Diese Arbeit wurde von National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL56237, National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 und EPS-1.003.907).

1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication <ol><li> Standard-Lithografie Herstellung eines SU-8 50 Master-Mold <ol><li> Reinigen Sie den Siliziumwafer vor Spin-Coating. Spülen mit einem nackten 2 inch Siliciumwafer mit Aceton für 15 min, gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) für 15 min. Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 1 Stunde platziert. Nach der Dehydratisierung, Abkühlen des Wafers bei Raumtemperatur. </li><li> Spin-Beschichtung der Silizium-Wafer mit SU-8 Photoresist. 2 ml SU-8 Photoresist auf dem Wafer. Rampe des Wafers auf 500 Upm bei 100 rpm / sec Beschleunigung für 10 sec, gefolgt von 1000 Umdrehungen pro Minute bei 300 rpm / sec Beschleunigung für 30 sec. (Siehe Zusatz Video 1) </li><li> Pre-Bake-Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 10 min, dann weich backen bei 95 ° C für 30 min. </li><li> Verwenden UV-Belichtung die entworfenen Muster von einer Filmmaske auf den Photoresist schleuderbeschichtet, zu transformieren. Drucken Sie das Muster auf einem dünnen transparenten Film als Filmmaske. Legen Sie den Film Maske oben auf derschleuderbeschichtet Photoresist und belichten mit einer Dosis von 300 mJ / cm 2 bis UV - Licht. (Siehe Zusatz Video 2) Hinweis: In diesem Protokoll, das Mikrokanalnetzmuster (159 &amp; mgr; m breite Mutter Kanäle in vier 100 &amp; mgr; m breit Tochter Kanäle Verzweigung) wird mit CAD-Software entwickelt. Das Muster auf dem Film zeigt, als ein klares Feld und der Rest des Films wird durch schwarze Tinte bedeckt. Weil SU8 ein negativer Photoresist ist, der Teil des Photolacks, die UV ausgesetzt wird, vernetzt sein und während der Entwicklung der Form (Schritt 1.1.6) zu dem Lösungsmittel unlöslich werden. Nach der Entwicklung wird das unlösliche Teil des entworfen Netzmuster replizieren und dienen als Masterform. </li><li> Post-Bake der belichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 1 min, dann 95 ° C für 10 min. </li><li> Entwickeln Sie die Urform. Verwenden SU-8-Entwickler als Lösungsmittel das unvernetzte Photoresist zu entfernen. Tauchen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler für 3 min und Spülen mit IPAfür 1 min. </li><li> Wiederholen Sie diesen Entwicklungszyklus 2-3 mal, bis es keine weiße Streifenbildung (Rückstand von nicht ausgehärteten Photoresist) ist nach der IPA-Spülung. Trocknen Sie vorsichtig den Wafer mit Stickstoffgas und untersuchen die kleinen Merkmale des Musters unter einem Mikroskop. Wiederholen Sie zusätzliche Entwicklungszyklen, wenn nötig. </li><li> Hartbacken des Wafers auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Weich-Lithographie <ol><li> mischen Sie manuell die beiden Teile (Basis und Härter) von Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer bei einem Gew. Verhältnis von 10: 1. </li><li> De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator mit einem Hausvakuum für 15 Minuten verbunden. Cast der PDMS-Lösung auf dem Photoresist-Vorlagenform. Die Dicke des PDMS muss mehr als 3 mm sein, um eine stabile Halterung des Einlass- / Auslass-Rohrleitung zu schaffen. De-Gas das PDMS wieder für 15 Minuten, und entfernen Sie die verbleibenden Luftblasen mit Stickstoffgas, wenn nötig. Härten des gegossenen PDMS in einem Ofen bei 65 ° C für 3 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche vondas Deckglas mit einem Klebeband und einem Plasma-Reiniger (30 sec Plasmabehandlung). Spin-coat ungehärteten PDMS (0,5 ml) auf das Deckglas von 30 s bei 500 rpm / sec Beschleunigungsrate bis 4000 rpm ramping. Härten des PDMS schleuderbeschichtet Deckglas in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 30 min. </li><li> Schneiden Sie und lassen Sie die gehärtete PDMS aus der Urform. Dann einen Einlass schaffen und einen Auslass mit einem Durchmesser von 1 mm Lochers am distalen Ende der Mutter Kanäle. </li><li> Bond das Gerät mit dem PDMS durch Spin-Coating Deckglas. Oxidieren der Oberflächen der PDMS und mit einem Plasmareiniger für 1 min Deckglas. Nach der Plasmabehandlung Sauerstoff, stellen ein Tröpfchen entionisiertes Wasser (DI-Wasser) an der Verbindungsfläche, und legen die beiden Teile zusammen. Backen der Vorrichtung in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min eine dauerhafte Bindung zu erreichen. </li></ol></li></ol><img alt="Supplemental Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Supplemental Video 1 (Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Supplemental Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Supplemental Video 2 (Rechtsklick zum Download).</a> 2. Endothelzell Säen und Kultur <ol><li> Vorrichtung Sterilisation und Fibronectin Coating <ol><li> Erhalten, die die hydrophobe Eigenschaft der PDMS-Oberfläche um den Einlass / Auslass von Oxidation. Decken Sie die PDMS-Oberfläche um den Einlass und Auslass mit kleinen Streifen Klebeband auf die Oxidation zu verhindern. Dieses Verfahren kann DI-Wasser verhindern, dass überall auf der Oberseite des Gerätes während des Befüllungsschritt (2.1.3) zu verbreiten. </li><li> Behandeln Sie die PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma for 5 min die Oberfläche hydrophil zu ändern ist, wodurch eine Fluidströmung durch den Mikrokanal zu erleichtern und die Blase zu verhindern in dem Füllvorgang Trapping (2.1.3). </li><li> Verwenden Sie entweder eine Spritze mit einer Nadel befestigt oder einer Pipette das Gerät mit DI-Wasser von dem Einlass zu füllen. Weiterhin die Füllung bis ein Tröpfchen aus DI Wasser (30-50 ul) am Auslass angesammelt. Untersuchen Sie das Gerät unter einem Mikroskop zu prüfen, ob Blasen im Inneren der Mikrokanal gefangen sind. Entfernen Sie die überschüssige Wassertropfen am Einlass und Auslass mit einem Papiertuch. </li><li> Sterilisieren der Vorrichtung in einer Petrischale mit UV für mindestens 3 Stunden in einer laminaren Biosicherheit Haube. Um zu verhindern, Verdunstung, decken Sie den Einlass / Auslass mit einem dünnen Stück PDMS, legte ein nasses Papiertuch in der Schale, und wickeln Sie die Schale mit Parafilm. </li><li> Coat das Gerät mit Fibronektin. Spülen Sie das Gerät zunächst mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), dann streicht es mit 100 ug / ml Fibronektin über Nacht im Kühlschrank (4 ° C). Platzieren eines Tropfens der Lösung am Einlaß, und dann ein Unterdruck an dem Auslass mit einem Hausvakuum erzeugen, eine Spritze mit einer Nadel oder einer Pipette. </li><li> Füllen Sie das Gerät mit Zellkulturmedien. Spülen Sie das Gerät mit PBS manuell für 3-mal, bevor die Zellkulturmedien zu laden. Wärmen Sie das Gerät in einem Inkubator bei 37 ° C. </li></ol></li><li> ECs Säen und Langzeit Perfusions Hinweis: Im Vergleich mit konventionellen statischen 2D - EC - Kultur, die in - vitro - microvessel Netzwerk - Modell mit kontinuierlicher Perfusion machte die Zellkulturumgebung näher an den in - vivo - Bedingungen. Die in vitro microvessel Netzwerk in diesem Protokoll demonstriert können bis zu zwei Wochen aufrechterhalten werden. Die gut kontrollierte Perfusion werden Nährstoffe kontinuierlich ergänzen, entfernen Abfälle und Über Einmündung der EG einschichtigen verhindern. Daher kann es zu einer längerfristigen Untersuchungen erweitert werden, um die zellulären und hämodynamischen Umgebung unter verschiedenen PHYSIOLOGISCHER nachahmtl und pathologischen Bedingungen. <ol><li> Mischen Sie primäre HUVECs in HUVEC Kulturmedien (MCDB 131) mit 8% Dextran (Molekulargewicht 70.000). Das Dextran wird verwendet, um die Viskosität der Lade Medien zu erhöhen und eine bessere Zellaussaat Ergebnis erzielen. Die empfohlene Zelldichte beträgt etwa 2-4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Seed die Zellen in das Gerät. Legen Sie eine 10-20 ul Tröpfchen von Zellen über den Einlass. Einführung einer sanften Strömung entweder durch Kippen des Geräts oder Kapillarwirkung unter Verwendung einer Glaspasteurpipette am Ausgang. Der Schlüssel für eine erfolgreiche Zellenbelastung wird die Strömungsgeschwindigkeit kleiner als 1 mm / sec innerhalb der kleinsten Kanäle zu steuern. </li><li> Überprüfen Sie die Zellaussaat. Nach dem anfänglichen Aussäen bebrüten das Gerät für 15-20 min (befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C) , bevor die Aussaat Status unter dem Mikroskop zu prüfen. Falls erforderlich, zusätzliche Zelle Laden eines gewünschten Zelldichte zu erreichen. </li><li> Spülen Sie vorsichtig das Gerät mit Zellkulturmedium (37° C), um das Dextran zu entfernen. Kultur die Vorrichtung in Abwesenheit von Strömung für die ersten 6 Stunden in einem Inkubator (5% CO 2 bei 37 ° C). </li><li> Stellen Sie die Schlauchverbindung für die Langzeit Perfusion auf. Band das Gerät in eine Petrischale Bewegung zu verhindern. Erstellen kleine Löcher auf dem Deckel der Petrischale für Ein- und Auslaufschlauch Einfügungen. Verbinden der Einlassleitung an einer Spritze mit einer Nadel für den Zellkulturmedien Perfusion. Schließen Sie den Ablaufschlauch an einen Abfallsammler. Hinweis: Stellen Sie das Gerät und den Abfallsammler in einer Zellkultur-Inkubator, während eine Perfusions-Pumpe außerhalb des Inkubators platzieren und verbinden Sie es mit dem Gerät durch den langen Zulaufschlauch. Die Perfusionsrate wird durch die Versuchsanordnung bestimmt. In der vorliegenden Vorrichtung verwenden , um eine Perfusion Rate von 0,35 ml / min und einer Scherspannungsbereich zwischen 1-2 dyn / cm 2. Unter dieser Bedingung Perfusion erreichen die HUVECs Einmündung in etwa 3-4 Tage. </li></ol></li></ol> 3. ichmmunofluorescent Anfärben <ol><li> Fixieren den ECs in der Vorrichtung durch Perfusion mit 2% Paraformaldehyd für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von 1x PBS bei Raumtemperatur für 15 min gespült, und 1% BSA für 30 min blockiert. Verwenden eine Perfusionsrate, die die gleiche wie die für die Zellkultur verwendet wird. </li><li> Permeabilisieren die feste ECs für Antikörper-Färbung mit 0,1% Triton X-100. Perfuse das Gerät mit Triton für 5-7 min zu Etikett VE-Cadherin und 3 min zu Label F-Actin. </li><li> Laden Sie die Antikörper in das Gerät. Perfuse das Gerät mit 1x PBS für 15 min die bisherigen Lösungen auszuwaschen. laden Sie manuell den primären Antikörper gegen VE-Cadherin (anti-Ziege) in das Gerät bei einer Konzentration von 2 ug / ml (das Gesamtvolumen beträgt 20-50 ul). Halten Sie das Gerät in einem Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. Perfundieren des sekundären Antikörpers (Esel-anti-Ziege) durch eine Spritzenpumpe bei einer Konzentration von 7 ug / ml für 45-60 min. </li><li> Schild EC F-Aktin mit Phalloidin. Perfuse das Gerät mit 1x PBS for 15 min vor Phalloidin (10 ug / ml) für 7-10 min manuell geladen werden. </li><li> Schild EC-Kerne (siehe Materialliste). </li><li> Spülen der Vorrichtung mit 1x PBS und halten sie bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol> 4. Fluoreszenz - Imaging von Endothelial [Ca 2+] i <ol><li> Perfundieren, die Vorrichtung mit Albumin (10 mg / ml) -Ringer Lösung für 15 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die gleiche Perfusionsrate wie die für die Zellkultur verwendet. Die Konzentrationen aller Komponenten von Albumin-Ringer-Lösung sind in der Materialliste beschrieben. </li><li> Richten Sie konfokales System für EG [Ca 2+] i - Bildgebung mit Fluo-04.00. Verwenden Sie ein konfokales mikroskopisches System für Ca 2+ Bildgebung. Verwenden Sie ein Argon-Laser (488 nm) für die Anregung und stellen Sie den Emissionsband als 510-530 nm. Sammeln Sie die Bilder mit einem 25X Objektiv (Eintauchen in Wasser, NA: 0,95) bei 512 x 512 Scan-Format. Verwenden, um eine z-Schritt von 2 um und einem Abtastintervall für jeden Stapel von iMagiern von 20 sec. </li><li> das Lumen fluo-4 AM mit Albumin-Ringerlösung perfundiert, die Vorrichtung mit Fluo-4 AM (5 &amp; mgr; M) für 40 min bei 37 ° C, dann auszuwaschen. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Fluo-4 geladen microvessels. Sammeln Sie die Basis-Images für 10 min. Perfuse das Gerät mit ATP (10 &amp; mgr; M) und die Änderungen der Fluoreszenzintensität (FI) für 20 Minuten aufzeichnen. </li></ol> 5. Fluoreszenz-Imaging von Stickoxid-Produktion <ol><li> Perfundieren das Gerät mit Albumin-Ringer-Lösung für 15 min. Verwenden eine Perfusionsrate, die die gleiche wie die für die Zellkultur verwendet wird. </li><li> Stellen Sie die Fluoreszenz-Bildgebungssystem auf ATP-induzierte Produktion von Stickoxid zu messen. Verwenden eines Mikroskops, ausgestattet mit einem 12-Bit-Digital-CCD-Kamera und einer computergesteuerten Shutter für Stickstoffmonoxid-Messung. Verwenden Sie eine 75-W-Xenonlampe als Lichtquelle. Hinweis: Wählen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge für DAF-2 DA durch ein Interferenzfilter (480/40 nm) und einen dichroitischen Spiegel(505 nm) mit einem Bandpasssperre (535/50 nm). Verwenden Sie ein 20-fach Objektivlinse (NA: 0,75), um die Bilder zu sammeln. Um Photobleichens minimieren, positionieren Sie einen Neutraldichtefilter (0,5 N) vor dem Interferenzfilter und begrenzen Sie die Belichtungszeit auf 0,12 Sekunden. </li><li> Legen Sie die Zellen mit DAF-2 DA (5 uM). Perfundieren, die Vorrichtung mit DAF-2 DA für ca. 35-40 min bei 37 ° C. Notieren Sie sich die Basislinie von DAF-2 - Fluoreszenzintensität (FI DAF) nach dem ersten Laden. Hinweis: DAF-2 DA im Perfusat während des gesamten Experiments 7 kontinuierlich vorhanden ist. </li><li> Sammeln Sie DAF-2 Bilder. Notieren Sie sich die Basislinie von FI DAF für 5 min. Perfuse das Gerät mit ATP (10 uM) und sammeln Sie die Bilder für 30 Minuten mit 1-Minuten-Intervallen. Sammle alle Bilder aus der gleichen Gruppe von Zellen bei der gleichen Brennebene. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> wählen Sie manuell die Region von Interesse (ROIs) aus den gesammelten Bilder in einzelnen Zellebene. JederROI umfasst den Bereich einer einzelnen Zelle, die durch die Fluoreszenz Umriß angedeutet werden kann. </li><li> Subtrahiert Hintergrundfluoreszenz und den Mittelwert FI jedes ROIs. </li><li> Messen Sie ATP-induzierten Veränderungen in EG [Ca 2+] i und NO - Produktion. Quantifizieren-ATP induzierte Veränderungen in EC [Ca 2+] i durch die Änderungen in Fluo-4 FI Berechnung (FI / FI 0 * 100, wobei FI 0 die mittlere Ausgangswert FI während albumin Ringer Perfusion vor der Zugabe von ATP) minus dem gemessenen Hintergrund. Quantifizieren der NO - Produktion Rate durch die erste Differenz Umwandlung des FI DAF im Laufe der Zeit durch. Hinweis: Der Zeitverlauf der FI DAF stellt eine kumulative NO - Produktion mit der Zeit. Daher wird keine Produktionsrate basierend auf dem Profil von FI DAF sowohl unter basalen berechnet und ATP stimulierten Bedingungen. Details der Datenanalyse und experimentellen Verfahren wurden in einer früheren Veröffentlichung 7 beschrieben. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte offen zu legen.

<html> In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk, die Charakterisierung von EC Kreuzungen und Zytoskelett F-Actin - Verteilung und die quantitative Messungen der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion eine Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet wird . Perfundierten mikrofluidischen Vorrichtung stellt ein in vitro - Modell , das eine enge Simulation der in vivo mikrovaskulärer Geometrien und Scherströmungsbedingu...

Endothelzellen (ECs) , um die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und weisen eine pro-inflammatorischen Phänotyp 1,2. Die Mikrofluidik - Technologie ermöglicht eine präzise gesteuerte Fluid durch eine geometrisch eingeschränkten mikroskaligen (Submillimeterbereich) Kanäle 3, die die Möglichkeit für die kultivierten Zellen bietet, insbesondere für vaskulären ECs unter gewünschten Strömungsbedingungen zu wachsen. Diese Eigenschaften machen die Zellkulturbedingungen näher an in vivo als die herkömmlichen, statischen 2D - Zellkulturen. Sie sind äußerst wichtig, wenn die Mikrofluidik-Vorrichtungen verwendet werden, um verschiedene Arten von Gefäßsystemen modellieren und EC Reaktionen auf mechanische und / oder chemische Reize zu studieren. Trotz der Vorteile, die durch die Mikrokanalnetzwerk über eine statische Zellkultur zeigten, die Anpassung und Anwendung von Mikrofluidik in der biomedizinischen field begrenzt bleiben. Berichtet von einer kürzlich erfolgten Überprüfung, die Mehrheit der Veröffentlichungen dieser Bereich (85%) sind nach wie vor in den Ingenieurzeitschriften 4. Die Leistung von mikrofluidischen Systemen ist nicht überzeugend genug gewesen, um für die meisten Biologen von aktuellen Techniken zu wechseln wie die Transwell-Assay und der Makroebene Kulturschale / Glasträger auf diese miniaturisiertes Gerät. Mikrofluidik ist ein multidisziplinäres Feld, das interdisziplinäre Zusammenarbeit erfordert uns darauf, dieses Feld zu bewegen. Das Ziel dieser technischen Artikel ist es, die Wissenslücken zwischen den Disziplinen zu reduzieren und die Herstellungsverfahren verständlich von Biologen machen, während die biologische Anwendung und funktionale Validierung der mikrofluidischen microvessels bereitstellt. Die visualisierten experimentelle Protokolle umfassen die Herstellung von sowohl Mikrofluidik-Vorrichtungen und deren biologische Dienstprogramme, die eine enge Zusammenarbeit zwischen Ingenieuren und Biologen darstellt. Vor kurzem berichteten wir einigebiologische Anwendungen , die in vitro microvessel Netzwerk mit mikrofluidischen Vorrichtung 5 verwendet wird . Um in geeigneter Weise die Dimensionen des Mikrokanalnetz entwerfen und anwenden, um das gewünschte Schubspannung, ein numerisches Modell mit Computational Fluid Dynamic Software gebaut, um genau das Strömungsprofil abzuschätzen. Primäre humane Nabelschnurvenen - Endothelzellen (HUVECs), die in die Mikrokanäle erreicht Konfluenz ausgesät wurden, dh bedeckt die gesamten Innenflächen des Mikrokanals, in 3-4 Tagen mit kontinuierlicher Perfusion. Die geeignete Barrierebildung wurde durch VE-Cadherin-Färbung nachgewiesen, und im Vergleich mit denen unter statischen Zellkulturbedingungen und in intakten microvessels gebildet. Durch die Anwendung der experimentellen Protokolle einzeln durchbluteten intakten microvessels entwickelt 6-8, gemessen wir quantitativ die Veränderungen in der EG [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) in Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) mit Fluoreszenz - inindikatoren und konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Die Agonist-induzierten Anstieg der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden als notwendig intrazelluläre Signale für Entzündungsmediator-induzierten Anstieg der microvessel Permeabilität 6-15 berichtet. Obwohl einige frühere Studien Bilder zeigten DAF-2 DA geladen mikrofluidischen Geräte 16,17, entsprechende Auflösung und Datenanalyse war noch nicht erreicht 18. Unseres Wissens zeigt diese Studie die erste quantitative Messungen von Agonisten induzierte dynamische Veränderung der endothelialen [Ca2 +] i und NO - Produktion unter Verwendung von Mikrofluidik - basierten System. Mikrofabrikationstechniken haben die Flexibilität , Mikrokanäle bis zu wenigen Mikrometern herzustellen und die Entwicklung von komplexen Mustern zu ermöglichen , um die Geometrien der in vivo microvasculature imitieren. Hier präsentierten wir ein typisches Mikrokanalnetz mit drei Ebenen der Verzweigung. DiesNetzwerk wird durch die Kombination von Photolithographie hergestellt, die in einem Mikrofabrikations Reinraum- und Weichlithographie durchgeführt wird.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">ATP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">A2383</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-31 AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>810014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Brain Extract (BBE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover-slip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAF-2 DA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DRAQ5 (nuclei staining)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Pasteur pippette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Ringer Solution Ingredient</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl (132 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL (4.6 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2 &#183; 2H2O (2.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4 &#183;7H2O (1.2 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose(5.5 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3 (5.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Salt (9.1 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6007H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Acid (10.9 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6003H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin (F-actin staining)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>Exel Int</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scotch tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>34-8711-3070-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicon wafer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2050 Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tissue culture flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Chemical Book</td>
			<td>T6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin Neutralizer solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>PTFE microbore tubing, 0.012&#34; ID x 0.030&#34; OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biosafety Laminar hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425 Class II, Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>Wenesco</td>
			<td>HP-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp oven</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>3608-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lithography bench</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>MA6 Contact Lithography</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>L200 ND &#38; Diaphod 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter for the CCD camera</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>PVA TePla/Harrick plasma</td>
			<td>M4L/PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>Cee 200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Software</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFD simulation software</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Images acquire and analyse for NO production&#160;</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td>Metafluor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

Endothelzellen (ECs) sind die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und eine pro-inflammatorischen Phänotyp aufweisen. Obwohl die Entwicklung von Mikrofluidik-Vorrichtungen hat von den Ingenieuren mehr als zwei Jahrzehnten, ihre biologischen Anwendungen beschränkt bleiben gut angenommen. Eine physiologisch relevanten in vitro microvessel Modell durch biologische Anwendungen validiert ist wichtig , um das Feld zu fördern und um die Lücken zwischen in vivo- und in vitro - Studien überbrücken. Hier präsentieren wir detaillierte Verfahren für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einer langfristigen Perfusions-Fähigkeit verwenden. Wir zeigen auch , ihre Anwendungen für die quantitative Messung von Agonist-induzierter Veränderungen in EC [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in Echtzeit konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Das gebildete microvessel NetzArbeit mit kontinuierlicher Perfusion zeigte gut ausgebaute Verbindungen zwischen ECs. VE-Cadherin war Verteilung zu beachten, dass eine engere in intakten microvessels als statisch kultivierten EC Monolayern. ATP-induzierte vorübergehende Erhöhung des EC [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden bei einzelnen Zellebenen quantitativ gemessen, die die Funktionalität der gezüchteten microvessels validiert. Diese mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht ECs unter einer gut kontrollierten, physiologisch relevanten Strömungs zu wachsen, die die Zellkulturumgebung näher an in vivo als bei den herkömmlichen, statischen 2D - Kulturen macht. Das Mikrokanalnetzdesign ist sehr vielseitig, und der Herstellungsprozess ist einfach und wiederholbar. Das Gerät kann einfach an die konfokale oder konventionellen mikroskopischen System integriert werden ermöglicht hochauflösende Bildgebung. Am wichtigsten ist, weil das kultivierte microvessel Netzwerk kann durch primären humanen ECs gebildet werden, wird dieser Ansatz als ein nützliches Instrument dienen zu untersuchen, wiepathologisch veränderten Blutkomponenten aus Patientenproben beeinflussen menschliche ECs und Einblick in die klinische Fragen bieten. Es kann auch als Plattform für Arzneimittelscreening entwickelt werden.

Dieser Abschnitt zeigt einige der Ergebnisse mit dem kultivierten microvessel Netzwerk mit diesem Protokoll entwickelt erhalten. Die Mikrokanalmuster ist ein Dreipegel - Verzweigungsnetzwerk (1A). In diesem Entwurf ein 159 &amp; mgr; m breiten Mutterkanal verzweigt sich in zwei 126 &amp; mgr; m breite Kanäle und Äste wieder in vier 100 &amp; mgr; m breit Tochter Kanäle. Eine 3D numerische Simulation wurde durchgeführt , um die Scherspannungsverteilungen unter der Str...

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Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K Aufrufe.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Serie: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...