cihaz (10 mg / ml), 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca -Ringer çözümünü serpmek. Bu hücre kültürü için kullanılan aynı perfüzyon hızı kullanın. Albümine Ringer çözeltisi tüm bileşenlerin konsantrasyonları Malzeme Listesi açıklanmaktadır. </li><li> EC [Ca 2 +] i fluo-4 AM görüntüleme için konfokal sistem kurmak. Ca 2+ görüntüleme için bir konfokal mikroskobik sistemi kullanın. uyarma için bir argon lazer (488 nm) kullanın ve 510-530 nm emisyon bandı ayarlayın. 512 x 512 tarama formatında: (0.95, suya daldırma NA) bir 25X amacı ile görüntüleri toplamak. her i yığınının 2 um z adım ve bir tarama aralığı kullanın20 saniye mages. </li><li> albümine Ringer solüsyonu ile lümen fluo-4 AM yıkamak, ardından 37 ° C&#39;de 40 dakika boyunca Fluo-4 AM (5 uM) ile cihaz serpmek. </li><li> fluo-4 yüklü mikrodamarlar görüntü kazanır. 10 dakika boyunca temel görüntü toplayın. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 20 dakika floresan yoğunluğu (FI) değişiklikleri kaydeder. </li></ol> Nitrik Oksit Üretim 5. Floresans Görüntüleme <ol><li> 15 dakika boyunca, albümin-Ringer çözeltisi cihazı serpmek. Hücre kültürü için kullanılan ile aynı olan bir perfüzyon oranı kullanın. </li><li> ATP kaynaklı nitrik oksit üretimini ölçmek için floresan görüntüleme sistemi kurmak. Bir 12-bit dijital CCD kamera ve nitrik oksit ölçümü için bilgisayar kontrollü bir çekim ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Işık kaynağı olarak 75 W bir ksenon lambasını kullanarak. Not: bir girişim filtresi (480/40) ve dikroik ayna DAF-2 DA için uyarılma ve emisyon dalga boyu seçinbir band geçiren bariyer ile (505 nm) (535/50 nm). görüntüleri toplamak için: 20X objektif lens (0.75 NA) kullanın. photobleaching en aza indirmek için, parazit filtrenin önüne bir nötral yoğunluk filtresi (0.5 N) pozisyonuna ve 0.12 sn pozlama süresini sınırlamak. </li><li> DAF-2 DA (5 mcM) hücreleri yükleyin. 37 ° C&#39;de yaklaşık 35-40 dakika boyunca DAF-2 DA cihazı serpmek. İlk yüklemeden sonra DAF-2 floresan yoğunluğu (FI DAF) ve temel kaydedin. Not: DAF-2 DA deney 7 boyunca perfüzat sürekli mevcuttur. </li><li> DAF-2 görüntüleri toplamak. 5 dakika boyunca FI DAF temel kaydedin. ATP (10 uM) ile cihaz serpmek ve 1 dakika aralıklar ile 30 dakika boyunca görsel imajı. Aynı odak düzlemi hücrelerin aynı grup tüm görüntüleri toplayın. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> Elle tek tek hücre düzeyinde toplanan görüntülerden çıkarları (ROI) bölgeyi seçin. HerYG floresan anahat gösterilebilir bir hücrenin teker teker alanı kaplamaktadır. </li><li> Arka plan floresan çıkarma ve her ROI ortalama FI hesaplayın. </li><li> EC ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek [Ca2 +] i ve NO üretimi. (FI 0 albümin-Ringer perfüzyon sırasında ortalama bazal FI ATP eklemeden önce olduğu FI / FI 0 * 100) Flu-4 FI değişiklikleri hesaplayarak EC [Ca 2 +] i ATP kaynaklı değişiklikleri ölçmek eksi ölçülür arka plan. Zamanla FI DAF ilk diferansiyel dönüşüm yaparak YOK üretim hızını ölçmek. Not: FI DAF zaman ders süresi ile kümülatif NO üretimini temsil eder. Bu nedenle, NO üretim hızı bazal ve ATP koşulları uyarılmış hem altında FI DAF profiline göre hesaplanır. Veri analizi ve deneysel prosedürler ayrıntıları daha önce yayın 7&#39;de tarif edilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+modulation+at+the+cell,+microvessel,+or+whole+organ+level:+towards+closing+gaps+in+our+knowledge.">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li><li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+permeability.">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li><li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+soft+lithography.">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li><li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response,+nitric+oxide+and+[Ca2+]I.">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797 (2015).</li><li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability.">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4,5-diaminofluorescein+diacetate.">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li><li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules.">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li><li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability.">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+[Ca2+]i+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules.">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li><li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-activating+factor+increases+endothelial+[Ca2+]+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels.">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability.">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+[Ca2+]i+and+venular+microvessel+permeability.">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li><li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules.">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li><li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6.">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li><li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li><li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated,+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+device.">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li><li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules.">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li><li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology.">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li><li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angioadaptation:+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape.">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li><li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery.">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li><li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+:+alters+endothelial+cell+responses.">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li><li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells.">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li><li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators:+diaminofluoresceins.">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir rakip çıkarları veya çakışan çıkarları var.

<html> Bu yazıda, kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı protokoller mevcut, AK kavşak ve F-aktin dağıtım hücre iskeleti karakterizasyonu ve AT&#39;nin kantitatif ölçümler [Ca2 +] i ve bir mikroakışkan cihaz kullanarak NO üretimi. Perfüze mikroakışkan cihaz in vivo mikrovasküler geometri ve kayma akış koşulları yakın simülasyon sağlayan bir in vitro model sağlar. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından ol...

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip 1,2 sergilemektedir. Mikroakiskan teknolojisi, istenen akış koşulları altında büyümek, özellikle damar EC&#39;ler için, kültürlenmiş hücreler için bir fırsat sağlar geometrik kısıtlı mikro (alt milimetre) kanallar 3 ile hassas bir şekilde kontrol sıvısı sağlar. Bu özellikler, geleneksel statik 2B hücre kültürlerinde daha etkin in vivo hücre kültürü koşulları daha yakın hale. Onlar mikroakışkan cihazlar vaskülatürlerden farklı modellemek için kullanılır ve mekanik ve / veya kimyasal uyarılara AT yanıtları incelemek için zaman son derece önemlidir. statik hücre kültürü, biyomedikal f adaptasyon ve Mikroakiskan uygulama üzerinde mikro ağı gösterdiği avantajlara rağmenield sınırlı kalır. Son gözden tarafından bildirilen bu alanda (% 85) yayınların çoğunluğu mühendislik dergilerinde 4 hala. mikroakışkan cihazların performansı çoğu biyolog gibi Transwell tahlil ve bu minyatürize cihaza makro ölçekli kültür çanak / cam slayt olarak mevcut tekniklerle geçiş için yeterli inandırıcı olmamıştır. Mikroakiskan ileriye bu alanı taşımak için disiplinler arası işbirliklerini gerektiren multidisipliner bir alandır. Bu teknik makalenin amacı, biyolojik uygulama ve mikroakışkan mikrodamarlar işlevsel doğrulama sağlarken, disiplinler arasındaki bilgi farkının azaltılması ve biyologlar tarafından fabrikasyon prosedürleri anlaşılır hale getirmektir. görüntülenmiştir deneysel protokoller mikroakışkan cihazlar ve mühendis ve biyolog arasında yakın bir işbirliğini temsil biyolojik yarar, hem de imalat içerir. Biz son zamanlarda bazı bildirildiMikroakışkan cihaz 5 ile in vitro mikrovasküler ağını kullanarak biyolojik uygulamalar. uygun istenilen kayma gerilmesini mikrokanal ağı boyutlarını tasarım ve uygulamak için, bir sayısal model yakından akış profili tahmin etmek bilgisayarlı akışkan dinamik yazılımı ile inşa edilmiştir. Örneğin, bir araya gelerek konfluens mikro serpildi Primer insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC&#39;ler), sürekli perfüzyonla 3-4 gün içinde, mikrokanalın tüm iç yüzeylere sahiptir. Uygun bir bariyer oluşturulması, statik hücre kültürü koşulları altında ve bozulmamış mikrodamarlar oluşan kıyasla VE-cadherin boyamasıyla gösterilmiştir ve daha. Bireysel perfüze sağlam mikrodamarlar 6-8 geliştirilen deneysel protokolleri uygulayarak, kantitatif EC değişiklikleri ölçülen [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) floresan içinde olan adenozin trifosfat (ATP) cevaben üretimigöstergeleri ve konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu. EC agonist kaynaklı artışlar [Ca2 +] i ve NO üretimi mikrodamar geçirgenliği 6-15 inflamatuar medyatör ile endüklenmiş artışından kaynaklandığını için gerekli olan hücre içi sinyaller olarak bildirilmiştir. Önceki bazı çalışmalarda DAF-2 DA yüklü mikroakışkan cihazlar 16,17 görüntülerini gösterdi rağmen, uygun çözünürlük ve veri analizi henüz 18 elde etmemişti. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma endotelyal agonist kaynaklı dinamik değişim [Ca2 +] i ve NO üretimi kullanan mikroakışkan tabanlı sistem ilk nicel ölçümlerini göstermektedir. Imalat teknikleri birkaç mikron mikrokanallar aşağı imal ve in vivo mikrovasküler geometrileri taklit etmek karmaşık desenleri gelişmesini sağlamak için esnekliğe sahip. Burada dallanma üç seviyeleri ile tipik bir mikrokanal ağı sundu. Buağ mikroimalat temiz oda ve yumuşak litografi gerçekleştirilir fotolitografi kombinasyonu ile imal edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip sergiler. mikroakışkan cihazların geliştirilmesi iki yılda mühendis tarafından benimsemiş olmasına rağmen, onların biyolojik uygulamalar sınırlı kalır. Biyolojik uygulamalar tarafından onaylanmış bir daha fizyolojik ilgili in vitro mikrovasküler modeli alanını ilerletmek ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasında boşlukları doldurmak için önemlidir. Burada, uzun vadeli bir perfüzyon yeteneğine sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı prosedürler mevcut. Ayrıca konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak AT [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) üretiminin, agonist ile uyarılan değişiklikleri nicelik uygulamaları göstermektedir. oluşan mikrovasküler netSürekli perfüzyon ile iş EC arasında iyi gelişmiş kavşaklar gösterdi. dağıtım-cadherin VE statik kültürlü AK mono tabakaları daha sağlam mikrodamarlar gözlenen yakın oldu. EC geçici bir artış ATP&#39;ye bağlı [Ca2 +] i ve NO üretimi kantitatif kültürlenmiş mikro damarların özelliğe geçerli bir hücre seviyeleri ölçülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz EC, geleneksel statik 2B kültürlerinde daha vivo hücre kültürü ortamı daha yakın hale getirir, iyi kontrol edilen, fizyolojik olarak uygun akış altında büyümesine izin verir. Mikrokanal ağ tasarımı çok yönlü ve üretim süreci basit ve tekrarlanabilir. Cihaz kolayca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan konfokal ya da geleneksel mikroskopik sisteme entegre edilebilir. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulan çünkü En önemlisi, bu yaklaşım nasıl araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet verecekpatolojik hasta örneklerinden değişmiş kan bileşenleri insan ECS etkileyen ve klinik konularda bilgi sağlar. Aynı zamanda ilaç taraması için bir platform olarak geliştirilebilir.

Bu bölümde, bu protokol ile geliştirilen kültür mikrovasküler ağı ile elde edilen sonuçların bazılarını gösterir. Mikrokanal deseni üç seviyeli dallanma ağı (Şekil 1A) &#39;dir. Bu tasarımda, dört 100 mikron genişliğinde kızı kanallarına yine iki 126 mikron genişliğinde kanallar ve dalları içine 159 mikron genişliğinde anne kanal dalları. 3D sayısal simülasyon Bu mikro ağı içinde kesme stresi üç farklı seviyede gösterir 0.35 ul /...

Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K Görüntüleme.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Video: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Biyomühendislik

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Gelişim Biyolojisi

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Vasculogenesis Kinetik analizi Vasculogenesis ve anjiogenezi Vitro dinamiklerini Quantifies

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

hiPSC kaynaklı endotel hücrelerinin farklılaşması ve mekanik stimülasyonu

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Yazar Spot Işığı: Akışkan Aracılı Mekanik Stimülasyon Altında Kültürlenen hiPSC'den Türetilmiş Endotel Hücrelerinin İncelenmesi 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Gelişim ve karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

bir

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Vasculogenesis Kinetik analizi Vasculogenesis ve anjiogenezi Vitro dinamiklerini Quantifies

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi