Biz resimli yardım için Sophie gournet teşekkür Julie Chaumeil el yazması, hayvan barınma tesisi ve Birim görüntüleme platformu okumak için. Bu çalışma programı «Investissements d&#39;Avenir» altında destek alan referanslar ANR-10-LABX-0044 ve ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, EpiGeneSys 7.ÇP hayır ile Fransız Hükümeti tarafından başlatılan ve ANR tarafından uygulamaya koymuştur. EH mükemmellik 257.082 Ağ, bir ERC Advanced Araştırmacı hayır ödül. 250.367 ve AB 7.ÇP SYBOSS hiçbir hibe. 242.129 EH yazarlar ışık yardım için Institut Curie, Fransa-Biyogörüntüleme (ANR-10-InSb-04) üyesi, ve Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü (UMR3215 / U934) Hücre ve Doku Görüntüleme Platformu kabul etmek istiyorum mikroskopi.

Hayvan prosedürleri onaylı kurumsal hayvan bakımı göre yapılan ve Institut Curie (CEEA-IC) protokolleri (C 75-05-18) komitesini kullanmak bulundu. çalışmaları da Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar (anlaşma numarası 5549CA-I) kullanımı için Yükseköğretim ve Araştırma Fransız Bakanlığı onayı altında yapılmıştır. Kriyostat Bölüm 1. hazırlanması <ol><li> Shea ve arkadaşları., 12 de tarif edildiği gibi, doğal olarak F1 C57BL / 6 x DBA / 2J fareler yumurtlama embriyolar toplayın. gebelik (E7) 7. gününde, servikal dislokasyon ile 8-12 haftalık fare kurban. Tüm konseptus yani desidua 12 toplayın. </li><li> Shea ve arkadaşları de tarif edildiği gibi, E7 conceptuses izole edin. 12. PBS içeren bir 60 mm Petri kabı koyun. </li><li> kriyostat bölümleri için E7, fare konseptus dondurun. <ol><li> 1cm yüksekliğinde uyarlanmış alüminyum folyo kuyuları hazırlayın ( &#39;ev yapımı&#39; bir cam Pasteur pip kullanarakEt). bu küçük kabın altındaki doku dondurma orta bir damla bırakın. Doğru yönde konseptus birikintisi (örn, boyuna kesitler için konseptus yatay oryantasyonda muhafaza edilmelidir). </li><li> Doku ortamı dondurma iyi içeren konseptus doldurun. Daha sonra, beyaz olana kadar bir kaç saniye için sıvı N2 içinde blok daldırın - yavaş yavaş dondurma izin vermek için sıvı N2 üzerindeki buhar forseps ile askıya alınması. Daha sonra, (bir kaç ay için depolayabilir) -80 ° C&#39;de bir dondurucu şişe ve deposuna blok aktarın. </li></ol></li><li> kriyo-ayırma önce, 30 dakika süre ile kriyostat -20 ° C&#39;de konseptus içeren dondurulmuş blok yerleştirin. 8 mikron kalınlığında cryosections gerçekleştirin. bir slayt Mevduat 4 bölümler verimli eki sağlamaktır. Yeri bölümleri 18 x 18 mm 2 lamel altına sığacak kadar kapatın. </li><li> kalitesini kontrol edinBölümler (sağlam ve çizilmelere olmaksızın) ve bir stereomikroskop ile embriyo (boyuna kesit) yönlendirilmesi ve daha fazla analiz için müsait bölümler seçin. Mümkün olduğu kadar çabuk bir coplin kavanoza onları yatırmak ve RNA FISH (3.3.2 bakınız) gerçekleştirin. </li></ol> İkincil TGCs 2. hazırlanması <ol><li> Conceptus (1.1 ve 1.2) izole eder. </li><li> E7 Ectoplacental Cone (EPC) teşrih <ol><li> Stereomikroskopta ve steril PBS içeren Petri kapları kullanın. forseps ile desidua teşrih. Pierce örnek ve açık forseps ayrı desidua iki yakasını gözyaşı. </li><li> embriyo dışarı kabuk. Bir makas benzeri eylem kapalı ince forseps (Dumont No. 5) kullanılması uçları uygun embriyo EPC ayırmak için. Anne dokusundan yanı sıra koryon ve yolk kesesi ayrı, mükemmel temiz numune elde etmek için özel dikkat gösterin. PBS EPC eksplantlar yıkayın. </li><li> Biraz kaşıkla, bir 4-wel bireysel Diseke EPC transferiorta steril lamel içeren l plaka. </li></ol></li><li> EPC Kısa vadeli Kültürler gelen TGCs türevi. <ol><li> lamelleri içeren 4-oyuklu plakalar hazırlamak. alev sonra kurutma, etanol içinde daldırarak cam lameller hafta 12 mm çaplı sterilize edin. </li><li> Her bir oyuğa 0.5 ml EPC orta ekleyin (EPC ortamı: RPMI 1640,% 15 FCS, 0.1 mM 2-mersaptoetanol ve antibiyotik ile takviye edilmiştir). </li><li> Deposit, tek bir kültür ortamı ile birlikte iyi olarak lamel merkezinde kesilerek-EPC. cam lamel üzerinde EPC uygulamak için ince forseps kullanın. 37 ° C&#39;de 3-5 gün Culturefor,% 5 CO2. Bağımsız eksplant düzleştirilmiş TGCs (Şekil 2A) bir tek tabaka olarak yayılan bir gelişimini oluşturur. </li></ol></li></ol> 3. RNA BALIK Not:. Protokolleri Chaumeil ve arkadaşları, 8 ve baş ve duyulan 13 (ESCs) embriyonik kök hücreleri için tarif edilen dayanmaktadır. <ol><li> Gelişmiş PrepaStok Çözümleri rasyon <ol><li> 3M sodyum asetat tamponu pH 5.2 hazırlanır. </li><li> % 40 ihtiva eden 2 x hibridizasyon tamponu hazırlayın sodyum dekstran sülfat, 20x BSA (w / v) 4x Tuzlu sodyum sitrat, 400 mM Vanadil ribonükleosit Kompleksi (VRC) (SSC) sistemleridir. </li><li> % 90 (h / h) gliserol,% 0.1 ihtiva eden montaj orta hazırlanması p-fenilendiamin (w / v) PBS pH 9&#39;dur. </li></ol></li><li> Taze hazırlanmış Çözümler <ol><li> % 3 taze hazırlanmış paraformaldehid PBS (PFA) oluşan sabitleyici çözeltisi hazırlayın. PBS içinde% 0.5 Triton-X-100 ihtiva eden besleyici çözeltiyi hazırlayın 2 mM VRC ile takviye edilmiştir. % 50 formamid (FA) ve 2x SSC karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın ve 7.2-7.4 pH ayarlamak. </li><li> 2X SSC 1 ug / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)&#39; den oluşan bir DNA karşı boyama çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> FISH için Hazırlama Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> lamelleri hücreler için, 5 m 1x PBS içinde hücreleri yıkayıniçinde. sabitleştirici 10 dakika oda sıcaklığında (% 3 PFA) çözümü için, slaytlar üzerinde lamelleri, ya da embriyonik bölümlerinde hücreleri saptamak. </li><li> 1x PBS ile hücreler üç kez durulayın. Buz üzerinde buz soğukluğunda permeabilizasyon çözeltisi içinde 5 dakika için hücreler geçirgenliği. hücreler% 70 etanol ile üç kez yıkayın. -20 ° C&#39;de% 70 etanol içerisinde 4-kayar bir taşıma kutusu içinde deposu 4 oyuklu plakalarda lamelleri ve slaytlar. NOT: Lameller ve slaytlar -20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca saklanabilir. Plakalar ve bunları ihtiva eden kutu etanol buharlaşmayı önlemek için parafilm ile kapatıldı gerekir. </li></ol></li><li> DNA probu Etiketleme <ol><li> floresan nükleotidler kullanılarak nick çeviri tarafından DNA probları etiketleyin. Üreticinin talimatlarına (Tablo 1) takip 8.. </li><li> (DNA amplifikasyonu için, 3.4.4 bakınız) 50 ul reaksiyon karışımı için, 1-2 plazmidi ug, bakteriyel suni kromozom (BAC) ya da birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) ekleyin, 17.5 ul su DNA 2.5 ul 0.2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 ul 10 mM her dNTP karışımı (dGTP, dATP, dCTP), 5 ul 10 mM dTTP, 5 ul 10x nick çeviri tampon ve 8 ul nick çeviri enzim. </li><li> karanlıkta 15 ° C &#39;de 16 saat süreyle inkübe edilir. -20 ° C&#39;de dondurma ile reaksiyona etkisiz hale getirirler. -20 ° C&#39;de ay depolanabilir Probes. </li><li> MDA Not: BAC DNA için klasik hazırlandıktan sonra elde edilen DNA miktarı düşüktür, bu nedenle bir MDA ile tanımlamadan önce, DNA amplifikasyon adımı kullanılabilir. Ticari kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına (Tablo 1) izleyin. </li><li> 9.5 ul numune tamponu ile 0.5 ul BAC DNA karıştırın. 95 ° C&#39;de 3 dakika ısıtın. Hemen buz üzerinde gidermek; Buz 10 dakika bekletin. Reaksiyon tamponu / enzim karışımı hazırlayın: (9.5 ul + 0.5 ul enzim karışımı) ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 10 ul DNA karışımı + 10 ul reaksiyon tampon / enzim karışımı karıştırın. 30 ° C&#39;de en az 20 saat inkübe edilir. 10 dakika 65 ° # ısıtma numunesi enzimi176 ° C. -20 ° C&#39;de depolamadan önce, 4 ° C&#39;ye soğutun örneği. </li><li> sindirimi ile MDA edin. 1 ul MDA 2 ul 10x tampon, 2 ul Hind III ve 15 ul H2O ekleme gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Doğru DNA amplifikasyon onaylamak için 0,8-1% agaroz jel üzerinde yavaş çalışmasına. Yüksek molekül ağırlıklı açık DNA fragmanları jel üzerinde gözlenmelidir. </li></ol></li><li> Probe Hazırlık <ol><li> lamel veya slayt başına 0,1 ya da 1 mcg prob kullanın. NOT: Yarışma, örneğin, çoğu sondalar gerekiyorsa, aksi takdirde çapraz olarak melezleşen tekrar dizileri içeren ve arka plan artırabilir olarak Cot-1 DNA 2-5 mikrogram ekleyin. <ol><li> çökelme için, 5 mg somon spermi DNA&#39;sı, 1/10 hacim 5.2 ve 3 hacim etanol 3 M sodyum asetat pH ekleyin. 16.000 x g&#39;de santrifüj ile 25 dakika boyunca 4 ° C. % 70 etanol ile pelet yıkayın ve 5 dakika boyunca tekrar aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> Bir yoğunlaştırıcı / hızlı vakumda 2 dakika için kuru pelet. % 100 şeklinde süspanseamid hibridizasyon için gerekli yarım hacminde (örneğin, lamel için 2.5 ul veya slayt embriyonik bölümler için 7 ul). Bir Thermomixer çalkalanarak 37 ° C&#39;de 30 dakika yerleştirin. 75 ° C&#39;de 7 dakika boyunca denatüre. </li><li> Yarışma, 30-60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doğrudan koymak gerekirse, buz üzerinde söndürülmüş, veya. 2x melezleştirme çözeltisi eşit hacimde prob çözeltisi karıştırın. </li></ol></li><li> Hibridizasyon ve yıkama <ol><li> kurutmak; Her biri 5 dakika için 1 x% 80, 1 x% 95 ve 2 x% 100 etanol içinde sıralı yıkama ile Coplin kavanoza kuyularda lamelleri, ve slaytlar. tamamen kuru lamelleri ve slaytlar. </li><li> melezleme için, melezleme karışımı içine bakacak hücreleri ile, bir slayt üzerine 5 ul prob hibridizasyon karışımı (3.5 bakınız) uygulamak ve lamel indirin. Slayt bölümler için, (3.5 bakınız) 14 ul prob hibridizasyon karışımı uygulayın ve 18 x 18 mm 2 lamel ile kaplayın. </li><li> nemli bir oda içinde yer slaytlar (doku kağıt ıslatılır50% F / 2X SSC) ve karanlıkta, gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon sonrası yıkamaların: <ol><li> gevşetmek için slayt lamel üzerine% 50 FA / 2x SSC 1 ml ekleyin; slayt dikkatlice lamel çıkarın ve% 50 FA / 2x SSC içeren bir 4-plaka içine o hücre tarafı yerleştirin (hücreleri kazımak için özen). slayt bölümlere için, benzer bir şekilde lamel çıkarın ve 50% F / 2X SSC içeren bir Coplin kavanoz slayt yerleştirin. </li><li> sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C&#39;de önceden ısıtılmış 50% F / 2x SSC ile 7 dakika boyunca 3 yıkama, her gerçekleştirin. </li><li> sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C &#39;de 5 dakika her biri için önceden ısıtılmış 2x SSC ile 3 yıkama yapın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI ile 2x SSC içinde yıkanarak çekirdek karşıt. 2X SSC ile iki kere yıkayın. </li></ol></li><li> Lameller ve Slaytlar montajı <ol><li> kültürlü TGCs küçük lamel için, 5 &amp; # uygulamak181; bir slayt montaj orta l. damla üstünde aşağı lamel hücre tarafı yerleştirin. </li><li> bölümleri ile slayt için, slayt montaj orta 15 ul uygulayın. Damla üstünde bir 22 x 22 mm2 lamel yerleştirin. </li><li> kabarcıkları kaçının. Fazla montaj çözümü siliniz. oje küçük bir miktar ile lamel mühür. Mümkünse, görüntü -20 ° C&#39;de birkaç ay hemen veya mağaza kadar için kayar. </li></ol></li></ol> 4. Mikroskopi ve Analiz <ol><li> Bir floresan mikroskop (63X objektif) kullanılarak 0.3 mikron 3D sıralı z ekseni görüntüler elde ve ImageJ yazılımı 14 kullanarak 3D görüntü yığınlarının analizi gerçekleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yeni oluşan RNA BALIK farklı gelişim aşamalarında embriyonik dokuda transkripsiyonel aktivitenin tek bir hücre analizi için kolay ve hassas bir yöntemi temsil eder. Bu yaklaşımın gücü morfolojik kriterlere göre herhangi bir aşamada farklı embriyo soy tespit kapasitesidir. Bununla birlikte bu aynı zamanda minimum eşiğe mevcut olmasını gerektirir. Herhangi bir arka plan farklı embriyonik bölgeleri ve zorlu hücre tiplerinin belirlenmesi vermektedir. Minimal bir arka plan sağlamak için, bu protokolde iki kritik adımlar vardır. İlk cryosection kalitesi ve ikinci gen ekspresyon seviyesi ve prob kalitesine bağlıdır RNA FISH, verimi (sinyal gürültü oranı) &#39;dir. İkincisi için, sondalar bu nedenle her zaman bölümlerinde kullanımdan önce lamelleri (embriyonik kök hücreler veya somatik hücre) ile kültürlenmiş hücreler üzerinde test edilmiştir. Bu protokol, biz th sağlamakE teknikleri iki farklı numune hazırlama türleri (kriyostat kesitleri ve embriyonik eksplant primer kültürlerinde) den TGCs üzerinde RNA BALIK analizi gerçekleştirmek için gerekli. Bu tür tek hücre analizi değerlendirilmesi gereken farklı post-implantasyon aşamalarında gen ifadesinde dinamik değişiklikleri sağlar. Biz (E7-7.5 implantasyon sonrası aşamalarında) orta TGCs oluşturmak için tarif yöntemleri implantasyon sonrası aşamalarında TGCs oluşmaktadır ekstra embriyonik soy X kromozomu inaktivasyonu kalıplarını incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. kemirgenlerde Ekstra embriyonik gelişim TGCs ayrımında bağlıdır. Nitekim, TGCs plasental ve böylece embriyonik gelişimi için gereklidir. TGC farklılaşmasında Kusurları embriyonik ölümcül (inceleme için başvuru 15) neden olur. RNA FISH kullanarak TGCs transkripsiyonel aktivite bize fare gelişimi 3 sırasında bu tür hücre tipinin alışılmadık bir X kromozomu inaktivasyonu durumunu göstermek için izin verdi. <p claP = &quot;jove_content&quot;&gt; elde edilir ve ikincil TGCs çalışma için sunulan yöntemler, normal ve mutant farelerde, hem de bir parçası olan önemli bir ekstra embriyonik dokuların gelişimi moleküler yolları okumak için uygulanabilir. Bu yaklaşımlar, diğer memelilerde TGC gelişimini incelemek için uyarlanabilir. Bizim analizimiz bize in vivo TGCs ve EPC eksplant elde edilen in vitro TGCs çeşitli genlerin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için izin vahşi tip fare embriyoları kullanımını içeriyordu. Bu yöntem, ve / veya kültür ortamı içinde, inhibitör moleküllerinin eklenmesi ile transgenik farelerin analizine genişletilebilir. Biz başarıyla gibi akıbet geliştirdi sırasında 4-5 gün boyunca ayrı ayrı kültüre olabilir fare geliştirme, E3.0 blastosist önceki bir aşamada görünen birincil TGCs gibi, TGCs Başka tip RNA FISH bu yöntemi kullandık ICM büyük birincil TGCs 16,17 tarafından çevrili olmak. Farklı için olgunlaşmamış transkripthem Xist genler görüntülenmiştir, aynı RNA FISH yaklaşımı 3 ile niceliksel olarak belirtilmiştir. Kombine immünofloresan ve RNA balık da, in vitro kültürlenmiş TGCs 3 gibi kriyostat kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu, birincil transkript bozunmaya çok hassastırlar ve RNaz içermeyen bileşiklerin mutlak bir gereklilik değildir yöntem olup özelliği, çok sağlam olduğunu gösterir. / RNA BALIK aynı anda belirli bir hücrede transkripsiyon seviyeleri, hücresel lokalizasyonu ve protein ifadesi, hakkında ek bilgi sağlar IF. Parafine gömülü doku kesitleri, daha önce elimizde, doku morfolojisi 18 muhafaza ederken, insan tümörlerinde Yeni oluşan RNA tespit etmek için kullanılmıştır rağmen, kriyostat kesitleri immünofloresan sırasında antikorların tespiti için gerekli oluşmakta olan RNA ve her iki epitopu da korumak için daha uygun olan . RNA, FISH ek olarak, im şumunofluorescence, kromozomal DNA, balık da RNA balık 3 için kullanılanlara benzer florokromlar ile işaretlenmiş problar kullanılarak sekonder TGCs gerçekleştirilebilir. Floresan probları ya da plazmidler / fosmids veya BAC&#39;ler, burada kullanılan floresan dUTPs ile etiketlenmiş ve Chaumeil ve diğ., 8&#39;de tarif olabilir. Seçenek olarak ise, floresan markajlı oligonükleotidlerin 19 kullanılabilir. DNA, FISH şerit spesifikliğini gerektirmediği için, oligonükleotid probları hedef bölgede iki tamamlayıcı şeritlerin hedeflemek üzere dizayn edilebilir. Sinyal amplifikasyon spesifik ve amplifikatör probların iki ardışık mermi elde dallı DNA probları, aynı zamanda FISH sinyallerini 20 bir sinyal-gürültü oranı arttırmak için kullanılabilir. Bizim DNA bazlı prob sinyal kalitesi, özgüllük ve kullanım kolaylığı arasında daha iyi bir dengeyi sağlamak, ancak alternatif olarak, örneğin riboprobes gibi RNA probları kullanılabilir. Son olarak, 3D görüntü acquisitibu büyük hücreler gerekli mekansal bilgi elde etmek için gereklidir ve böyle DeltaVision (GEH) olarak Dekonvolüsyonun böyle Apotome mikroskop olarak floresan mikroskop, ya da Epifloresans mikroskop kullanarak çeşitli yapılabilir, ya da diğer mikroskoplar uygun görüntüleme doku bölümleri, ve büyük için (&gt; 20 mikron) TGCs. Tek kopya DNA loci için, doğmakta olan RNA FISH veya DNA FISH ile tespit noktalı sinyal kolayca konfokal mikroskobu ile tespit edilemeyebilir dikkat edilmelidir. Sonuç olarak, burada açıklamak yöntemleri yararlı hem gelişimsel bir bağlamda TGS&#39;nin detaylı analiz için değil, aynı zamanda diğer hastalık durumlarında olmalıdır. Kemirgenlerde TGC gelişimi ve fonksiyonu katılan bir çok gen, kopyalama faktörleri, proteaz ve hücre adhezyon moleküllerinin 21 gibi kemirgenler ve insanlarda arasında muhafaza edilir. Fare TGCs plasenta gelişme, düzenleyen okuyan genler için bir hücre modeli vardırd nedenle insan plasental hastalıklar içgörüler verir. Dahası, bu hücreler endoreplicating ve bazı kanser hücreleri endocycle programları meşgul olduğundan, gen amplifikasyonu işlemlere ek olarak, tarif yöntemler de kanser hücrelerinin istikrarsızlığı genom neden mekanizmaları keşfetmek için gerekli olan tek bir hücre araştırmalarda yardımcı olması gerektiği gerçeğine .

Memeli trofoblast dev hücreler (TGCs) anne ve embriyonik dokular arasında bir bariyer oluşturur. Onlar rahim içine implantasyonu ve gebeliğin işgali aracılık ve plasenta oluşumu için gelişiminde kritik rol oynamaktadır. Onlar birkaç büyüme faktörleri (sitokinler) ve embriyonik büyüme ve hayatta kalmak için gerekli Prolaktin / plasenta laktojeni ailesi ve steroidler, hormonları üretir. TGCs ve G, değişken fazlarda ardışık oluşan bir hücre döngüsü, endocycle olan hücreleri, büyük tek çekirdekli ve poliploid bulunmaktadır. Gerçekten de, TGCs bir bölme 2 DNA sentez birden fazla tur geçmesi mümkün hücreleri endoreplicating edilir. Diğer embriyonik ve extraembryonic hücre tipleri ile karşılaştırıldığında TGCs in vivo genlerin transkripsiyonel durumunu incelemek için, Yeni oluşan RNA FISH implantasyon sonrası aşamalarında kriyostat kesitleri 3, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. TGCs nedeniyle thei için bölümlerinde kolayca tanınabilirr büyük boyutlu ve transkripsiyonel gen aktivitesi kaydedildi ancak erken post-implantasyon aşamalarında onların sayısı düşüktür edilebilir. E7 embriyonik bölümlerde TGCs azlığı, trofoektoderm gelişimi sırasında gen ifadesinin düzenlenmesi incelemek için farklılaştırılmış TGCs elde etmek embriyonik trophectodermal dokuların kısa vadeli kültürleri gerçekleştirmek için götürdü. yani trofoektoderm hücreleri (TS) kök Ayrıca, sırayla mümkün olduğunca fizyolojik olarak kalması, kurulan hücre hatları ikincil TGCs nedeniyle anormal gene TGCs hatalarına ile ilişkili patolojik gebelik incelemek için değerli bir araç sağlamak gelişim mekanizmaları Nesil araştırmak için her zaman uygun değildir farelerde düzenleme. Ectoplacental koni (EPC) trofoblast hücrelerin ikincil TGCs 4 öncüleridir. İkincil TGCs için kültür EPC spontan farklılaşma daha önce 5 bildirilmiştir. Ancak, birincil TGCs, ikincil TGC Farkli çalışmalarının aksinesokan presumablydue maternal veya embriyonik dokularda serbest EPC eksplantlar izole zorluklara, sınırlı kalmıştır. Biz E7, TGCs çok az, ancak EPC öncüleri elde edilebilir gelişimsel implantasyon sonrası aşamasında tek tek embriyodan türetilen ikincil TGCs ilgili RNA FISH gerçekleştirmek için, bu yöntemler adapte. Nükleer birincil transkript analiz RNA BALIK ikincil TGCs üzerinde tek hücre düzeyinde seviyesinde hiç yapılmamıştı. Bu transkripsiyon hassas analiz izin verir ve implantasyon sonrası aşamada 3&#39;te TGCs epigenetik instabilite göstermek için kullanılmıştır. Memelilerde epigenetik klasik bir örneği, X kromozomu inaktivasyonu (XCI) Heard laboratuarında 6 incelenmiştir. Bu işlemde dişi 2 X kromozomu bir inaktive edilir. Xist transkript kat bunun bir kadın hücrelerinde ifade edilir ve en çok genin susturulması tetikler edildiği X kromozomu kodlayıcı olmayan. RNA, FISH kullanılarak,X&#39;e bağlı genlerin olgunlaşmamış transkript olabildiğince incelenebilir inaktif X kromozomu (Xi) üzerine Xist RNA birikimi. Biz burada post-implantasyon embriyoların bölümlerinde ve EPC kısa vadeli kültürleri üzerinde RNA FISH gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Kadın embriyonik kök hücreleri ve preimplantasyon embriyolar 7-11 ayırıcı XCI incelemek için kullanılan edilenler uyarlanan Bu protokol. In vitro TGCs, hem de in vivo olarak bir kadın embriyolar XCI örnekler verilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:80px;">SMZ 1500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;">Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors Pascheff-Wolff</td>
			<td style="width:195px;">Moria</td>
			<td style="width:80px;">MC19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:195px;">Roth</td>
			<td style="width:80px;">PK78.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nunc</td>
			<td style="width:80px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 18x18&#160;</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 22x22</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm glass round coverslips&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:80px;">64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides Superfrost plus</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-slide Transport&#160; box&#160; Lockmailer</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>40684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryotubes 1.8 ml Corning&#160;</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>10418571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Coplin staining jars</td>
			<td style="width:195px;">Fischer Scientific</td>
			<td>W1561L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueTek O.C.T compound</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>10x&#160; is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Panreac Quimica, Spain</td>
			<td style="width:80px;">141451</td>
			<td>3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X-100&#160;&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td style="width:80px;">&#160;2000-A</td>
			<td>0.5% final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>S1402S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dextran sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160; (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671-1L-F</td>
			<td>&#160;aliquots kept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Illustra TempliPhi&#160; Kit Construct (Kit MDA)</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>25-6400-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nick translation kit</td>
			<td style="width:195px;">Abbott, USA</td>
			<td>07J00-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x SSC buffer concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum green dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N32-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum red dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N34-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy-5 dUTP&#160;</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>PA55022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18440016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DNA, MB grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>DNA from fish sperm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td>molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquiport Liquid pump</td>
			<td colspan="2">KNF Neuberger, Trenton, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shake&#39;N&#39;Bake Hybridization oven</td>
			<td>Boekel Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:80px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

Plasenta bir ekstra-embriyonik soyundan, ilkel trofoblast türemiştir. iç hücre kütlesi örten kutup trofoektoderm sonra ikincil TGCs içine farklılaşma çoğalmaya devam ederken peri-implantasyon fare blastosist olarak, duvar trofoektoderm hücreleri birincil trofoblast dev hücreler (TGCs) içine ayırt. TGCs olan plasentadan önemli bir rol oynayabilir ve başarılı bir gebelik için gereklidir. implantasyon sonrası gelişimi sırasında spesifik genlerin transkripsiyonel regülasyonu İncelenmesi TGCs gelişimi anlayışlar verebilir. Kutup ilkel trofoblast türetilen gebelik (E7-7.5) arasında 7-7.5 gün embriyolardan ectoplacental koni (EPC), hücreleri, ikincil TGCs 1 içine ayırt. TGCs sayısı, bu aşamada çok düşük olmasına rağmen TGCs E7 embriyo kriyostat kesitleri üzerinde in situ olarak incelenebilir. İkincil TGCs analiz için alternatif bir yöntem E7 embriyo bireysel EPC kısa dönem kültürleri kullanmaktırs. Biz in vivo ve doğmakta olan transkript görselleştirmek için in situ hibridizasyon (RNA FISH) floresan kullanılarak tek hücre düzeyinde in vitro hem de ilgi genlerin transkripsiyonel durumunu araştırmak için bir teknik önermek. Bu teknik, gen ekspresyonunun doğrudan okunmasını sağlar ve büyük endoreplicating hücreleridir TGCs kromozomal durumu değerlendirilmesini sağlar. Gerçekten de, TGCs farklılaşması önemli bir özelliği, hücre döngüsü çıkıp endoreplication.This yaklaşım birden fazla tur tabi otozomal ve / veya cinsiyet kromozomları ifade edilen herhangi bir genin ekspresyonunu tespit etmek için uygulanabilir ve gelişim ilgili önemli bilgiler sağlar olmasıdır mekanizmaları olarak plasental hastalıklar.

TGCs sebebi, hamile lokalizasyonlarında ve büyük bir boyuta DAPI boyama ile E7 bölümleri tespit edilebilir. Bu, uzunlamasına bir bölümü Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. RNA BALIK bu ekstra embriyonik soy X kromozomunun inaktivasyon incelemek için bu tür embriyonik bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. Çeşitli slayt veya lamelleri aynı anda işlenebilir. farklı genlerin RNA etiket farklı boya kullanılarak, tek bir aynı çekirdek içinde farklı bir birincil transkript tespit edebilir. Örnek Xist SG (yeşil sinyali) ve SR (kırmızı sinyal) bağlanmış Ldşftkrd bağlanmış olan en az 2 Probes, birbirine karıştırılabilmektedir. Bir dişi TGC bir örneği, 2 diğer soylar almaktadır Şekil 1B, uygun bir embriyo (E) ve iç organ endoderm (VE) &#39;de gösterilmiştir. Bir TGC çekirdeği Xist RNA X chrom kaplama ile gösteriliraktif diğer X kromozomu (Xa) birkaç saptar görüntüler ise (Xi) inaktive olan osome. X-bağlantılı gen XÍmkdmchq primer transkript endoreplication nedeniyle birkaç kopya halinde (değil Xist ile dekore edilmiş) aktif X kromozomdan ifade edilmiştir. Bu monoallelik ifade örneğin, bir X kromozomu üzerinde Ldşftkrd inaktivasyonunu gösterir. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, TGCs boyutu heterojen olduğundan, sadece en büyük olanlar kaydedilir. İkincil TGCs Şekil 2C&#39;de gösterildiği gibi, üç problar da kullanılabilir. Bu durumda, Xist -SG (yeşil), iki X-bağlantılı genler G6PD -SR (kırmızı) ve Huwe1 Cy (kırmızı) aynı çekirdek içinde aynı anda analiz edildi. G6PD monoallelically burada gösterildiği gibi ifade edilen (ve daha önce sekonder TGCs gösterilen 3) iken Huwe1 biallelically onun PR gösteren ifade ediliroperty XCI kaçmak için. Birkaç saptar, doğmakta olan transkript kopyaları yani ile Endoreplication, aynı zamanda açıktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> E7 kadın embriyonik bölümünden TGCs Şekil 1. İlköğretim transkript ifadesi. (A) DAPI ile boyandı E7 gebeliğin Boyuna kesit. Embriyo ve ekstra-embriyonik dokular anne dokusu, desidua ile çevrilidir. farklı soy lokalizasyonu 5X amacı ile DAPI boyama üzerine yapılır. TGCs büyük boyutları nedeniyle tanımlanır. Ch, koryon, E, embriyo, EPC, ectoplacental koni, VE, visseral endoderm, TGC, trofoblast dev hücreler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) (63X objektif) olarak kutulu-in alanının yüksek büyütme RNA BALIK. XÍmkdmchq birincil transkript kırmızı ve Xist RNA yeşil 3 soy = E görselleştirilebilir, TGC TİC. scale bar 10 mikron =. Xist -kaplı X kromozomunda bir in vivo XÍmkdmchq monoallelically ifade edilir TGC (Xa, ok başı) ve sessiz (XI) Örnek; Xa görülen birkaç XÍmkdmchq sinyalleri endoreplication kaynaklanmaktadır. XÍmkdmchq = BAC klonu RP23-260I15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> EPC türetilmiş ikincil TGCs Şekil 2. Primer transkript ifadesi. (A) İkincil TGCs (x5 objektif) büyüyen genel görünümü. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) Asterisk boyutları (10X objektif) göre TGCs örneğini göstermektedir. Ölçek çubuğu 60 mikron =. 3 probları kullanılarak ikinci bir kadın TGC RNA balık (C), Örnek (Xist domaXi) () kırmızı ve kırmızı birkaç saptar, G6PD ve Huwe1 birincil transkript endoreplication gösterilen: yeşil, inaktive X kromozomunu kapsayan. G6PD monoallelically ifade edilirken, Huwe1 sentezleme Bu çekirdeğinde bialelik olan Huwe1 = BAC klonu RP24-157H12;. G6PD = BAC klonu RP23-13D21. Xi = ok; Xa = ok (63X objektif). Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants at JoVE.com

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Görüntüleme.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

Vitro Simüle mikrogravite altında fare Preantral follikül gelişimi

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...