Biz yerelleştirme yazılım için ısmarlama mikroskop ve Seamus Holden inşaatı ile yardım için Justin Pinkney ve Johannes Hohlbein kabul. Rodrigo Reyes-Lamothe E. sağlamak için teşekkür etti coli suşu. Araştırma Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı Hibe FP7/2007-2013 SAĞLIK-F4-2008-201418, UK Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Grant BB/H01795X/1 ve ANK Avrupa Araştırma Konseyi Grant 261227 tarafından finanse edildi. DJS bir Wellcome Trust Programı Hibe WT083469 tarafından finanse edildi. SU Bir MathWorks doktora bursu ile desteklenmiştir.

1.. Hücre Kültürü Steril kültür tüpleri ve pipet ipuçlarını kullanın. E. E. coli suşu AB1157 Pola-PAmCherry Pol1 bir C-terminal füzyon PAmCherry taşır. Füzyon et al Datsenko tarif edildiği gibi lambda-Red rekombinasyon kullanılarak yabani tip geni değiştirerek doğal kromozom sokulmuştur. Hücresel büyüme ve DNA hasar madde metil duyarlılık ile belirlendiği üzere, füzyon proteininin 8 İşlevsellik doğrulandı metansülfonat (MMS). Hücre soyunun yapımı hakkında daha fazla bilgi Uphoff et al. 7 bulunabilir, Datsenko et al. 8 ve Reyes-Lamothe et al. 9 hücre kültürleri otoflüoresanı azaltmak ve mikroskop lamı üzerine arka plan parçacıkların bulunduğu M9 minimal bir ortam içinde büyütülür. Alternatif olarak, besleyici açısından zengin tanımlanmış ortam 10 kullanılabilir. <ol><li> Çizgi E. coli suşu AB1157 seçici antibiyotik (burada, 25 ug / ml kanamisin) bir Luria Broth (LB) agaroz plaka üzerinde dondurulmuş gliserol stokundan Pola-PAmCherry ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tek bir hücre koloniden bir 5 ml LB kültürü inoküle ve 3 saat boyunca 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> 5 ml kültür 1:10,000 seyreltin minimal ortam (M9 aracı, MEM amino asit + prolin, MEM vitaminleri,% 0.2 gliserol) ve 37 ° C, gece boyunca 220 rpm &#39;de çalkalanarak inkübe edin. </li><li> Sonraki sabah, bir spektrofotometre kullanılarak optik yoğunluğun (OD) ölçmek ve OD 0.025, 5 ml taze minimal ortam kültür seyreltin. Erken üslü fazda (OD 0.1) 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca büyütün. </li><li> 5 dakika boyunca 2300 x g&#39;de santrifüj ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre 1 ml konsantre edin. Süpernatantı ve 20 ul artık orta ve vorteks hücre pelletini. </li></ol> 2. Mikroskop Slide preparatiyon <ol><li> DH 2 O.% 1,5 düşük floresan agaroz çözüm hazırlayın Çözelti berraklaşıncaya kadar agaroz eritmek için bir mikrodalga kullanarak. Hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı birkaç kez 2x minimal ortamda 500 ul ile erimiş agaroz çözüm 500 ul karıştırın. </li><li> Bir mikroskop lamel (Hayır 1.5 kalınlık) merkezine eşit agaroz çözüm yaymak. Bu agaroz soğutur önce kabarcıklar kaçınarak, hızlı bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> Ikinci bir lamel (Hayır 1.5 kalınlık) ile pad düzleştirmek. Arka plan flüoresan partikülleri çıkarmak için, lamelleri önce 1 saat boyunca 500 ° C&#39;de bir fırın içinde yakıldı. Yakılan lamelleri alüminyum folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında hafta boyunca depolanabilir. </li><li> DNA hasarı deneyler için, 100 mM MMS ihtiva eden bir agaroz ped hazırlar. Adımda 2,1-2,3 in prosedürü izleyin, ama 100 mM M bir son konsantrasyon için, eritilmiş% 1.5 agaroz 500 ul ile karıştırılmadan önce, M9 ortam 500 ul 8.3 ul ekle MMSMS. (Dikkat! MMS toksik ve mutajenik ve eldiven, maske, gözlük, ve laboratuvar önlüğü ile ele alınması gerekir). </li><li> Yastığın en üst slayt çıkarın ve ped üzerine konsantre edilmiş hücre süspansiyonu 1 ul ekle. Kullanılmayan bir yandı lamel (Hayır 1.5 kalınlık, mikroskop objektif özelliklerini eşleşen) ile pad kaplayarak ve slayt çok hafifçe basarak hücrelerin hareketsiz. Hücreler agaroz ped kurumadan immobilizasyonun 45 dakika içinde görüntülü olmalıdır. Daha deneyler sırasında kurumasını önlemek için, agaroz yastıkları silikon contalar kullanılarak kapatılabilir. </li><li> DNA-hasar deneyler için, görüntüleme önce oda sıcaklığında nemli bir kap içinde 20 dakika boyunca 100 mM MMS ihtiva eden agaroz ped üzerinde hareketsiz hücreler inkübe edilir. </li></ol> 3. Mikroskopi Veri Toplama hazırlanıyor PALM algılama ve tek floresan proteinleri kesin lokalizasyonu dayanır. Duyarlılığı ve optimal hizalamaMikroskop, veri kalitesi için kritik öneme sahiptir. Tek molekül floresan mikroskoplar genellikle lamel yüzeyinden ince bir bölümünde heyecanlı sadece floroforlar tarafından sinyal-gürültü oranını artırmak için Toplam İç Yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır. E. içinde İşte, görüntüleme coli derece hafifçe uyarma ışık açısını azaltarak bir TIRF mikroskop elde edilebilir eğimli aydınlatma 11 gerektirir. PAmCherry görüntüleme bundan başka, bir foto-aktifleştirme 405 nm lazeri ve 561 nm bir uyarım lazer gerektirir. Floresans emisyon 114,5 nm / piksellik bir piksel uzunluğunda elde büyütülerek CCD (EMCCD) kamera çarparak bir elektron kaydedilir. Optimum yerelleştirme hassasiyet için, piksel boyutu yaklaşık çok sayıda piksel üzerinde sinyal yayma olmadan yeterli örnekleme sağlamak PSF standart sapma genişliği aynı olmalıdır. Şekil 3 minimal PALM kurulum şemasını göstermektedir. Movie 1ısmarlama mikroskop inşa sürecinin bir izlenim verir,. aletin ayrıntılı bilgi için Uphoff ark 7&#39;ye bakın. <ol><li> Rutin mikroskop hizalama yapılması. 405 nm ve objektif önünde 561 nm sürekli dalga lazer yoğunluklarını ölçün. 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) ve 10 μW (~ 1 W / cm 2) 405 nm yoğunluğu için 561 nm yoğunluğunu ayarlayın. 0-10 μW 405 nm yoğunluğu kademeli olarak ayarlanmasını sağlayan bir sürekli değişken nötr yoğunluk filtresi tekerleğini kullanın. Deney başlangıcına kadar lazer aydınlatmasını kapatın. </li><li> Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve iletilen ışık mikroskobu modu (Şekil 4A) odağa hücreleri getirmek. EMCCD kamera kazanç aşırı maruz kalma tarafından kameraya zarar görmesini önlemek için kapalı olması gerekir. </li><li> Veri boyutunu azaltmak ve kamera Okuması hızını artırmak için bir kırpılmış FOV&#39;yi tanımlayın. </li><li> Ortam ışığına ve sviç, numuneyi KapakEMCCD kamera kazanç ch. </li><li> (0.26 msn kamera okuma süresi dahil) 15.26 msn / kareye kare hızını ayarlamak. Tartışma bölümünde &quot;Pozlama süresi ve uyarım yoğunluklarını&quot; Bkz. </li><li> Karanlık bir arka plan sinyali (Şekil 4B) kontrol etmek için kamera verilerini görüntüler. </li><li> 561 nm lazer açın ve uyarma arka plan sinyali (Şekil 4C) kontrol edin. </li><li> Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nm lazer açın ve floresan PSFs görünen kadar yoğunluğunu artırabilir. </li><li> Lamel yüzeyine yakın numunenin sadece ince bir bölümünü aydınlatmaya uyarma ışın açısını ayarlayın. <ol><li> Bu amaçla, lazer ışını bir 100X NA 1.4 amacın arka odak düzlemi (Şekil 3) içine odaklanmıştır. Kirişin dik bir odaklama lensi tercüme uzak bir açı altında amaç çıkmak için ışın neden olan amaç merkezinden odağı taşır. </li><li> Aifloresans yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve arka plan sinyalinin en aza indirmek için m. Katı TIR uyarma lamel yüzeyin 100 nm olan görüntü florofor için uygun olduğuna dikkat edin, ancak, görüntüleme DNA-bağlama proteinleri E ile ilişkili coli nucleoid 0.8 um derin aydınlatma kadar gerektirir. </li></ol></li></ol> 4. Veri Toplama Burada, bir PALM film edinimi için genel protokol açıklar. Aynı prosedür, hasar E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinleri görüntüleme için de geçerlidir coli hücreleri ve MMS ile sürekli DNA hasarı tedavi altında. Hücre başına farklı molekül ağırlıklı ya da kopya sayısının füzyon proteinleri için olan yöntemin uygulanması (Tartışma bölümüne bakınız) elde etme, farklı ayarları gerektirir. <ol><li> Iletilen ışık mikroskobu modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı (FOV) bulun ve görüntü odak. Hücre anahatları (Şekil 4A) kaydetmek için bir kamera görüntüsünü alın.</li><li> Ortam ışıktan örnek kapak ve EMCCD kamera kazanç açın. </li><li> 561 nm lazer açın ve veri toplama başlamadan önce birkaç saniye için lamel hücresel otoflüoresanı ve arka plan noktalar çamaşır suyu. Hücreler için yetiştirilen ve M9 ortam içinde görüntülenmiş ve çok az floresan arka plan genellikle yoktur lamelleri yanmış kullanarak, ancak prebleaching örneğin LB olarak zengin Hücreler büyüme ortamı içinde görüntülenmesi için yararlı olabilir. Yoğun bir aydınlatma kadar prebleaching minimumda tutulmalıdır hücreler için toksik olduğuna dikkat edin. </li><li> 15.26 msn / karede sürekli 561 nm uyarma altında bir PALM film satın alma başlayın. </li><li> 405 nm lazer açın ve yavaş yavaş / cm 2 1 W kadar ulaşan, film boyunca yoğunluğunu artırabilir. Hücresel otoflüoresanı neden yüksek 405 nm şiddetleri kaçının. Floresan moleküllerin yoğunluğu dikkat - bu düşük aktivasyon oranları tutmak için önemlidir PSFs açıkça böyleHer bir çerçeve (Şekil 4D-F) izole edilmiştir. </li><li> 10,000 kare / film (hücre başına yansıması için moleküllerinin sayısına bağlı olarak) kaydedin; bir film tipik olarak 2-3 dakika sürer ve FOV boyutuna bağlı olarak sabit disk alanı 0.5-1 GB gerektirir. </li><li> Birden FOV için satın alma işlemi tekrarlayın. Her FOV PAmCherry flüoroforlar fotoaktive olsun, çünkü sadece bir kez görüntülenmiş ve geri dönüşümsüz beyazlatılmış unutmayın. </li></ol> 5. Veri Analizi Bir otomatik ve sağlam veri analizi çerçeve yönteminin performansı ve verimliliği için gereklidir. Biz MATLAB yazılmış özel yazılımı kullanın. <ol><li> Crocker et al. 12 &#39;de tarif algoritmaları kullanarak lokalizasyonu analizi yapın, Holden ve ark. 13 HoldenI et al. 14 ve Wieser et al. 15 PSFs ilk 7 piksel ile bir Gauss çekirdek kullanarak bir bant geçiren filtre görüntüde tespit edilirs çapı (Şekil 5A). Aday pozisyonları arka plan sinyali (Şekil 5B) ve 4.5 kat, standart sapma üzerinde olan en yüksek piksel yoğunluğunun PSFs karşılık gelir. Aday PSF başına lokal parlak piksel eliptik bir Gauss fonksiyonu (Şekil 5C) takılması için ilk tahmin olarak hizmet vermektedir. Serbest formda parametreler şunlardır: x-konumunda, y-konumunda, x-genişliği, y-genişliği, dönme açısı, genlik ve arka plan ofset. Eliptik Gauss maskesi PSF bulanıklaştırır ve deforme pozlama süresi sırasında molekül oluşturmaktadır. </li><li> Aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerine PALM filmin bütün çerçeveler de elde edilen (x, y) lokalizasyonu çizilir. Pol1-PAmCherry Yerleşimleri E. merkezi alanı içinde görünmelidir coli hücreleri (Şekil 6A). Birçok lokalizasyonu hücrelerin dışında görünüyorsa, yerelleştirme eşiği çok düşük ayarlanmış veya numune arka plan floresan parçacıklar içeriyordu. </li><li> Otomatik izleme analizi için, Crocker et açıklanan algoritması MATLAB uygulama ark. 12. (Tartışma bölümünde &quot;Difüzyon analizi&quot; bakınız) kullanılabilir. Bir kullanıcı-tanımlı izleme penceresi içinde sonraki karelerde görünen pozisyonları bir yörünge oluşturmak için bağlanır. Çok bölgedeki aynı pencerede meydana durumda, parça benzersiz adım uzunlukları toplamı minimize tarafından atanır. Tek parçacık izleme verilerinden difüzyon katsayıları hesaplanırken çeşitli hususlar ayrıntılı bir tartışma için, Wieser vd. 15 bkz <ol><li> Algoritması bir parça sırasında geçici yanıp sönen veya cevapsız lokalizasyonu için hesap için bir bellek parametresini kullanır. Burada, 1 kare bellek parametresi; yüksek değerler uzun ömürlü koyu devletleriyle florosforlar izleme için kullanılabilir. </li><li> Aşağıdaki kalibrasyon adımları dayanan uygun bir izleme penceresi seçin. Pol1 için, 0.57 mikron (5 piksel) kullanabilirsiniz.</li><li> Pencere parametrelerini izleme aralığı için izleme algoritması çalıştırın. Parça (Şekil 6B) bölünmüş değildir mümkün olan en küçük izleme penceresi belirlemek için izleme penceresinin bir fonksiyonu olarak ölçülen, hücre başına parça sayısını hesaplayın. </li><li> Hücre içindeki molekül hareketinin dağılımını görselleştirmek için aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde elde edilen parça çizilir. Pol1 parça tek hücre (Şekil 6C-D) içinde sınırlı difüzyon göstermesi gerekir. </li><li> Parça bir kısmı hücreler arasında çapraz görünüyorsa bu izleme penceresi çok büyük ve / veya fotoaktivasyon oranı (Şekil 6E) çok yüksek olduğu seçildi çünkü ayrı moleküller yanlışlıkla bağlantılı olduğunu göstermektedir. </li><li> Ardışık lokalizasyonu (Şekil 6F) arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çiziniz. Eğrisi yükselir ve yeterince büyük izleme pencereler için sorunsuz doyururPencere çok küçük seçildi eğer bir kesme kenarı gösterir. </li></ol></li><li> Pol1 difüzyon özelliklerini analiz etmek, N adımların toplamda her parça için ardışık yerleşimli arasındaki ortalama karesel deplasman (MSD)) hesaplamak: MSD = 1 / (N-1), i = 1 Σ N-1 (X i +1 - x i) 2 + (y i +1 - y i) 2. Sadece MSD değerleri istatistiksel belirsizliği azaltmak için en az 4 adım (N ≥ 5 yerelleştirmeler) ile izler içerir. </li><li> Birden fazla kare (Şekil 6G) üzerinde deplasmanları hesaplayarak lag kez aralığında MSD değerleri eğrisi çizilir. MSD eğrisinin şekli gözlenen moleküler hareket (Şekil 6H) sınıflandırmak için yardımcı olabilir. </li><li> MSD parça başına görünür difüzyon katsayısı D * hesaplayın: D * = MSD / (4 Dt) - loc 2 / ¨ t σ. İkinci term (Wieser vd. 15 bakın, burada σ loc = 40 nm ve Dt = 15.26 msn) tahmin yerelleştirme hata düzeltir. </li><li> FOV (Şekil 7A) Tüm parçalar arasındaki ölçülen D * değerleri bir histogram çizilir. </li><li> Parça başına ölçülen D * değere dayalı kromozoma bağlı görünen bireysel Pol1 molekülleri tanımlamak. Bağın popülasyonları ayırmak (merkezli keskin dağıtım D * ~ 0 mikron 2 / sn) ve D * &lt;0,15 mikron 2 / sn bir eşik ayarlayarak serbestçe difüzyon moleküller (geniş dağıtım D merkezli * ~ 0.9 mikron 2 / sn) ( Şekil 7A ve 7D) kırmızı barlar. </li><li> Hasarsız hücrelerinin (Şekil 7A-C) ve MMS (Şekil 7D-E) ile DNA hasarı tedavi altında hücrelerde lokalizasyonu, izleme, ve Pol1 için difüzyon analizi yürütmek. Ciltli parça fraksiyonu DN doğrudan sayısal olarak ölçülmesini sağlarIn vivo Pol1 bir onarım aktivitesi. </li></ol>

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Biz deney başarısı için birkaç önemli konuları tartışmak. Seçim ve floresan füzyon proteininin ifadesi: foto-aktifleştirilebilen ve photoswitchable floresan proteinleri 17 büyük bir palet bulunmaktadır. Özel seçim mikroskop özellikleri, mevcut özellikle lazerler ve filtreler bağlıdır. 405 nm ve 561 nm kombinasyonu yaygın ışıkla aktive floresan proteinleri için idealdir. Biz monomerik olduğu için PAmCherry 6 seçtik ve hücrelerde herhangi bir toplama gösterdi. Ayrıca, geri dönüşü olmayan bir foto-aktifleştirme hücre başına protein kopya sayısını ölçmek için aktif florofor sayısını sayma sağlar. Bunun yerine bir plazmidden füzyon proteini ifade nedeniyle, vahşi tip lokusta füzyon proteinini kodlayan genin kromozom ekleme tercih ederim. Bu floresan ettik ile ilgili proteinin tam yerine sağlarrsion ve vahşi tip ekspresyon seviyesini korur. Foto-aktifleştirme oranı: Bu ortalama hücre başına daha az bir molekül filmin herhangi bir çerçeve içinde floresan halde olduğu gibi foto-aktifleştirme hızını ayarlamak için önemlidir. Bu, 405 nm yoğunluğuna bağlıdır ve moleküllerin sayısı etkinleştirilmesini yaptı. Çok düşük görüntüleme yoğunluklarda, ancak, tüm moleküller filmin sonundan önce görüntülenmiş olacak ya da çok uzun bir film satın gerekir. Filmin kaydedilen çerçeve sayısı hücre başına füzyon proteinleri ve ikinci uyarma koşullarında PAmCherry ortalama ışıkla ağartma ömür boyu kopya sayısına bağlıdır. Pol1 ait kopya sayısı ~ 400 molekül / hücre 1 ile üstel ışıkla ağartma süresi dağılımının ortalama değeri ~ 4 kare olmuştur. Kademeli olarak 405 nm yoğunluğunu arttırarak, aktivasyon eşit filmin 10000 çerçeveler üzerinden dağıtılır. Bu nedenle, her bir hücre occupPSFs ve 10,000 kare bir film izleme komplikasyonların küçük üst üste sağlanması, ~ 1.600 kare bir toplam floresan moleküller ile ied. Pozlama süresi ve uyarım şiddetleri: En önemlisi, pozlama süreleri az hareket bulanıklığı ile keskin PSFs gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Ancak, kare hızı yerelleştirme belirsizlik ötesinde ardışık çerçeveler arasında gözlemlenebilir moleküler hareket verecek şekilde seçilmelidir, aksi takdirde önemli fotonlar takip oversampling tarafından israf edilmektedir. Bağlanmamış moleküllerinin hareketi lokalizasyonu belirsizlik nedeniyle bağlanan moleküllerin belirgin hareketi açıkça ayırt edilebilir olması için yeterince uzun bir zaman aralıklarında örneklenir gerekir. Maruz kalma süresi ayarlandığında, PSF şiddeti ayarlanabilir olmalıdır. PSF lokalizasyonu hassas bir çerçeve süresi boyunca algılanan fotonların sayısı ile artar. Yükseköğretim uyarma yoğunlukları foton emisyon oranı met artırmakt da photobleaching hızı ve arka plan sinyali. İstenilen yerelleştirme hassasiyet verir düşük uyarım yoğunluğunu kullanın. Pol1-PAmCherry için biz 15.26 msn / çerçeve ve 3,5 mW 561 nm uyarma (400 W / cm 2) seçti. Bu (Uphoff ve ark. 7 Tamamlayıcı bilgiler bakınız) veri toplama öncesi ve sonrası hücre büyümesini ve morfolojisi izleyerek belirli görüntüleme koşulları için hücre canlılığı teyit etmek önemlidir. Pol1 in vivo 7 aralıklı bir DNA alt tabakasına ~ 2 sn bağlayıcı bir zamanı sergiler; bu nedenle moleküllerin çoğunluğu bir parçanın tüm süre boyunca ilişkili veya ilişkisiz devlet ya olmasını bekliyoruz. Kromozom siteleri sitoplazmada Pol1 difüzyon (~ 1 mikron 2 daha difüzyon katsayı büyüklüğü alt birkaç siparişleri (~ 10 -5 mikron 2 / sn, Elmore ve diğ. 18) çünkü bağlı moleküller aslında hareketsiz görünür </skadar&gt; / sn). Difüzyon analizi: görünür difüzyon katsayısı D * tek tek parçaları MSD hesaplanır, istatistiksel hatayı azaltmak için 4 adımda (5 kare) az üzerinde ortalama. O ~ moleküllerinin% 75 tanımlanan görüntüleme koşulları için en az 5 kare içinde çamaşır suyu edin. Gibi kısa parçalar ilişkili ve ilişkisiz molekülleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel kesinlik vermemektedir. Bununla birlikte, protein aktivitesi rapor bağlanmış ve bağlanmamış moleküllerinin nispi fraksiyonları analiz parçaların toplam sayısının bağımsızdır. Belirsizlik bir molekülün 15 her lokalizasyonu için belirgin bir rasgele adım ekler, çünkü D * hesaplanmasında PSF yerelleştirme hatası (σ loc) için hesap yararlıdır. Bağlı ve difüzyon moleküllerin sınıflandırılması artırmak için, D * bot hesaplanması tavsiyeİki çerçeve, zaman içinde tek aşamalı değiştirmeler ve yer değiştirmeler h. Bu iki ayrı D * eşikleri ayarlamak mümkün olur: D * (15 msn) &lt;0,15 mikron 2 / sn ve D * (30 msn) &lt;0.075 mikron 2 / sn. D * pozlama süresinde nedeniyle difüzyon bulanıklık parçaları ve hareket hücre hapsinde etkilenir belirgin difüzyon katsayısı olduğunu unutmayın. Doğru, tarafsız difüzyon katsayıları ayıklamak için, bir stokastik Brown hareketi modeli 5,7 dayalı simüle verilere gözlenen hareketini karşılaştırmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Simüle veriler de veri analizi prosedürlerini test etmek için kullanılır. Bu yöntemin olası uygulamalar: Bu kromozoma bağlanması üzerine bir proteinin hareketliliğinde değişiklik ile in vivo koşullarında protein-DNA etkileşim görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. DNA-ya da etkinlikleriOnarımında yer alan RNA bağlayıcı proteinler, replikasyon, transkripsiyon ve kromozom bakım böylece optik kırılma sınırın altında bir uzamsal çözünürlük ile tek-hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Fotoaktive tek molekül izleme hücre başına birkaç işaretli moleküllerin kısıtlanır geleneksel izleme yöntemlerinin uzanır. In vivo moleküler difüzyon ölçen alternatif bir yöntem (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra Floresan Kurtarma olduğunu. FRAP büyük hücreler küresel difüzyon özelliklerini ölçmek için çok yararlı olsa da, özellikle küçük bakteri hücreleri için, uzamsal olarak heterojen bir ortamda farklı hareketlilik ile çeşitli moleküler türlerin çözmek için yeteneği sınırlıdır. Bu DNA-bağlama aktiviteleri ve E içinde farklı protein bir dizi alt-hücresel lokalizasyon ölçmek için izleme ışıkla aktive edilen tek molekül uyguladık coli Pol1, DNA ligaz, FIS protein, DNA da dahil olmak üzerepolimeraz III 7, hem de kromozomlar protein MukB, E, ve F 19 yapısal bakımı. Bu yöntem aynı zamanda, diğer hücre tiplerine adapte edilebilir tahmin ediyoruz.

Bu protokol, Escherichia coli canlı hücreler protein-DNA etkileşimlerin doğrudan ölçülmesini anlatır. Bu kromozom (Şekil 1) bağlanan olarak teknik, tek bir floresan etiketli proteinin yayılma katsayısındaki bir değişiklik kullanır. Biz DNA polimeraz gecikmeli iplikçik çoğaltma ve eksizyon onarım yollar 1 DNA boşlukları doldurur I (Pol1), bir prototip DNA-bağlayıcı protein kullanmak yöntemini göstermek için. Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi gelişi nanometre çözünürlükte hücrelerde moleküler yapıların görüntülenmesini sağlar. Fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM) bir floresan devlet (Şekil 2) için bir başlangıç ​​karanlık durumdan aktif edilebilir floresan proteinleri kullanır. Sadece, tüm işaretli moleküllerin bir alt kümesi, bağımsız bir şekilde t, sıralı bir şekilde konumlarını belirlemek için herhangi bir zamanda devreyeo örnek 2&#39;de işaretli moleküllerin konsantrasyonu toplam. Molekül başına lokalizasyonu hassas esas olarak floresan Point Spread Fonksiyonu (PSF) büyüklüğüne bağlıdır toplanmış, fotonların sayısı ve arka plan sinyali 3. Bu yöntemin bir çok uygulama hücresel yapıların görselleştirmenin geliştirilmesi üzerinde odaklanır. Izleme PALM tek molekül ile birleştirilebilir gerçekleştirilmesi 4, doğrudan canlı hücreler içinde etiketlenmiş proteinlerin rasgele sayı hareketini izlemek için yeni yollar açılmıştır. Artan duyarlılık ve floresan mikroskoplar zamansal çözünürlüğü şimdi bakteriyel sitoplazmada 5 tek difüzyon floresan proteinleri izlenmesine izin. Burada, PAmCherry, geri dönüşü olmayan 405 nm ışık 6 ile ışıma üzerine bir floresan duruma özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan dönüştüren bir mühendislik floresan proteini kullanır. Aktive PAmCherry flüoroforlar görüntü olabilir561 nm uyarma ve photobleaching kadar birkaç kare için izlenen tarafından d. Biz Pol1 ve PAmCherry bir füzyon kullanan tek proteinlerin geçici DNA-bağlama olayları tanımlamak için yöntemin yeteneğini göstermektedir. Metil metansülfonat (MMS) ile hücrelerin tedavisi baz eksizyon onarım enzimleri ile aralıklı DNA alt tabakalar haline getirilmiştir DNA metilasyon hasara neden olur. Bizim yöntem MMS hasara 7 yanıt tek Pol1 moleküllerin bağlanma açıkça göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

Protein-DNA etkileşimleri birçok temel hücresel süreçlerin merkezinde yer alıyor. Örneğin, DNA replikasyonu, transkripsiyon, onarım ve kromozom organizasyon In vitro deneyler, DNA-bağlayıcı proteinlerin birçok çeşit fonksiyonu için ayrıntılı modeller oluşturmak için yardımcı olmuştur. Spesifik DNA yapıları ya da dizileri tanıyan DNA bağlayıcı proteinler tarafından yönetilir, henüz edilir , canlı hücresinin karmaşık ortamda bu süreçlerin ve onların örgütün kesin mekanizmaları çok daha az anlaşılır kalır. Yakın zamanda Fotoaktive Localization Mikroskopisi tek molekül izleme ile birleştirilmiş (PALM) kullanılarak canlı Escherichia coli hücrelerinde DNA tamir faaliyetleri ölçülmesi için bir yöntem geliştirmiştir. Bizim genel yaklaşım kromozomu ile dernek üzerine tek bir proteinin hareketlilik değişiklikle bireysel DNA-bağlama olayları tanımlar. Bağlı moleküllerinin protein fraksiyonu hareket için bir doğrudan niceliksel ölçümünü sağlartek hücre düzeyinde ivity ve alt-tabakalar ya da bağlanma siteleri bolluk. Burada, biz yöntemi kavramını açıklamak ve örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi işlemlerini göstermektedir.

In vivo olarak, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için izleme ışıkla aktive edilen tek bir molekül kavramı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PAmCherry füzyon proteinleri, canlı E&#39;de algılanır Bir seferde, hücre başına daha az bir molekül bir frekansta 405 nm ışık ile davranışsal tek moleküller, ışıkla aktive olan bir sıralı bir şekilde coli hücreleri. Aktive moleküller sürekli 561 nm uyarma altında görüntülenmiş. Hücrede moleküler hareketin geri dönülmez ağartmanın kadar bir dizi kare yakındaki bölgeselleştirmelerini bağlayarak izlenebilir. DNA bağlayıcı proteinlerin difüzyon kromozom bağlanması üzerine yavaşlatıldığı için, D * iz başına elde edilen, görünen yayılma katsayısının doğrudan bireysel protein-DNA etkileşim ve raporlar. Şekil 2, canlı E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin foto-aktifleşmesini gösteriyor coli hücreleri. O 405 nm yoğunluğunun etkisin floresan moleküllerin yoğunluğu, Şekil 4&#39;te görülebilir. Yoğunluk sadece 405 nm yoğunluğu ile ancak ek aktivasyonu için kullanılabilir moleküllerin sayısına göre belirlenir değil unutmayın; kalan moleküllerin havuzu PALM film boyunca tüketilir. Lokalizasyon analizi Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi bir PALM filmin her bir çerçevesi için gerçekleştirilir. Bu canlı hücrelerde, sabit hücrelerde veya bağlı moleküllerinde hareketsiz molekülleri kullanarak lokalizasyonu hassas ölçülür. Bizim satın alma ayarları teorik tahmini 3 ile anlaşarak, σ loc = 40 nm bir yerelleştirme kesinlik verdi. Elde edilen Pol1 lokalizasyonları genel olarak E uzaysal organizasyonu yansıtan, hücrenin merkezi alan (Şekil 6A) işgal coli 7 nucleoid. Pol1 çoğunluğu dif ekran hasar görmemiş hücrelerde izlerŞekil 6C&#39;de gösterildiği gibi füzyon. Tipik bir hücre E başına yaklaşık 400 Pol1 moleküllerinin kopya sayısı ile uyumlu birkaç yüz Pol1 parça (Şekil 6D) içerir . coli hücre 1. 6B ve Şekiller 6E-F, uygun bir izleme penceresi parametresini seçiminde rehberlik - izleme penceresi çok büyük ise, farklı moleküller yanlışlıkla bir parçaya bağlı olma olasılığı daha yüksektir; izleme penceresi çok küçük ise, parça uzun adımlarla bölünecektir. Pol1 için MSD eğrisi hücre hapsi (Şekil 6G) nedeniyle daha uzun gecikme süreleri kısa gecikme süreleri ve saturatları için doğrusal yükselir. Moleküler hareket farklı türleri MSD analizi ile tespit edilebilir. Directed hareket parabolik eğri verir, Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir, kapalı difüzyon eğri bir düzlüğe ulaşır; hareketsiz parçacıklar için MSD eğrisinin bir kaydırmada l temsil ederocalization belirsizlik (Şekil 6H). Tek parçacık izleme ve sorun giderme ipuçları hakkında ek bilgi Arnauld vd. 16 bulunabilir Daha önce eksojen DNA alkilleme hasarı 7 yanıt olarak Pol1 DNA onarım aktivitesini ölçmek için yöntem uygulanır. Pol1 of D * histogram molekülleri (Şekil 7A-C) difüzyon baskın bir nüfus gösterir hasar görmemiş hücrelerde izler. % 2.7 bağlı Pol1 moleküllerinin küçük bir kısmı muhtemelen gecikmeli iplikçik çoğaltma ve endojen DNA hasarının onarımı yer almaktadır. Sürekli 100 mM MMS hasar altında,% 13.8 (Şekil 7D) D * ~ 0 mikron 2 / sn artış ile parça nüfusu. Bu izler baz eksizyon tamir yolunun bir parçası olarak tek nükleotid boşlukları doldurmak için DNA onarım sentezini gerçekleştirerek bireysel Pol1 moleküllerini temsil eder. Ciltli parça pozisyonları bireysel konumlarını göstermekDNA hasarı ve onarımı siteleri (Şekil 7E-F). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Şekil 1. Yöntemin grafik gösterimi. (A) floresan protein PAmCherry 405 nm ışık ile ışıma üzerine özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan ışıkla aktive edilebilir. Parlak devlet 561 nm heyecanlı ve geri dönüşümsüz flüoroforun ağartıcılarının kadar 600 nm civarında floresan yayar. (B) fotoaktivasyon oranını kontrol sağlar görüntüleme herhangi bir zamanda yalnızca hücre başına tek bir davranışsal aktive PAmCherry füzyon proteini karanlık durumunda kalır henüz aktif edilmemiş ya da zaten ağartılmış moleküllere keyfi büyük havuz ise. (C) floresan molekülünün pozisyon izole PSF ve tr merkezinden belirlenirPhotobleaching kadar birkaç kare için acked. Birçok moleküllerin (D) parçalar sıralı bir şekilde kaydedilir. (EF), bir kromozom hedef sekans veya yapı ile bir DNA bağlayıcı proteinin etkileşim rastgele dağılan hareketi durur. Bağlanmış ve bağlanmamış molekülleri D * bir parça elde görünen yayılma katsayısı ile ayırt edilir. Bağlı moleküllerinin elde edilen fraksiyon, in vivo olarak bir DNA bağlayıcı proteinin aktivitesi için bir nicel ölçü verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Canlı E. Pol1-PAmCherry Foto-aktifleştirme bölgesinin coli hücreleri. Ölçek çubukları: 1 mikron. Şemalar her panelin altında gösterilmiştir. (<html> A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık mikroskobu görüntüsü Bulaşan. (B) bir hücre içinde, tek bir PAmCherry flüorofor Phototactivating. (C) daha yüksek bir kuru foto-aktifleştirme flüoresan moleküllerinin sayısını artırır. (D) Bir PALM film Entegre PAmCherry floresan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> Şekil 3,. Işıkla aktive olan ve görüntüleme PAmCherry füzyon proteinleri için bir asgari PALM kurulum şematik D1:. Dikroyik ayna (örneğin 550 nm uzun geçiş). D2: Dichroic ayna (örneğin 570 nm uzun geçiş). L1: Ayarlama merceği. L2: TIR lens. L3: Tüp lens.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. . 15.26 msn / çerçeve Ölçek çubukları ile bir PALM film Temsilcisi görüntüler: 1 mikron. (A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık görüntüsünü Bulaşan. (B) lazerler ile EMCCD kamera ölçülen karanlık arka plan görüntüsü kapatılır. Fotoaktivasyonu önce sürekli 561 nm uyarma altında (C) Uyarma arka plan görüntüsü. (DF) Artmış 405 nm yoğunluğu sürekli 561 nm uyarma altında görüntülü PAmCherry yüksek fotoaktivasyon oranlarına yol açar. Kutulu alanlar aşağıda büyütülmüş gösterilmiştir. (D) Düşük 405 nm yoğunluğu (&lt;1 μW) aktif FOV başına çok az floresan moleküller. (E) Orta 405yerelleştirme ve izleme analizleri için iyi bir PSF yoğunluğu nm yoğunluğu (~ 2 μW) fotoaktivasyon sonuçları. (F) Yükseköğretim 405 nm yoğunluğu (~ 10 μW) yerelleştirme ve izleme analizleri karartan bazı hücrelerde birden fazla floresan molekülü harekete geçirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Yerelleştirme analizi İllüstrasyon. Ölçek çubukları: 1 mikron (A) Band-pass filtreleme sahte piksel gürültü kaldırır ve FOV genelinde yoğunluk Degradeleri düzleşir.. (B) Aday PSFs yanlış pozitif ve yanlış negatif algılamaları en aza indirmek için seçilmiş olan bir kullanıcı-tanımlı eşik dayalı filtrelenmiş görüntü tespit edilmiştir. Threshold arka standart sapma (sinyal-gürültü oranı, SNR) bölünmesiyle elde edilen bir aday pikselin en az yoğunluğuna karşılık gelir. (C) eşik iki boyutlu eliptik Gauss oturması için ilk yerelleştirme tahmin (turuncu çapraz) olarak hizmet geçer yerel parlak piksel. Ölçek çubukları: 0,5 mikron. Oluşan süper çözünürlük yerelleştirme (mavi çapraz) σ loc ortalama hassasiyete sahiptir = 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Izleme analizi Şekil 6 İllüstrasyon Ölçek çubukları: 1 mikron. (A) bir örnek hücre içinde Pol1-PAmCherry her tespit lokalizasyonu. (B) iz sayısı tespitİzleme penceresinin bir fonksiyonu olarak, örneğin hücrede ed. Küçük izleme pencereleri parça yüksek sayıda artifaktüel yol açar molekül yörüngeleri, bölünmüş. Kesikli çizgi izleme penceresi parametresi (0.57 mikron, 5 piksel) bizim seçim gösterir - bu adımları tam dağılımını tespit ve sağlam farklı moleküllerin yörüngeleri tutmak arasında iyi bir uzlaşma sağlar. Tek Pol1-PAmCherry molekülünün (C) Örnek parça. (D) rastgele renklerle gösterilen tüm ölçülen izler. Izleme penceresi seçilmiş ise (E) İzleme eserler (burada 0.8 um, 7 piksel) veya kare başına PSFs yoğunluğu çok yüksek, çok büyük. Izleme pencereler için adım uzunlukları (F) kümülatif dağılımları: 0.34 mikron (3 piksel, kırmızı çizgi), 0.57 mikron (5 piksel, mavi çizgi), ve 0.80 mikron (7 piksel, yeşil hat). 0.34 mikron izleme penceresi 0,34 mikron daha uzun adımlar keser unutmayın ki açıkçaadımların tam dağılımını keser. 0.80 mikron izleme penceresi olduğu gibi 0.57 mikron izleme penceresi adımlar hemen hemen aynı dağılımı algılar. (G) MSD eğri Pol1 sınırlıydı difüzyon gösterir. Yönlü hareketi, Brown hareketi, sınırlı difüzyon ve hareketsiz partiküller için (H) şematik MSD eğrileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Canlı E. Pol1 DNA tamir aktivitesinin doğrudan ölçümü . coli hücreleri Ölçek çubukları: 1 mm. (A) bir hasar görmemiş hücrelerin FOV (N = 4162 parça) 4 veya daha fazla adım tüm parçalar için görünür difüzyon katsayısı D * Histogram. B olarak sınıflandırılan moleküllerinin popülasyonunun<html> ound kırmızı vurgulanır. Pol1-PAmCherry (BC), parçalar iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde gösterilmiştir. Kendi difüzyon katsayısı göre bağlı olarak sınıflandırılan parçalar kırmızı ile gösterilmiştir. (D) D * (N = 2128 parça) görüntüleme önce 100 mM MMS ile bir agaroz ped üzerinde immobilize edilir ve 20 dakika inkübe edilen hücrelerde ölçülen Pol1 parçaları için histogram. DNA tamir yapan bağlı moleküllerin nüfusu kırmızı gösterilir. (EF) Pol1-PAmCherry kırmızı tek Pol1 DNA onarım olayların izlerini gösteren iletilen ışık mikroskobu görüntüde izler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Film 1. Bir ısmarlama PALM kurulum bina.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Videoyu izlemek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Görüntüleme.  University of Oxford.  Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü. 

Video: Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...