Bu protokol, CRISPR kullanarak fare plasentalarının zamana özgü hedefli manipülasyonuna izin verdiği için önemlidir. Bu, araştırmacıların hamileliğin ortasından sonuna kadar belirli gen fonksiyonlarını aydınlatmalarını sağlayacaktır. Fare plasentasında aşırı ekspresyona neden olan genetik manipülasyonlar çok nadirdir.
Bu tekniğin temel avantajı, plasenta içinde bir dizi gen ekspresyon değişikliğine izin vermesidir. Ön terimler bu tekniğe sahipse cesaretiniz kırılmasın. Bu teknik zor olduğundan, ustalaşmak için pratik yapmak biraz zaman gerektirir.
Başlamak için, anestezi uygulanan barajı, hazırlık alanında anesteziyi korumak için bir burun konisi ile sırtüstü yerleştirin. Barajın karnını iyice tıraş edin. Kornea kurumasını önlemek için, barajın her iki gözünün üzerine yapay gözyaşı jeli yerleştirin.
Daha sonra, cerrahi bölgeyi bir povidon-iyot çözeltisinin en az üç alternatif turu ile dezenfekte etmek için steril pamuk uçlu aplikatörler kullanın, ardından son bir kat povidon-iyot çözeltisi ile% 70 etanol izleyin. Hazırlandıktan sonra, anestezi burun konisi ile barajı belirlenen ameliyat alanına taşıyın. Rahim laparotomisi için, barajı sırtüstü ameliyat masasına yerleştirin ve burun konisini bantla yerine sabitleyin.
45 santigrat dereceye ayarlanmış emici bir pedin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Ayak parmağı sıkışma reflüsü eksikliği ile anestezi derinliğini doğruladıktan sonra, çadırlı deriden yaklaşık iki santimetrelik bir orta hat kesisi yapmak için forseps ve makas kullanın. Daha sonra, uterus boynuzlarından yavaşça uzağa yerleştirilmiş steril forseps kullanarak peritondan dikey bir kesi yapın.
Her iki uterus boynuzuna da karnın her iki tarafına da rehberlik etmek için parmaklarınızla bastırarak masaj yapın. Maruz kalan uterusu alt karın üzerine yerleştirilen steril cerrahi örtülerin üzerine yerleştirin ve gerektiğinde ılık steril salin damlalarıyla nemli tutun. Rahim açığa çıktıktan sonra, manipülasyon için üç çift plasenta seçin.
Plasenta manipülasyonlarının yerini ve embriyoların uterus boynuzları içindeki organizasyonunu kaydedin. Kontrol plazmidinin plasental enjeksiyonu için, kalibre edilmiş bir mikropipet kullanarak üç enjeksiyon için yeterli miktarda uygun kontrol plazmidini yükleyin. Desidua ve kavşak bölgesi arasındaki tüm enjeksiyonları plasentaya yanal olarak yaklaşık 0,5 milimetre derinlikte gerçekleştirin.
Enjeksiyondan sonra, ancak elektroporasyondan hemen önce, salini uterus duvarındaki üç bölgeye ve küreklere bir damlalık veya şırınga ile tam olarak uygulayarak, steril salin ile temas yerlerini kaplayın. Enjeksiyondan sonraki iki dakika içinde, bir elektroporasyon makinesine bağlı bir çift üç milimetrelik kürek kullanarak elektroporasyon gerçekleştirin. CRISPR birleştirme verimliliğini ve embriyoların yaşayabilirliğini sağlamak için, ayarları 30 volt, 30 milisaniye darbe, iki darbe, 970 milisaniye darbe kapalı ve tek kutuplu olarak ayarlayın.
Elektroporasyon küreklerini plasentanın lateral taraflarındaki uterus duvarlarının üzerine hafifçe bastırın. Anot küreğini enjeksiyon bölgesine ve katotu tam karşısına yerleştirin. Elektroporasyon makinesindeki darbeye basın ve elektroporasyon küreklerini çıkarmadan önce iki darbenin tamamlanmasını bekleyin.
Daha sonra daha önce gösterildiği gibi deneysel plazmidin plasenta enjeksiyonuna devam edin. Kontrol grubu için yapıldığı gibi, enjeksiyondan sonraki iki dakika içinde üç deneysel enjekte edilen plasentanın elektroporasyonunu gerçekleştirin. Plasental manipülasyon tamamlandıktan sonra, uterus boynuzlarını doğrudan manipüle etmek için sadece parmaklarınızı kullanarak uterus boynuzlarına karın boşluğunun içine hafifçe masaj yapın.
13 milimetre, sekizde üç daire iğne alaşımı ile 45 santimetre uzunluğunda kaplanmış ve örgülü çözünebilir dikişler kullanarak periton tabakası üzerinde kesilmiş dikişler uygulayın. Periton tabakasını diktikten sonra, periton için kullanılan aynı tip çözülebilir dikişleri kullanarak cildi çözülebilir dikişlerle dikin. Dikiş tamamlandıktan sonra, ciltteki dikişlere doku yapıştırıcısı uygulayın.
Doku yapıştırıcısı kuruduğunda, buharlaştırıcıyı kapatın ve barajı ameliyat alanından sırtındaki destekleyici bir kafese aktarın. Plasentalara genel bir CRISPR Cas9 kontrol plazmidi ve aktivasyon kontrol CRISPR plazmidi veya bir IGF-1 SAM aktivasyon plazmidi enjekte edildi. Temsili nekropsi sonrası görüntüler, herhangi bir tedavi grubunda fenotipik görünümde gözle görülür bir hasar veya değişiklik göstermedi.
Manipüle edilmiş litrelerde tedavi edilmeyen embriyoların sağkalım oranı ortalama %79.05'e düşerken, manipüle edilen embriyoların sağkalımında anlamlı bir azalma ortalama %55.56 olarak gerçekleşmiştir.Herhangi bir grubun plasenta ağırlığında anlamlı bir fark yoktu. Ameliyattan hemen sonra maternal kilo alımında sahte ameliyatlara göre anlamlı bir fark yoktu. Birçok hamile barajı, işlemden sonraki gün, muhtemelen ameliyat sırasında ve kısa bir süre sonra yeme bozukluğu nedeniyle hafif bir azalma veya ağırlıkta bir değişiklik göstermedi.
Çoğu baraj E14.5'te artan ağırlık gösterdi, ancak bazen ağırlıkta bir azalma gözlendi. qPCR, kontrol plasentalarına karşı IGF-1 aşırı ekspresyon plasentalarında IGF-1 ekspresyonunda anlamlı bir artış gösterdi. E14.5 plasentaların ELIZA değerlendirmesi, kontrol plasentalarına karşı IGF-1 aşırı ekspresyon plasentalarındaki IGF-1 protein seviyelerinde anlamlı bir artış göstermiştir.
Yeşil otofloresan, plasental maternal fetal arayüzün alt bölgelerini, sadece IGF-1 aşırı ekspresyon plasentasında kırmızı Cas9 etiketlemesi ile gösterdi ve plasentanın her üç alt bölgesinde de başarılı CRISPR katılımını gösterdi. C2 hibridizasyon etiketlemesindeki floresan, IGF-1 aktivasyon plazmidinin tedavi edilmemiş plasentalara göç etmeden dahil edildiğini doğruladı. Desidual ve labirent bölgesi, Prl8a8 boyama ile işaretlenmiş kırmızı birleşim bölgesini çevreleyen tanımlanabilir.
Plasentaların ve ilgili embriyoların manipülasyon tipini ve yerini kaydetmeyi unutmayın. Serviks ve embriyoların uterus boynuzları içindeki yerlerinin kaydedilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu prosedürü takiben, plasenta, embriyo ve baraj analizi yapılabilir.
Bu, genlerin plasentaya özgü gebelik, plasenta fonksiyonu ve embriyonik gelişimdeki rollerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
