Biz resimli yardım için Sophie gournet teşekkür Julie Chaumeil el yazması, hayvan barınma tesisi ve Birim görüntüleme platformu okumak için. Bu çalışma programı «Investissements d&#39;Avenir» altında destek alan referanslar ANR-10-LABX-0044 ve ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, EpiGeneSys 7.ÇP hayır ile Fransız Hükümeti tarafından başlatılan ve ANR tarafından uygulamaya koymuştur. EH mükemmellik 257.082 Ağ, bir ERC Advanced Araştırmacı hayır ödül. 250.367 ve AB 7.ÇP SYBOSS hiçbir hibe. 242.129 EH yazarlar ışık yardım için Institut Curie, Fransa-Biyogörüntüleme (ANR-10-InSb-04) üyesi, ve Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü (UMR3215 / U934) Hücre ve Doku Görüntüleme Platformu kabul etmek istiyorum mikroskopi.

Hayvan prosedürleri onaylı kurumsal hayvan bakımı göre yapılan ve Institut Curie (CEEA-IC) protokolleri (C 75-05-18) komitesini kullanmak bulundu. çalışmaları da Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar (anlaşma numarası 5549CA-I) kullanımı için Yükseköğretim ve Araştırma Fransız Bakanlığı onayı altında yapılmıştır. Kriyostat Bölüm 1. hazırlanması <ol><li> Shea ve arkadaşları., 12 de tarif edildiği gibi, doğal olarak F1 C57BL / 6 x DBA / 2J fareler yumurtlama embriyolar toplayın. gebelik (E7) 7. gününde, servikal dislokasyon ile 8-12 haftalık fare kurban. Tüm konseptus yani desidua 12 toplayın. </li><li> Shea ve arkadaşları de tarif edildiği gibi, E7 conceptuses izole edin. 12. PBS içeren bir 60 mm Petri kabı koyun. </li><li> kriyostat bölümleri için E7, fare konseptus dondurun. <ol><li> 1cm yüksekliğinde uyarlanmış alüminyum folyo kuyuları hazırlayın ( &#39;ev yapımı&#39; bir cam Pasteur pip kullanarakEt). bu küçük kabın altındaki doku dondurma orta bir damla bırakın. Doğru yönde konseptus birikintisi (örn, boyuna kesitler için konseptus yatay oryantasyonda muhafaza edilmelidir). </li><li> Doku ortamı dondurma iyi içeren konseptus doldurun. Daha sonra, beyaz olana kadar bir kaç saniye için sıvı N2 içinde blok daldırın - yavaş yavaş dondurma izin vermek için sıvı N2 üzerindeki buhar forseps ile askıya alınması. Daha sonra, (bir kaç ay için depolayabilir) -80 ° C&#39;de bir dondurucu şişe ve deposuna blok aktarın. </li></ol></li><li> kriyo-ayırma önce, 30 dakika süre ile kriyostat -20 ° C&#39;de konseptus içeren dondurulmuş blok yerleştirin. 8 mikron kalınlığında cryosections gerçekleştirin. bir slayt Mevduat 4 bölümler verimli eki sağlamaktır. Yeri bölümleri 18 x 18 mm 2 lamel altına sığacak kadar kapatın. </li><li> kalitesini kontrol edinBölümler (sağlam ve çizilmelere olmaksızın) ve bir stereomikroskop ile embriyo (boyuna kesit) yönlendirilmesi ve daha fazla analiz için müsait bölümler seçin. Mümkün olduğu kadar çabuk bir coplin kavanoza onları yatırmak ve RNA FISH (3.3.2 bakınız) gerçekleştirin. </li></ol> İkincil TGCs 2. hazırlanması <ol><li> Conceptus (1.1 ve 1.2) izole eder. </li><li> E7 Ectoplacental Cone (EPC) teşrih <ol><li> Stereomikroskopta ve steril PBS içeren Petri kapları kullanın. forseps ile desidua teşrih. Pierce örnek ve açık forseps ayrı desidua iki yakasını gözyaşı. </li><li> embriyo dışarı kabuk. Bir makas benzeri eylem kapalı ince forseps (Dumont No. 5) kullanılması uçları uygun embriyo EPC ayırmak için. Anne dokusundan yanı sıra koryon ve yolk kesesi ayrı, mükemmel temiz numune elde etmek için özel dikkat gösterin. PBS EPC eksplantlar yıkayın. </li><li> Biraz kaşıkla, bir 4-wel bireysel Diseke EPC transferiorta steril lamel içeren l plaka. </li></ol></li><li> EPC Kısa vadeli Kültürler gelen TGCs türevi. <ol><li> lamelleri içeren 4-oyuklu plakalar hazırlamak. alev sonra kurutma, etanol içinde daldırarak cam lameller hafta 12 mm çaplı sterilize edin. </li><li> Her bir oyuğa 0.5 ml EPC orta ekleyin (EPC ortamı: RPMI 1640,% 15 FCS, 0.1 mM 2-mersaptoetanol ve antibiyotik ile takviye edilmiştir). </li><li> Deposit, tek bir kültür ortamı ile birlikte iyi olarak lamel merkezinde kesilerek-EPC. cam lamel üzerinde EPC uygulamak için ince forseps kullanın. 37 ° C&#39;de 3-5 gün Culturefor,% 5 CO2. Bağımsız eksplant düzleştirilmiş TGCs (Şekil 2A) bir tek tabaka olarak yayılan bir gelişimini oluşturur. </li></ol></li></ol> 3. RNA BALIK Not:. Protokolleri Chaumeil ve arkadaşları, 8 ve baş ve duyulan 13 (ESCs) embriyonik kök hücreleri için tarif edilen dayanmaktadır. <ol><li> Gelişmiş PrepaStok Çözümleri rasyon <ol><li> 3M sodyum asetat tamponu pH 5.2 hazırlanır. </li><li> % 40 ihtiva eden 2 x hibridizasyon tamponu hazırlayın sodyum dekstran sülfat, 20x BSA (w / v) 4x Tuzlu sodyum sitrat, 400 mM Vanadil ribonükleosit Kompleksi (VRC) (SSC) sistemleridir. </li><li> % 90 (h / h) gliserol,% 0.1 ihtiva eden montaj orta hazırlanması p-fenilendiamin (w / v) PBS pH 9&#39;dur. </li></ol></li><li> Taze hazırlanmış Çözümler <ol><li> % 3 taze hazırlanmış paraformaldehid PBS (PFA) oluşan sabitleyici çözeltisi hazırlayın. PBS içinde% 0.5 Triton-X-100 ihtiva eden besleyici çözeltiyi hazırlayın 2 mM VRC ile takviye edilmiştir. % 50 formamid (FA) ve 2x SSC karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın ve 7.2-7.4 pH ayarlamak. </li><li> 2X SSC 1 ug / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)&#39; den oluşan bir DNA karşı boyama çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> FISH için Hazırlama Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> lamelleri hücreler için, 5 m 1x PBS içinde hücreleri yıkayıniçinde. sabitleştirici 10 dakika oda sıcaklığında (% 3 PFA) çözümü için, slaytlar üzerinde lamelleri, ya da embriyonik bölümlerinde hücreleri saptamak. </li><li> 1x PBS ile hücreler üç kez durulayın. Buz üzerinde buz soğukluğunda permeabilizasyon çözeltisi içinde 5 dakika için hücreler geçirgenliği. hücreler% 70 etanol ile üç kez yıkayın. -20 ° C&#39;de% 70 etanol içerisinde 4-kayar bir taşıma kutusu içinde deposu 4 oyuklu plakalarda lamelleri ve slaytlar. NOT: Lameller ve slaytlar -20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca saklanabilir. Plakalar ve bunları ihtiva eden kutu etanol buharlaşmayı önlemek için parafilm ile kapatıldı gerekir. </li></ol></li><li> DNA probu Etiketleme <ol><li> floresan nükleotidler kullanılarak nick çeviri tarafından DNA probları etiketleyin. Üreticinin talimatlarına (Tablo 1) takip 8.. </li><li> (DNA amplifikasyonu için, 3.4.4 bakınız) 50 ul reaksiyon karışımı için, 1-2 plazmidi ug, bakteriyel suni kromozom (BAC) ya da birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) ekleyin, 17.5 ul su DNA 2.5 ul 0.2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 ul 10 mM her dNTP karışımı (dGTP, dATP, dCTP), 5 ul 10 mM dTTP, 5 ul 10x nick çeviri tampon ve 8 ul nick çeviri enzim. </li><li> karanlıkta 15 ° C &#39;de 16 saat süreyle inkübe edilir. -20 ° C&#39;de dondurma ile reaksiyona etkisiz hale getirirler. -20 ° C&#39;de ay depolanabilir Probes. </li><li> MDA Not: BAC DNA için klasik hazırlandıktan sonra elde edilen DNA miktarı düşüktür, bu nedenle bir MDA ile tanımlamadan önce, DNA amplifikasyon adımı kullanılabilir. Ticari kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına (Tablo 1) izleyin. </li><li> 9.5 ul numune tamponu ile 0.5 ul BAC DNA karıştırın. 95 ° C&#39;de 3 dakika ısıtın. Hemen buz üzerinde gidermek; Buz 10 dakika bekletin. Reaksiyon tamponu / enzim karışımı hazırlayın: (9.5 ul + 0.5 ul enzim karışımı) ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 10 ul DNA karışımı + 10 ul reaksiyon tampon / enzim karışımı karıştırın. 30 ° C&#39;de en az 20 saat inkübe edilir. 10 dakika 65 ° # ısıtma numunesi enzimi176 ° C. -20 ° C&#39;de depolamadan önce, 4 ° C&#39;ye soğutun örneği. </li><li> sindirimi ile MDA edin. 1 ul MDA 2 ul 10x tampon, 2 ul Hind III ve 15 ul H2O ekleme gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Doğru DNA amplifikasyon onaylamak için 0,8-1% agaroz jel üzerinde yavaş çalışmasına. Yüksek molekül ağırlıklı açık DNA fragmanları jel üzerinde gözlenmelidir. </li></ol></li><li> Probe Hazırlık <ol><li> lamel veya slayt başına 0,1 ya da 1 mcg prob kullanın. NOT: Yarışma, örneğin, çoğu sondalar gerekiyorsa, aksi takdirde çapraz olarak melezleşen tekrar dizileri içeren ve arka plan artırabilir olarak Cot-1 DNA 2-5 mikrogram ekleyin. <ol><li> çökelme için, 5 mg somon spermi DNA&#39;sı, 1/10 hacim 5.2 ve 3 hacim etanol 3 M sodyum asetat pH ekleyin. 16.000 x g&#39;de santrifüj ile 25 dakika boyunca 4 ° C. % 70 etanol ile pelet yıkayın ve 5 dakika boyunca tekrar aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> Bir yoğunlaştırıcı / hızlı vakumda 2 dakika için kuru pelet. % 100 şeklinde süspanseamid hibridizasyon için gerekli yarım hacminde (örneğin, lamel için 2.5 ul veya slayt embriyonik bölümler için 7 ul). Bir Thermomixer çalkalanarak 37 ° C&#39;de 30 dakika yerleştirin. 75 ° C&#39;de 7 dakika boyunca denatüre. </li><li> Yarışma, 30-60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doğrudan koymak gerekirse, buz üzerinde söndürülmüş, veya. 2x melezleştirme çözeltisi eşit hacimde prob çözeltisi karıştırın. </li></ol></li><li> Hibridizasyon ve yıkama <ol><li> kurutmak; Her biri 5 dakika için 1 x% 80, 1 x% 95 ve 2 x% 100 etanol içinde sıralı yıkama ile Coplin kavanoza kuyularda lamelleri, ve slaytlar. tamamen kuru lamelleri ve slaytlar. </li><li> melezleme için, melezleme karışımı içine bakacak hücreleri ile, bir slayt üzerine 5 ul prob hibridizasyon karışımı (3.5 bakınız) uygulamak ve lamel indirin. Slayt bölümler için, (3.5 bakınız) 14 ul prob hibridizasyon karışımı uygulayın ve 18 x 18 mm 2 lamel ile kaplayın. </li><li> nemli bir oda içinde yer slaytlar (doku kağıt ıslatılır50% F / 2X SSC) ve karanlıkta, gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon sonrası yıkamaların: <ol><li> gevşetmek için slayt lamel üzerine% 50 FA / 2x SSC 1 ml ekleyin; slayt dikkatlice lamel çıkarın ve% 50 FA / 2x SSC içeren bir 4-plaka içine o hücre tarafı yerleştirin (hücreleri kazımak için özen). slayt bölümlere için, benzer bir şekilde lamel çıkarın ve 50% F / 2X SSC içeren bir Coplin kavanoz slayt yerleştirin. </li><li> sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C&#39;de önceden ısıtılmış 50% F / 2x SSC ile 7 dakika boyunca 3 yıkama, her gerçekleştirin. </li><li> sırasıyla lamel veya slayt 42 ° C ya da 44 ° C &#39;de 5 dakika her biri için önceden ısıtılmış 2x SSC ile 3 yıkama yapın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI ile 2x SSC içinde yıkanarak çekirdek karşıt. 2X SSC ile iki kere yıkayın. </li></ol></li><li> Lameller ve Slaytlar montajı <ol><li> kültürlü TGCs küçük lamel için, 5 &amp; # uygulamak181; bir slayt montaj orta l. damla üstünde aşağı lamel hücre tarafı yerleştirin. </li><li> bölümleri ile slayt için, slayt montaj orta 15 ul uygulayın. Damla üstünde bir 22 x 22 mm2 lamel yerleştirin. </li><li> kabarcıkları kaçının. Fazla montaj çözümü siliniz. oje küçük bir miktar ile lamel mühür. Mümkünse, görüntü -20 ° C&#39;de birkaç ay hemen veya mağaza kadar için kayar. </li></ol></li></ol> 4. Mikroskopi ve Analiz <ol><li> Bir floresan mikroskop (63X objektif) kullanılarak 0.3 mikron 3D sıralı z ekseni görüntüler elde ve ImageJ yazılımı 14 kullanarak 3D görüntü yığınlarının analizi gerçekleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yeni oluşan RNA BALIK farklı gelişim aşamalarında embriyonik dokuda transkripsiyonel aktivitenin tek bir hücre analizi için kolay ve hassas bir yöntemi temsil eder. Bu yaklaşımın gücü morfolojik kriterlere göre herhangi bir aşamada farklı embriyo soy tespit kapasitesidir. Bununla birlikte bu aynı zamanda minimum eşiğe mevcut olmasını gerektirir. Herhangi bir arka plan farklı embriyonik bölgeleri ve zorlu hücre tiplerinin belirlenmesi vermektedir. Minimal bir arka plan sağlamak için, bu protokolde iki kritik adımlar vardır. İlk cryosection kalitesi ve ikinci gen ekspresyon seviyesi ve prob kalitesine bağlıdır RNA FISH, verimi (sinyal gürültü oranı) &#39;dir. İkincisi için, sondalar bu nedenle her zaman bölümlerinde kullanımdan önce lamelleri (embriyonik kök hücreler veya somatik hücre) ile kültürlenmiş hücreler üzerinde test edilmiştir. Bu protokol, biz th sağlamakE teknikleri iki farklı numune hazırlama türleri (kriyostat kesitleri ve embriyonik eksplant primer kültürlerinde) den TGCs üzerinde RNA BALIK analizi gerçekleştirmek için gerekli. Bu tür tek hücre analizi değerlendirilmesi gereken farklı post-implantasyon aşamalarında gen ifadesinde dinamik değişiklikleri sağlar. Biz (E7-7.5 implantasyon sonrası aşamalarında) orta TGCs oluşturmak için tarif yöntemleri implantasyon sonrası aşamalarında TGCs oluşmaktadır ekstra embriyonik soy X kromozomu inaktivasyonu kalıplarını incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. kemirgenlerde Ekstra embriyonik gelişim TGCs ayrımında bağlıdır. Nitekim, TGCs plasental ve böylece embriyonik gelişimi için gereklidir. TGC farklılaşmasında Kusurları embriyonik ölümcül (inceleme için başvuru 15) neden olur. RNA FISH kullanarak TGCs transkripsiyonel aktivite bize fare gelişimi 3 sırasında bu tür hücre tipinin alışılmadık bir X kromozomu inaktivasyonu durumunu göstermek için izin verdi. <p claP = &quot;jove_content&quot;&gt; elde edilir ve ikincil TGCs çalışma için sunulan yöntemler, normal ve mutant farelerde, hem de bir parçası olan önemli bir ekstra embriyonik dokuların gelişimi moleküler yolları okumak için uygulanabilir. Bu yaklaşımlar, diğer memelilerde TGC gelişimini incelemek için uyarlanabilir. Bizim analizimiz bize in vivo TGCs ve EPC eksplant elde edilen in vitro TGCs çeşitli genlerin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için izin vahşi tip fare embriyoları kullanımını içeriyordu. Bu yöntem, ve / veya kültür ortamı içinde, inhibitör moleküllerinin eklenmesi ile transgenik farelerin analizine genişletilebilir. Biz başarıyla gibi akıbet geliştirdi sırasında 4-5 gün boyunca ayrı ayrı kültüre olabilir fare geliştirme, E3.0 blastosist önceki bir aşamada görünen birincil TGCs gibi, TGCs Başka tip RNA FISH bu yöntemi kullandık ICM büyük birincil TGCs 16,17 tarafından çevrili olmak. Farklı için olgunlaşmamış transkripthem Xist genler görüntülenmiştir, aynı RNA FISH yaklaşımı 3 ile niceliksel olarak belirtilmiştir. Kombine immünofloresan ve RNA balık da, in vitro kültürlenmiş TGCs 3 gibi kriyostat kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu, birincil transkript bozunmaya çok hassastırlar ve RNaz içermeyen bileşiklerin mutlak bir gereklilik değildir yöntem olup özelliği, çok sağlam olduğunu gösterir. / RNA BALIK aynı anda belirli bir hücrede transkripsiyon seviyeleri, hücresel lokalizasyonu ve protein ifadesi, hakkında ek bilgi sağlar IF. Parafine gömülü doku kesitleri, daha önce elimizde, doku morfolojisi 18 muhafaza ederken, insan tümörlerinde Yeni oluşan RNA tespit etmek için kullanılmıştır rağmen, kriyostat kesitleri immünofloresan sırasında antikorların tespiti için gerekli oluşmakta olan RNA ve her iki epitopu da korumak için daha uygun olan . RNA, FISH ek olarak, im şumunofluorescence, kromozomal DNA, balık da RNA balık 3 için kullanılanlara benzer florokromlar ile işaretlenmiş problar kullanılarak sekonder TGCs gerçekleştirilebilir. Floresan probları ya da plazmidler / fosmids veya BAC&#39;ler, burada kullanılan floresan dUTPs ile etiketlenmiş ve Chaumeil ve diğ., 8&#39;de tarif olabilir. Seçenek olarak ise, floresan markajlı oligonükleotidlerin 19 kullanılabilir. DNA, FISH şerit spesifikliğini gerektirmediği için, oligonükleotid probları hedef bölgede iki tamamlayıcı şeritlerin hedeflemek üzere dizayn edilebilir. Sinyal amplifikasyon spesifik ve amplifikatör probların iki ardışık mermi elde dallı DNA probları, aynı zamanda FISH sinyallerini 20 bir sinyal-gürültü oranı arttırmak için kullanılabilir. Bizim DNA bazlı prob sinyal kalitesi, özgüllük ve kullanım kolaylığı arasında daha iyi bir dengeyi sağlamak, ancak alternatif olarak, örneğin riboprobes gibi RNA probları kullanılabilir. Son olarak, 3D görüntü acquisitibu büyük hücreler gerekli mekansal bilgi elde etmek için gereklidir ve böyle DeltaVision (GEH) olarak Dekonvolüsyonun böyle Apotome mikroskop olarak floresan mikroskop, ya da Epifloresans mikroskop kullanarak çeşitli yapılabilir, ya da diğer mikroskoplar uygun görüntüleme doku bölümleri, ve büyük için (&gt; 20 mikron) TGCs. Tek kopya DNA loci için, doğmakta olan RNA FISH veya DNA FISH ile tespit noktalı sinyal kolayca konfokal mikroskobu ile tespit edilemeyebilir dikkat edilmelidir. Sonuç olarak, burada açıklamak yöntemleri yararlı hem gelişimsel bir bağlamda TGS&#39;nin detaylı analiz için değil, aynı zamanda diğer hastalık durumlarında olmalıdır. Kemirgenlerde TGC gelişimi ve fonksiyonu katılan bir çok gen, kopyalama faktörleri, proteaz ve hücre adhezyon moleküllerinin 21 gibi kemirgenler ve insanlarda arasında muhafaza edilir. Fare TGCs plasenta gelişme, düzenleyen okuyan genler için bir hücre modeli vardırd nedenle insan plasental hastalıklar içgörüler verir. Dahası, bu hücreler endoreplicating ve bazı kanser hücreleri endocycle programları meşgul olduğundan, gen amplifikasyonu işlemlere ek olarak, tarif yöntemler de kanser hücrelerinin istikrarsızlığı genom neden mekanizmaları keşfetmek için gerekli olan tek bir hücre araştırmalarda yardımcı olması gerektiği gerçeğine .

Memeli trofoblast dev hücreler (TGCs) anne ve embriyonik dokular arasında bir bariyer oluşturur. Onlar rahim içine implantasyonu ve gebeliğin işgali aracılık ve plasenta oluşumu için gelişiminde kritik rol oynamaktadır. Onlar birkaç büyüme faktörleri (sitokinler) ve embriyonik büyüme ve hayatta kalmak için gerekli Prolaktin / plasenta laktojeni ailesi ve steroidler, hormonları üretir. TGCs ve G, değişken fazlarda ardışık oluşan bir hücre döngüsü, endocycle olan hücreleri, büyük tek çekirdekli ve poliploid bulunmaktadır. Gerçekten de, TGCs bir bölme 2 DNA sentez birden fazla tur geçmesi mümkün hücreleri endoreplicating edilir. Diğer embriyonik ve extraembryonic hücre tipleri ile karşılaştırıldığında TGCs in vivo genlerin transkripsiyonel durumunu incelemek için, Yeni oluşan RNA FISH implantasyon sonrası aşamalarında kriyostat kesitleri 3, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. TGCs nedeniyle thei için bölümlerinde kolayca tanınabilirr büyük boyutlu ve transkripsiyonel gen aktivitesi kaydedildi ancak erken post-implantasyon aşamalarında onların sayısı düşüktür edilebilir. E7 embriyonik bölümlerde TGCs azlığı, trofoektoderm gelişimi sırasında gen ifadesinin düzenlenmesi incelemek için farklılaştırılmış TGCs elde etmek embriyonik trophectodermal dokuların kısa vadeli kültürleri gerçekleştirmek için götürdü. yani trofoektoderm hücreleri (TS) kök Ayrıca, sırayla mümkün olduğunca fizyolojik olarak kalması, kurulan hücre hatları ikincil TGCs nedeniyle anormal gene TGCs hatalarına ile ilişkili patolojik gebelik incelemek için değerli bir araç sağlamak gelişim mekanizmaları Nesil araştırmak için her zaman uygun değildir farelerde düzenleme. Ectoplacental koni (EPC) trofoblast hücrelerin ikincil TGCs 4 öncüleridir. İkincil TGCs için kültür EPC spontan farklılaşma daha önce 5 bildirilmiştir. Ancak, birincil TGCs, ikincil TGC Farkli çalışmalarının aksinesokan presumablydue maternal veya embriyonik dokularda serbest EPC eksplantlar izole zorluklara, sınırlı kalmıştır. Biz E7, TGCs çok az, ancak EPC öncüleri elde edilebilir gelişimsel implantasyon sonrası aşamasında tek tek embriyodan türetilen ikincil TGCs ilgili RNA FISH gerçekleştirmek için, bu yöntemler adapte. Nükleer birincil transkript analiz RNA BALIK ikincil TGCs üzerinde tek hücre düzeyinde seviyesinde hiç yapılmamıştı. Bu transkripsiyon hassas analiz izin verir ve implantasyon sonrası aşamada 3&#39;te TGCs epigenetik instabilite göstermek için kullanılmıştır. Memelilerde epigenetik klasik bir örneği, X kromozomu inaktivasyonu (XCI) Heard laboratuarında 6 incelenmiştir. Bu işlemde dişi 2 X kromozomu bir inaktive edilir. Xist transkript kat bunun bir kadın hücrelerinde ifade edilir ve en çok genin susturulması tetikler edildiği X kromozomu kodlayıcı olmayan. RNA, FISH kullanılarak,X&#39;e bağlı genlerin olgunlaşmamış transkript olabildiğince incelenebilir inaktif X kromozomu (Xi) üzerine Xist RNA birikimi. Biz burada post-implantasyon embriyoların bölümlerinde ve EPC kısa vadeli kültürleri üzerinde RNA FISH gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Kadın embriyonik kök hücreleri ve preimplantasyon embriyolar 7-11 ayırıcı XCI incelemek için kullanılan edilenler uyarlanan Bu protokol. In vitro TGCs, hem de in vivo olarak bir kadın embriyolar XCI örnekler verilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td>MC19</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Roth</td><td>PK78.1</td><td></td></tr><tr><td>4-well tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 18 mm x 18 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass round coverslips&amp;nbsp;</td><td>Harvard apparatus</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Slides Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>4-slide Transport&amp;nbsp; box&amp;nbsp; Lockmailer</td><td>Dutsher, France</td><td>40684</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes 1.8 ml Corning&amp;nbsp;</td><td>Fisher Science</td><td>10418571</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jars</td><td>Fischer Scientific</td><td>W1561L</td><td></td></tr><tr><td>TissueTek O.C.T compound</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10x&amp;nbsp; is used</td></tr><tr><td>Water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Panreac Quimica, Spain</td><td>141451</td><td>3% in PBS</td></tr><tr><td>Triton-X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>&amp;nbsp;2000-A</td><td>0.5% final</td></tr><tr><td>Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dextran sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp; (BSA)</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td>&amp;nbsp;aliquots kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Illustra TempliPhi&amp;nbsp; Kit Construct (Kit MDA)</td><td>Dutsher, France</td><td>25-6400-80</td><td></td></tr><tr><td>Nick translation kit</td><td>Abbott, USA</td><td>07J00-001</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S6639</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum green dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N32-050</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum red dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N34-050</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 dUTP&amp;nbsp;</td><td>Dutsher, France</td><td>PA55022</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440016</td><td></td></tr><tr><td>DNA, MB grade</td><td>Invitrogen</td><td>Roche</td><td>DNA from fish sperm</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695106</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>Eppendorf concentrator plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquiport Liquid pump</td><td>KNF Neuberger, Trenton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake&#039;N&#039;Bake Hybridization oven</td><td>Boekel Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

Plasenta bir ekstra-embriyonik soyundan, ilkel trofoblast türemiştir. iç hücre kütlesi örten kutup trofoektoderm sonra ikincil TGCs içine farklılaşma çoğalmaya devam ederken peri-implantasyon fare blastosist olarak, duvar trofoektoderm hücreleri birincil trofoblast dev hücreler (TGCs) içine ayırt. TGCs olan plasentadan önemli bir rol oynayabilir ve başarılı bir gebelik için gereklidir. implantasyon sonrası gelişimi sırasında spesifik genlerin transkripsiyonel regülasyonu İncelenmesi TGCs gelişimi anlayışlar verebilir. Kutup ilkel trofoblast türetilen gebelik (E7-7.5) arasında 7-7.5 gün embriyolardan ectoplacental koni (EPC), hücreleri, ikincil TGCs 1 içine ayırt. TGCs sayısı, bu aşamada çok düşük olmasına rağmen TGCs E7 embriyo kriyostat kesitleri üzerinde in situ olarak incelenebilir. İkincil TGCs analiz için alternatif bir yöntem E7 embriyo bireysel EPC kısa dönem kültürleri kullanmaktırs. Biz in vivo ve doğmakta olan transkript görselleştirmek için in situ hibridizasyon (RNA FISH) floresan kullanılarak tek hücre düzeyinde in vitro hem de ilgi genlerin transkripsiyonel durumunu araştırmak için bir teknik önermek. Bu teknik, gen ekspresyonunun doğrudan okunmasını sağlar ve büyük endoreplicating hücreleridir TGCs kromozomal durumu değerlendirilmesini sağlar. Gerçekten de, TGCs farklılaşması önemli bir özelliği, hücre döngüsü çıkıp endoreplication.This yaklaşım birden fazla tur tabi otozomal ve / veya cinsiyet kromozomları ifade edilen herhangi bir genin ekspresyonunu tespit etmek için uygulanabilir ve gelişim ilgili önemli bilgiler sağlar olmasıdır mekanizmaları olarak plasental hastalıklar.

TGCs sebebi, hamile lokalizasyonlarında ve büyük bir boyuta DAPI boyama ile E7 bölümleri tespit edilebilir. Bu, uzunlamasına bir bölümü Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. RNA BALIK bu ekstra embriyonik soy X kromozomunun inaktivasyon incelemek için bu tür embriyonik bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. Çeşitli slayt veya lamelleri aynı anda işlenebilir. farklı genlerin RNA etiket farklı boya kullanılarak, tek bir aynı çekirdek içinde farklı bir birincil transkript tespit edebilir. Örnek Xist SG (yeşil sinyali) ve SR (kırmızı sinyal) bağlanmış Ldşftkrd bağlanmış olan en az 2 Probes, birbirine karıştırılabilmektedir. Bir dişi TGC bir örneği, 2 diğer soylar almaktadır Şekil 1B, uygun bir embriyo (E) ve iç organ endoderm (VE) &#39;de gösterilmiştir. Bir TGC çekirdeği Xist RNA X chrom kaplama ile gösteriliraktif diğer X kromozomu (Xa) birkaç saptar görüntüler ise (Xi) inaktive olan osome. X-bağlantılı gen XÍmkdmchq primer transkript endoreplication nedeniyle birkaç kopya halinde (değil Xist ile dekore edilmiş) aktif X kromozomdan ifade edilmiştir. Bu monoallelik ifade örneğin, bir X kromozomu üzerinde Ldşftkrd inaktivasyonunu gösterir. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, TGCs boyutu heterojen olduğundan, sadece en büyük olanlar kaydedilir. İkincil TGCs Şekil 2C&#39;de gösterildiği gibi, üç problar da kullanılabilir. Bu durumda, Xist -SG (yeşil), iki X-bağlantılı genler G6PD -SR (kırmızı) ve Huwe1 Cy (kırmızı) aynı çekirdek içinde aynı anda analiz edildi. G6PD monoallelically burada gösterildiği gibi ifade edilen (ve daha önce sekonder TGCs gösterilen 3) iken Huwe1 biallelically onun PR gösteren ifade ediliroperty XCI kaçmak için. Birkaç saptar, doğmakta olan transkript kopyaları yani ile Endoreplication, aynı zamanda açıktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> E7 kadın embriyonik bölümünden TGCs Şekil 1. İlköğretim transkript ifadesi. (A) DAPI ile boyandı E7 gebeliğin Boyuna kesit. Embriyo ve ekstra-embriyonik dokular anne dokusu, desidua ile çevrilidir. farklı soy lokalizasyonu 5X amacı ile DAPI boyama üzerine yapılır. TGCs büyük boyutları nedeniyle tanımlanır. Ch, koryon, E, embriyo, EPC, ectoplacental koni, VE, visseral endoderm, TGC, trofoblast dev hücreler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) (63X objektif) olarak kutulu-in alanının yüksek büyütme RNA BALIK. XÍmkdmchq birincil transkript kırmızı ve Xist RNA yeşil 3 soy = E görselleştirilebilir, TGC TİC. scale bar 10 mikron =. Xist -kaplı X kromozomunda bir in vivo XÍmkdmchq monoallelically ifade edilir TGC (Xa, ok başı) ve sessiz (XI) Örnek; Xa görülen birkaç XÍmkdmchq sinyalleri endoreplication kaynaklanmaktadır. XÍmkdmchq = BAC klonu RP23-260I15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> EPC türetilmiş ikincil TGCs Şekil 2. Primer transkript ifadesi. (A) İkincil TGCs (x5 objektif) büyüyen genel görünümü. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) Asterisk boyutları (10X objektif) göre TGCs örneğini göstermektedir. Ölçek çubuğu 60 mikron =. 3 probları kullanılarak ikinci bir kadın TGC RNA balık (C), Örnek (Xist domaXi) () kırmızı ve kırmızı birkaç saptar, G6PD ve Huwe1 birincil transkript endoreplication gösterilen: yeşil, inaktive X kromozomunu kapsayan. G6PD monoallelically ifade edilirken, Huwe1 sentezleme Bu çekirdeğinde bialelik olan Huwe1 = BAC klonu RP24-157H12;. G6PD = BAC klonu RP23-13D21. Xi = ok; Xa = ok (63X objektif). Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants at JoVE.com

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Görüntüleme.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetik

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Gelişim Biyolojisi

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biyokimya

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biyoloji

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler