Name: transplantation into the mouse ovarian fat pad
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad at JoVE.com

Biz insan hücrelerini HIO118 sağlamak için, Dr. Andrew K. Godwin, Kansas Tıp Merkezi Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum. (; T028095 NYSTEM) Çocuk Sağlığı ve AFN İnsan Gelişimi (P50HD076210) Sağlık / National Institute National Institutes ve NYSTEM (C028125, C024174 ve hibe tarafından bu çalışmalar New York Kök Hücre Programı hibe ile desteklenmiştir T028095), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (CA182413) ve Ayn için Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu (327516) National Institutes of.

anlatılan tüm in vivo çalışma Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık Fat Pad Tahliller için 1. Örnek Hazırlıklar <ol><li> İzolasyon ve Kültür İlköğretim Tubal Epitel (TE) Hücreler <ol><li> CO 8 haftalık bakire β-aktin-Geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EFGP) ya da β-aktin-Discosoma Kırmızı Floresan Protein (DsRed) farelere servikal dislokasyon tarafından takip 2 yönetimini verici 6- euthanize. Bir ayak tutam başarılı ötenazi doğrulayın. </li><li> emici drape, ventral yüzü up bireysel fare yerleştirin ve sonra% 70 etanol ile karın silin. vücut orta hatta lateral kesi yaparak ve parmak uçları üzerinde ve fare baş ve kuyruk doğru kesi altında cilt çekme ile cilt açın. </li><li> Künt forseps kullanarak periton tutun ve vücut boşluğu açmak için ince makas ile kesim yapmak. Yavaşça intestin bobini itmekKenara e ve üreme organları bulun. </li><li> ince forseps ile bir uterin boynuz pick up ve rahim boynuzları ayrı noktasının üstünde 0,5 cm kesti. uterin boynuz tutarken, bağ uterin boynuz bağlı doku, rahim tüp, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığı uzak teşrih. 6 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanak içinde parçalara üreme yolu yerleştirin. İkinci üreme sistemi ile devam edin. </li><li> Bir Biyogüvenlik kabine çanak aktarın ve steril PBS 6 ml dokular 3 kere yıkayın. Biyogüvenlik kabinede yer alan bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya devam. ince cımbız ile uterin boynuz tut ve utero-tubal kavşakta kesilmesinin uterin tüp uterin boynuz ayırın. 25 G iğne kullanılarak yumurtalık çevreleyen yumurtalık bursa kesin. Not: Yumurtalık bursa çıkarıldıktan sonra, diseksiyon tamamlandıktan ve bireysel uterus borusu PBS çözeltisi kalır. </li><li> Bir Singl aktarın3,5 cm tabak PBS 50 ul damla e uterin boru ve 28 gauge iğne kullanılarak 0.1 mm parçalar halinde kıyma. 200 ul sindirim tamponu 1 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) F12 (Ham) ortamı 300 birim ml -1 kollajenaz ve 100 ünite ml -1 Hyaluronidaz ile takviye edilmiş) ve transfer, bir% 5 CO, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe 2 inkübatör. </li><li> İnkübasyondan sonra, 1 mi,% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 1 ml pipet ucu (aka mavi ucu), 3 dakika boyunca 20 kez yardımıyla çözelti askıya. (Ham) ortamı,% 2 fetal sığır serumu içeren 5 ml, + 4 ° C DMEM / F12 ekleyin. </li><li> ((Ham) ortamı 7 mg ml -1 Dispase II ve 10 ug ml -1 Deoksiribonükleaz I ile takviye santrifüj (600 RCF, 5 dakika, oda sıcaklığında (RT)), dokuları toplamak ve 1 mi sindirim tamponu 2 (DMEM F12 ekleme DNase I)). 1 ml pipet ti yardımıyla doku topağı 20 kez Askıyas. </li><li> 5 ml serum barındırmayan tüm fare tüp epitel büyüme ortamı (M-TE-GM, Tablo 1) ekleyin. </li><li> santrifüj hücreleri (600 RCF, 5 dakika, RT) toplayın. askıya alma ve hemasitometre hücreleri saymak, 1 ml M-TE-GM ekleyin. Tohum 1 x 10 5, 24, alçak bağlanma plakasında çukur başına 1 ml hücre ve 4 gün boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de M-TE-GM inkübe edin. </li><li> Her gün orta değiştirin. </li><li> Β-aktin EGFP ya da β-aktin-DsRed farelerden kültürlenen birincil süspansiyonu TE hücreleri tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. <ol><li> 24-iyi düşük bağlanma plakaları TE süspansiyon kültürleri toplayın. 1 mi% 0.25 tripsin-EDTA ile santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ve askıya hücre peletleri. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 5 ml DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ekleyerek tripsin aktivitesi durdurun. Santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ile hücre pelletleri toplayın. </li></ol></li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C), 4 ml, hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 10 ul PBS 1 x 10 5 hücre ekleyin, daha sonra 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. Not: steril koşullar altında bir Biyogüvenlik kabini içinde tüm diseksiyon ve doku kültürü çalışmaları yapın. </li></ol></li><li> Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hattı hazırlanması <ol><li> Ayrıca büyüme lentivirüs EGFP ve -mCherry etiketli insan immortalize over yüzey epitel hücresi lineHIO118 80 kadar - bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 cm yemekler% 90 konfluansa. </li><li> 10 ml PBS ile iki kez bulaşık yıkama, çanak başına 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. 10 mi DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Toplamaksantrifüjle hücre topakları (600 RCF, 5 dakika, RT). </li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C) 10 ml hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, 1.0 x 10 6 Lenti mCherry etiketli hücreleri + 1.0 x 10 6 Lenti EGFP 10 ul PBS hücreleri etiketli ekleyin. 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. </li></ol></li><li> Rahim Tüp hazırlanması <ol><li> 1.1.1-1.1.5 adımlarda açıklandığı gibi, 6- PBS içinde 8 haftalık bakire β-aktin-DsRed farelere ayrı ayrı rahim tüpleri teşrih. Bir diseksiyon mikroskobu altında PBS 200 ul damla içine tek rahim tüpleri aktarın. Yavaşça Mezosalpinksi, rahim tüp segmentleri destekleyen geniş ligament bir kısmını kaldırarak cımbız ve 28 gauge iğne yardımı ile rahim tüpleri uncoil. 2 bir damla tek kıvrıldığı rahim tüpleri yerleştirin00 ul buz gibi soğuk PBS alıcının yumurtalık yağ yastığı maruz kalan ve nakli için hazır kadar. </li></ol></li></ol> 2. Yumurtalık Fat Pad Nakli Not: Her hayvan cerrahisi arasındaki aletleri dezenfekte edin. Hazırlayın ve önceden tüm ekipmanı düzenlemek. Bu dalak önler olarak sağ over yağ yastığı dorsal transplantasyon tercihli vardır. Ancak, alıcılar hem yumurtalık yağ takviyesinde nakli olabilir. <ol><li> singeneik fareler veya birincil hücre alıcıları olarak ağır kombine immün yetmezlik (SCID / NCR) fareler kullanın. insan hücreleri gibi HIO118 hücreleri kullanımı Nod / SCID / gama (NTG) fareler veya SCID fareleri için. </li><li> 0.15 ml / 10 g vücut ağırlığı dozunda 2,2,2-tribromoetanol tek bir intra-peritonal enjeksiyon, alıcı fare anestezisi. hayvan kaput, bir ısıtma pedi üzerinde hayvan koyun ve pedal refleks (ayak tutam) kaybı ile doğru anesthetization onaylayın. ise kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürünhayvan anestezi altında olduğunu. ameliyat sonrası ağrı tedavisi için 4 mg / g vücut ağırlığı dozunda analjezik Ketoprofen hayvan deri altına enjekte edilir. Not: Alternatif olarak, anestezi izofluran kullanımı. indüksiyon odasında hayvan koyun ve 0.8-1.5 L / dk ve% 2-3 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlayın. , Odasından anestezi hayvan kaldırmak o zaman ameliyat başlatmak, bir maskeden izofluran nefes ve 0.4-0.8 L / dk ve% 1.5 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlamanızı sağlar. </li><li> 40. makası ile cerrahi alan Tıraş; , Bir alandan 2 kez cerrahi alan saç kaldırmak% 70 etanol ve ardından povidon-iyot üç antiseptik scrubs ile traş cildi hazırlamak ve steril bir örtü ile kaplayın. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde bulunan bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan taşımak. doğrudan yumurtalık yağ yastığı üzerinde dorsomedial pozisyonda bir kesi ile üreme yolu Açığa. Not: Critical adım: Hassas cilt kesi yara iyileşmesini kolaylaştırır, bir neşter kullanılması aşamasında 2.4 tavsiye edilir. </li><li> Kullanarak künt ince forseps sinirler ve büyük kan damarları zarar minimize dikkatle orta çizgisine doğru kesikten yumurtalık yağ yastığı çekin. Kritik Adım: kanama oluşursa, ameliyat durdurmak ve farklı bir konak hayvana nakli düşünün. </li><li> 28 ayar eğimli iğne yardımı ile diseksiyon mikroskobu kontrolü altında yumurtalık yağ yastığı içine 2-4 mm derinliğinde kesi, yumurtalık üzerinde 3-4 mm yapmak. Kritik adım: kesi sadece yağ yastığı yarısı geçer emin olun; alt tarafa tüm yol boyunca delme sızıntı olur. hızlı olun ve bu aşamadan sonra gecikmeden devam edin. </li><li> hücre nakli için, hücre bazal membran matris karışımı 10-20 ul bir şırınga (30 iğne) doldurmak ve yağ yastığı kesi içine enjekte edilir. rahim tüp nakli için, rahim tüp zekâ pick uph ince forseps ve 10 yer - 20 ul bazal membran matrisinin buz üzerinde tutulmalıdır. Bir 0.1-10 / 20 ul kullanarak XL (3 mm kısaltılmış) filtre ucu doku ve taban membran matris süspansiyonu pick up ve yağ yastığı kesi içine bırakın mezun oldu. </li><li> bazal membran matris kuvvetlendirmek ve geri periton içine üreme yolu yerleştirmek için 5 dakika bekleyin. 2 cerrahi sütür stiches ve iki küçük yara klipleri veya cerrahi sütür ile deri ile kasların kapatın. </li><li> Tekrarlayın kontrol olarak görev yapacak hayvan kontra yanal yağ yastığı içine PBS-bazal membran matris karışımı nakli 2.4-2.8 adımları tekrarlayın. Kritik adım: ısı kaybı anestezi farelerde hızlıdır çünkü Ameliyattan sonra bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. </li><li> Hayvan yerli kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde kurtarmak ve anestezi tamamen uyanık kadar hayvan inceleyelim. o sterna korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınl recumbence. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li><li> Ameliyat sonrası kafese yiyecek kuru ek olarak kafes içinde ön-ıslak gıda pelet bir avuç koyun. Önümüzdeki birkaç gün için gerekirse ameliyat sonrası analjezik uygulayın ve günlük yara inceleyin. yara enfeksiyonu oluşursa onaylı hayvan protokole göre antibiyotik uygulayın. Yara tamamen kapalı olduğunda ameliyat sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın. </li></ol> 3. Histoloji ve Image Acquisition <ol><li> Greft Toplanması ve Korunması <ol><li> 4 mi 10x PBS ve 10 ml% 16 paraformaldehit çözeltisi ile 26 ml GKD 2 O karıştırılarak% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir blok aşılanan yumurtalık yumurtalık yağ yastığı, uterin tüp, 1.1.1-1.1.4 adımda tarif edildiği gibi, 0.5 cm rahim teşrih. Hemen 2 mi% 4 paraformaldehid içinde yer ve oda sıcaklığında, 2 saat süre ile düzeltin. Aynı hayvandan olmayan engrafted teşrihBir kontrol olarak PBS-bazal membran matris karışımı ile nakledilen kontralateral over yağ yastığı sistemi (adım 2.9 bakınız). Düzeltmek ve aynı şekilde işlem. </li><li> sabitleme yıkamadan sonra, 5 dakika boyunca PBS ile üç kere, doku ve 4 ° C de PBS içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> yumurtalık yağ yastığı tüm montaj görüntüleme için 3.2.1 adıma geçin. Not: görüntü alma dokular dondurulmuş olabilir sonra (3.3.1) ya da parafine (3.3.2) için işlenmiş. 4 ° C&#39;de PBS içinde% 30 sukroz içinde bir gece inkübasyon donmuş dokular kalitesini artırır. </li></ol></li><li> Görüntü edinme <ol><li> Bir floresan eki, renkli kamera ve Plan ile donatılmış 4, 10x hedefleri ve stereomikroskopta, epi-floresan eki ve yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış PBS dolu yemekleri ve ters bir mikroskop kullanılarak görüntüde yumurtalık yağ yastığı sistemleri-bütün montaj yerleştirebilirsiniz apo 1xWD70, ED Planı 1.5xWD45 hedefleri. </li></ol></li><li> histoloji <ol><li> Takip etmetüm montaj görüntü toplama (3.2.1) Laboratuvar film ve forseps kullanarak bir 2 x 1 cm parçası üzerinde dondurulmuş doku örnekleri için orta gömme bir 200-500 ul damla yerleştirin damlasına kadar doku aktarın. bir kenarda filmi Pick up ve 1.8 ml kriyojenik flakon doku orta damla aktarın. şişeyi kapatın ve sıvı azot içine dalma. -80 ° C&#39;de donmuş dokular saklayın. </li><li> Alternatif olarak, standart parafine devam edin. Her adım için doku hacminin 20-40 hacimleri kullanın. <ol><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 65 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 70 etanol içinde dokuların bırakın. Bu aşamada örnekler oda sıcaklığında ay depolanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 90 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 95 etanol içinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca iki kez mutlak etanol (200 proof) içinde dokuların bırakın. </li> &lt;li&gt; RT&#39;de hafifçe sallayarak, 30 dakika boyunca kloroform iki kez dokuları daldırın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 30 dakika için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 12 saat için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de, 3 saat parafin kez dokuları bırakın. </li><li> Metal histoloji kalıplarında dokuları koyun ve 58 ° C parafin ile kalıpları doldurun. parafin üstüne plastik bir histoloji kaseti ekleyin ve + 4 ° C&#39;ye kadar parafin soğutmak. Oda sıcaklığında parafin doku blok ve mağaza ayıklayın. Not: Parafin sıcaklığı immünohistokimyasal için uygun dokuda optimal korunması için 58 ° C&#39;yi geçmemelidir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, Örnek İşleme Jel ile Parafin Gömme hazırlanın. <ol><li> PBS aspire ve% 70 etanol ile tüm montaj dokuları aktarın. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. bir su banyosu içinde, ön-ısıtma numune, 60 ° C&#39;ye jel işlem. </li><li> Pipette laboratuar film kaplı Petri kabı üzerine numune işleme jel 200 ul. Kullanarak ince diseksiyon forseps numune işleme jel düşmesi tüm montaj doku sistemini aktarmak. </li><li> örnek işleme jel yatağından oda sıcaklığında katılaşan, ya da 4 ° C &#39;de 10 dakika süre ile fiş katılaşmasına izin verin. </li><li> biyopsi köpük pedler arasına sıkıştırılan histoloji doku kasetlerde örnek işleme jel gömülü doku yerleştirin. adımlarda 3.3.2-3.3.2.10 gibi parafin gömün. Not: Numune işleme jel gömme kaybını önler ve küçük kırılgan doku örneklerinin korunmasını sağlar. Not: dondurma ya da parafine korunmuş dokular immünohistokimyasal 14,15 için uygundur. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+human+mammary+tissues+in+a+mouse+model.">Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model.</a> Nature protocols. 1, 206-214 (2006).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+breast+carcinomas+and+the+cancer+stem+cell+hypothesis.">Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).</li><li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA(H1047R)+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours.">PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525, 114-118 (2015).</li><li>Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -. P., Roy-Burman, P., Bagley, R. G., Teicher, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stem+cells+and+cancer+in+animals.">Prostate stem cells and cancer in animals.</a> Stem Cells and Cancer. , 199-216 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160, 324-338 (2015).</li><li>Lu, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cell+populations+in+sweat+glands+and+ducts+reveals+roles+in+homeostasis+and+wound+repair.">Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair.</a> Cell. 150, 136-150 (2012).</li><li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche.">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li><li>Orsulic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ovarian+cancer+by+defined+multiple+genetic+changes+in+a+mouse+model+system.">Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system.</a> Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).</li><li>Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+ovarian+transplants+to+rescue+a+transgenic+line+of+mice.">Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice.</a> Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).</li><li>Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+therapeutic+treatments+in+an+orthotopic+mouse+model+of+ovarian+cancer.">In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Albihn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+capsular+material+by+equine+trophoblast+transplanted+into+immunodeficient+mice.">Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice.</a> Reproduction. 125, 855-863 (2003).</li><li>Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+knock-in+Foxj1(CreERT2::GFP)+mouse+for+recombination+in+epithelial+cells+with+motile+cilia.">A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia.</a> Genesis. 52, 350-358 (2014).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).</li><li>Capo-Chichi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+of+the+extracellular+environment+of+ovarian+surface+epithelial+cells+in+premalignant+transformation,+tumorigenicity,+and+metastasis.">Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis.</a> Cancer. 95, 1802-1815 (2002).</li><li>Roland, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+surface+and+cyst+epithelial+basement+membranes+and+preneoplastic+morphologic+changes+in+prophylactic+oophorectomies.">Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies.</a> Cancer. 98, 2607-2623 (2003).</li><li>Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+stem+cell+niche+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancers.">Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers.</a> Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).</li><li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovary+and+fimbrial+stem+cells:+biology,+niche+and+cancer+origins.">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469, 314-322 (2011).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2015.">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+high-resolution+imaging+of+epithelial+ovarian+cancer+by+laparoscopic+nonlinear+microscopy.">Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy.</a> Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Epitel hücrelerin ve dokuların doğru teslimat saptanmasına izin verir, bir yumurtalık yağ yastığı nakli deneyi kurduk. Yumurtalık yağ yastığı tahlil nakli prosedürü daha az teknik açıdan zor intrabursal enjeksiyon 10-12 daha ve daha düzgün ve intraperitoneal enjeksiyon 9 ile karşılaştırıldığında nakledilen hücrelerin tam yerini sağlar. Aynı zamanda, iyi bir rahim tüp gibi bir organ, uzun süreli nakli için uygundur. Önemlisi, yumurtalık yağ yastığı kadın üreme sisteminin epitel için tanıdık bir mikro sağlar. Bu rejenerasyon ve habis dönüşüm sırasında insan ve fare yumurtalık ve tubal epitel hücrelerinin moleküler ve hücresel çalışmalar için özellikle uygun olacaktır. Diğer organlarda aksine, çok az çalışma dişi r epitelde tanımlanması ve kök hücrelerin karakterizasyonuna odaklanmıştıreproductive yolu 18,19. Birçok kanser yetişkin kök hücrelerin 20 kaynaklandığı düşünülmektedir, çünkü bu tür çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Epitelyal over kanserlerinin henüz hücresel kökenleri 18 derece tartışmalı kalır. Epitelyal over kanserleri, yumurtalık kanserlerinin çoğunluğu için hesap ve ABD&#39;de 21 kadın tüm kanser bağlı ölümlerin arasında 5. sırada yer almaktadır. Mevcut transplantasyon teknikleri 9-12 üzerinde çeşitli avantajları ile ortotopik tahlil Böylece gelişme büyük ölçüde bu alandaki çalışmaları kolaylaştıracaktır. yumurtalık yağ yastığı yüzeysel konumu göz önüne alındığında, küçük hayvan görüntüleme sistemleri güçlü floresan veya bioluminescent gazetecilere ile etiketlenmiş engraftments takip etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu doğrusal olmayan mikroskopi 22 minimal invaziv yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme deneyleri, kurulması mümkün olmalıdır. yumurtalık yağ yastığı da organ kültürleri tutulabilir, böylece izinyakından hücrelerin organizasyonu ve hücre dışı matriks yansıtan koşullar altında normal ve neoplastik epitel üç boyutlu kültür ing. Gelecekteki çalışmalar bu umut verici olanakları ele almalıdır. Birkaç kritik adımlar dikkate alınmalıdır. bir ısıtma yastığı sağlanması ve ameliyat sırasında sıcak kemirgenleri tutarak büyük ölçüde hayatta kalma oranını artırır. yağ yastığı taşıma araçlarının Sterilite engrafted sistemler steril tutulmasını sağlar. Bizim deneyim, nakli büyüme geriliği önemli kanama sonuçlarında. Önemlisi, yağ yastığı kesi kesin yapılmalıdır yağ yastığı yırtılma veya kanama nedenleri aracılığıyla delinmesiyle çünkü. Koagülantlar gerekli kanamayı durdurmak için kullanılmalıdır. gelişmez engraftments takdirde, enjekte edilen hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu dikkate alınmalıdır. İlk başarılı çıkıntılar transplantasyon sonrası bir hafta kadar erken gözlenen ve en görünür biri olmalıdır engraftments edilebilirİşlemden sonra ay. nakli için, daha büyük bir çapa (23-25 ​​G) iğneler (çapı 10 um) üzerinden büyük hücreler kesme önlemek için de kullanılabilir. Ancak, bu tür iğneler yağ yastığı daha travmatik olabilir ve bunların kullanımı önceden test edilmelidir. Deneyler için biz 6 ila 8 hafta eski donör ve alıcı fareler kullanılmıştır. her iki amaç için daha küçük veya daha büyük farenin kullanılabilir. Bununla birlikte, enjekte edilen hücrelerin sayısı ayarlanması gerekebilir. genç vericilerden over yağ yastıkları küçük boyutta da dikkate alınması gerekir. herhangi bir yöntem olduğu gibi, fare yumurtalık yağ yastığı nakli testinin bazı sınırlamalar vardır. singeneik immüno-kompetan farelerde kemirgen birincil hücreler / dokular için kullanılabilecek olsa da, bizim teknik NTG veya insan malzemenin nakli için SCID fareleri gerektirir. Insan epitelyum hücrelerinin gelişimini desteklemek için yağ yastığı humanize mümkün muhtemeldir. Ancak, henüz bu yaklaşımı test değil. Genç fe Kullanımıerkekler daha düşük üreme maliyetleri yol açabilir; Bununla birlikte, yetişkin bakire dişi fareler (8 ila 10 haftalık) ve böylece daha büyük bir örneklerin nakli sağlayan daha büyük bir yağ yastığı bulunmaktadır. Son olarak, laboratuvar personeli prosedürün zamanında ve başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlamak, hayvan cerrahisi konusunda eğitilmelidir.

farelerde belirli vücut sitelerine hücre ve dokuların getirilmesini, Transplantasyon deneyleri, doku rejenerasyonu ve karsinogenez çalışmaları için önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir. hücrelerin Ortotopik transplantasyonlar, yani, bir ana ortamın içine yerleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin tanımlanması için özellikle önemlidir. Meme kök hücrelerin varlığı ilk farelerin 1 bezi serbest meme yağ pedleri içine epitel meme bezi parçalarının nakli önerildi. Insanlaştırılmış fare yağ yastığı 2 Aşı deneyleri, insan primer meme epitelyal hücrelerinin yeniden üretilebilir potansiyel ve normal gelişim özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, temizlenmiş ve memenin yağlı pedine fenotipik farklı hücre tiplerinin seri ve sınırlayıcı seyreltme transplantasyon meme kök hücrelerin 3-5 kendini yenileme ve multilinaj farklılaşmasını test etmek için çok önemliydi. combinat Transplantasyon deneyleriGenetik soy iyon meme karsinogeneziste 5 menşe hücrenin kanıt sağladı izleme. Böbrek kapsülü nakilleri sıklıkla putatif prostat kök hücreler 6 özelliklerini test etmek için kullanılmıştır. Normal ve neoplastik fare ve insan pankreas organoids ortotopik transplantasyon kanseri ilerlemesinde 7 değişmiş genleri ve yollar ortaya çıkardı. Yerli çevrenin önemi de sonra bu tür meme yağ yastıkları, omuz yağ pedleri ve arka cilt 8 olarak farklı yerlerde, içine ter bezlerinin engraftments farklı rejenerasyon gösterilmesi tarafından desteklenmektedir. Periton boşluğu ve yumurtalık bursa, genellikle dişi üreme yolunun 9-12 epitel hücrelerinin ortotopik transplantasyon için yerler olarak kullanılır. Bu yöntemlerin her ikisi de sınırlamaları bir dizi. hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu karın boşluğu farklı alanlarda implantasyon yol açar, bu şekilde comhücre büyümesini izlemek plicating. Ayrıca, mikro-varyasyonlar, örneğin damarlanma, innervasyon ve immün hücre temsil uzantısı olarak, periton boşluğu farklı alanlarda oldukça önemli olabilir. Yumurtalık bursa sıvının en fazla 10 ul enjekte etmeyi sağlamak, çok sınırlı bir hacme sahiptir. Bu önemli ölçüde tatbik edilebilir hücre miktarını sınırlar. Ayrıca, yumurtalık bursa içine enjeksiyonlar oldukça teknik olarak zor olabilir ve işlem süresi önemli miktarda gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz yumurtalık yağ yastığı özelliklerinin avantajlarından almış. Fare yumurtalık yağ yastığı, büyük bir boyuta sahip yumurtalık ve rahim tüp bitişik ve cerrahi ile kolayca erişilebilir. At trofoblast mouse over yağ yastığı 13 naklediliyor edilebileceği bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin ayrıntıları tarif edilmemiştir. Aynı zamanda bu benim eğer rapor değilmetod ile yetişkin hücre ve dokuları için uygulanabilir. Burada, fare ve dişinin üreme kanalında insan hücrelerinin nakli için güvenilir bir yöntem anlatılmaktadır, bu yöntem, aynı zamanda, uzun süreli, organ nakli için de uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>25 gauge needle</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)</td><td>Kendall</td><td>30339</td><td>Part Number: 8881500014</td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>basement membrane matrix (Geltrex)</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin-DsRed mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>6051</td><td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin-EGFP mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>bovine albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr><td>collagenase/hyaluronidase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>cryogenic vials</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispase II</td><td>Worthington</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 (HAM&#039;s)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (Deoxyribonuclease I)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td><td>Sakura Finetek&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>ethanol 200 proof</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>to prepare 70%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>filter tip 0.1-10/20 &amp;micro;l XL&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>FOXJ1 antibody</td><td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>used at concentration 1:1,000 (no unmasking)</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>laboratory film (Parafilm M)</td><td>American National Can</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>insulin-transferin-sodium selenite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane, 250 ml</td><td>Santa Cruz Animal Health</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>low attachment plate 24-well</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>metal histology molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62527-22</td><td></td></tr><tr><td>microscope, inverted</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>microscope, stereo</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/gamma (NSG) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>05557</td><td>NOD.Cg-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;Il2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;/SzJ</td></tr><tr><td>paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>paraffin (Paraplast, X-TRA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>PAX8 antibody</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>used at concentration 1:1,000 (no unmasking)</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td><td>Corning</td><td>&amp;nbsp;21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>penicillin streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)</td><td>NCI-Frederick Animal Production Program</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>specimen processing gel (HISTOGEL)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 25%</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation into the mouse ovarian fat pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

Deneysel hücreler ve dokular doğru bir diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) altında yumurtalık yağ yastığı içine transplante edilebilir. Örnekler her yerde görülen EGFP (Şekil 2A) ya da DsRed (Şekil 2B) ve HIO118 16,17 hücreleri MCherry ve EGFP lentivirüs ile işaretlenmiş insan immortalize over yüzey epitel hücrelerinin (F - Şekil 2C) eksprese eden farelerden türetilen birincil fare tüp epitel hücrelerini içerir. Yaklaşım, aynı zamanda, fare uterus borusu (Şekil 3) gibi organların, uzun süreli nakli için geçerlidir. Immünohistokimyasal boyanma göre, her iki kirpikli (FOXJ1 pozitif 14) ve salgı (PAX8 pozitif 15) hücreleri nakledilen dokuların (Şekil 3B ve E) tuba epiteli korunur. <imgalt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. Transplantasyonu (ok) Yumurtalık Yağ Pad Nakli (A) Exposed alan. (B) Bir kesi 28 G iğne (ok) tarafından yapılır. Pipet (ok) (C) UT / bazal membran matris karışımı aşılanmasına. (D) UT engrafted (ok, parlak kırmızı, β-aktin-DsRed farelerin UT). FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. Ölçek çubuğu = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> Şekil 2:. Nakledilen Fare İlköğretim Tüp Epitel Hücreleri ve İnsan Algılama ölümsüzleştirdi Yumurtalık Yüzey Epitel Hücreleri (A, B) Out<html> birincil fare tüp epitel hücrelerinin 8 gün singeneik fare transplantasyon sonrası (A, yeşil) ve β-aktin-DsRed (B, kırmızı) β-aktin EGFP farelerin (oklar) büyümeleri. (C, D), 10 gün NTG farelere transplantasyonu sonrası Lenti-EGFP (yeşil) veya Lenti mCherry (kırmızı) ile ya etiketli karışık HIO118 hücrelerinin (oklar) Engraftments. (D) (C, ok) Genişletilmiş alan. (E, F) Greft SCID fare (oklar) D, 43 gün C ile aynı hücre naklinden sonra geliştirdi. AD, F, floresan; E, parlak bir alan, FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A, B, DF) Ölçek çubuğu = 500 mikron; (C) Ölçek çubuğu = 1.600 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reklam / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Uterus Tüp nakli Karakterizasyonu. (A) β-aktin-DsRed fare 6 gün yumurtalık yağ yastığı içine naklinden sonra tam rahim tüp (ok) (ok, parlak kırmızı). (B) (a) &#39;da gösterilen transplant yağ yastığı Floresan frozen. Kırmızı, DsRed; Mavi, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer counterstaining. (C) Rahim tüp greft (ok) NSG alıcı fare (ok) içine nakli sonrası 40 gün. Parafin bölümü. Doğru tüm ilke rahim tüp bileşenlerinin korunması ve transplantasyon ilişkili fibrozis ve inflamasyon olmayışına dikkat edin. Hematoksilen ve eozin boyama. (D, E) Algılama tuba epiteli işaretçileri Eşli kutu geni 8 (PAX8) ve Forkhead kutusunun J1 ve (FOXJ1 kahverengi nükleer renk, ok başları) gösterilen greft (oklar) hücrelerinde ( <sTrong&gt; C). Immünoperoksidaz sistemi. metil yeşili ile karşıt. FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A) Ölçek çubuğu = 1,000 mikron; (B) Ölçek çubuğu = 200 mikron; (CE) Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 1x DMEM F12 (Ham&#39;ın) orta </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum pruvate </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Epidermal büyüme faktörü </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> Temel fibroblast büyüme faktörü-2 </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> hidrokortizon </td><td> 500 ng mL -1 </td></tr><tr><td> ensülin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> sodyum selenit </td><td> 5 ng ml -1 </td></tr><tr><td> sığır albümini </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 100 birim mi -1/100 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Minimum gerekli ortam (MEM) temel olmayan amino asitler, </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Beta-merkaptoetanol </td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Fare Tüp Epithelim Gelişim Ortamı (M-TE-GM) Bileşenler sol sütununda sıralanan 1x DMEM F12 belirtilen konsantrasyonlarda (Ham) orta, sağ sütunda çözündürülür. Nihai orta kompozisyon serbest serum olduğunu.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad at JoVE.com

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar.

Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

transplantation-into-the-mouse-ovarian-fat-pad

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K Görüntüleme.  Cornell University.  Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar. 

Video: Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Kanser Araştırmaları

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is being used to investigate the health-protective effects of young ovaries in young females. The current procedures employ an orthotopic transplantation method, where allogenic ovaries are transplanted back to their original position in the ovarian bursa. This is in contrast to the more commonly used heterotopic transplantation of ovaries/ovarian tissue subcutaneously or under the kidney capsule. All three locations provide efficient revascularization of the transplanted tissues. However, orthotopic transplantation provides the ovary with the most natural signaling environment and is the only procedure that provides the opportunity for the animal to reproduce naturally post-operatively. One must take care to remove all endogenous ovarian tissue during the ovariectomy procedure. If any endogenous tissue remains or if only one ovary is removed, the transplanted tissue will remain dormant until the existing tissue becomes senescent. While revascularization of the transplanted ovaries occurs very quickly, the transplant recipient can take a considerable amount of time to adapt to a new hypothalamic/pituitary/gonadal/adrenal (HPG/A) axis signaling regime associated with the transplanted tissue. This normally takes about 100 days in the mouse. Therefore, transplantation experiments should be designed to accommodate this adaptation period. Typical results with ovarian transplantation will include changes in the health of the recipient that reflect the age of the transplanted ovary, rather than the chronological age of the recipient.

Described here are orthotopic ovarian transplantation protocols for modifying ovarian influence on the physiology of the recipient mouse. This surgical procedure is used to expose female mice to various types of ovarian influence and may include heterochronic transplantations and transplantation of ovaries that have undergone various ex vivo treatments.

Dişi farelerde yumurtalık yaşlanma ve sağlık-ömrü etkisini araştırmak için Orthotopic yumurtalık nakli yordamları

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

Gelişim Biyolojisi

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Biyoloji

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. As an alternative, an increasing number of these patients are choosing to cryopreserve ovarian tissue for autograft following recovery and remission. Despite improvements in outcomes among patients undergoing auto-transplantation of cryopreserved ovarian tissue, efficient revascularization of grafted tissue remains a major obstacle. To mitigate ischemia and thus improve outcomes in patients undergoing auto-transplantation, we developed a vascular cell-based strategy for accelerating perfusion of ovarian tissue. We describe a method for co-transplantation of exogenous endothelial cells (ExECs) with cryopreserved ovarian tissue in a mouse xenograft model. We extend this approach to employ ExECs that have been engineered to constitutively express Anti-Mullerian hormone (AMH), thus enabling sustained paracrine signaling input to ovarian grafts. Co-transplantation with ExECs increased follicular volume and improved antral follicle development, and AMH-expressing ExECs promoted retention of quiescent primordial follicles. This combined strategy may be a useful tool for mitigating ischemia and modulating follicular activation in the context of fertility preservation and/or infertility at large.

For some patients, the only option for fertility preservation is cryopreservation of ovarian tissue. Unfortunately, delayed revascularization undermines follicular viability. Here, we present a protocol to co-transplant human ovarian tissue with endothelial cells for utilization as a cell-based strategy combining accelerated perfusion with a direct paracrine delivery of bioactive molecules.

İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Biyomühendislik

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle loss occurring shortly after reimplantation due to abnormal follicle activation and death. Rodents are benchmark models for investigating follicle activation, but the cost, time, and ethical considerations are becoming increasingly prohibitive, thus driving the development of alternatives. The chick chorioallantoic membrane (CAM) model is particularly attractive, being inexpensive and maintaining&#160;natural immunodeficiency up to day 17 postfertilization, making it ideal to study&#160;short-term xenografting of human ovarian tissue. The CAM is also highly vascularized and has been widely used as a model to explore angiogenesis. This gives it a remarkable advantage over in vitro models and allows the investigation of mechanisms affecting the early post-grafting follicle loss process. The protocol outlined herein aims to describe the development of a CAM xenografting model for human ovarian tissue, with specific insights into the effectiveness of the technique, the graft revascularization time frame, and the tissue viability across a 6 day grafting period.

The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Here, we describe a protocol for developing a chick chorioallantoic membrane (CAM) xenografting model for human ovarian tissue and demonstrate the effectiveness of the technique, the graft revascularization time frame, and the tissue viability across a 6 day grafting period.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

Harvesting Peritoneal Fat Depots: A Technique to Study Ovarian Cancer Colonization of Peritoneal Adipose Tissues in Mouse Models

Source: Krishnan, V. et al. <a href="https://www.jove.com/t/52721">In Vivo</a><a href="https://www.jove.com/t/52721">&#160;and&#160;Ex Vivo&#160;Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we use a euthanized female mouse model bearing ovarian cancer. We then describe a protocol to identify and extract fat depots or adipose tissues associated with the five primary peritoneal organs to study metastatic cancer cell colonization.

Peritoneal Yağ Depolarının Toplanması: Fare Modellerinde Peritoneal Yağ Dokularının Yumurtalık Kanseri Kolonizasyonunu İncelemek İçin Bir Teknik

Source: Krishnan, V. et al. In Vivo&#160;and&#160;Ex Vivo&#160;Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Jinekolojik Kanser

Hayvan modeli çalışmaları

Ovarian Fat Pad Transplantation Assay: An In Vivo Technique to Introduce Cells into Ovarian Fat Pad in Mouse Models

Source: Flesken-Nikitin, A. et al. <a href="https://www.jove.com/t/54444">Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate an assay for transplantation of experimental cells and tissue fragments into the mouse ovarian fat pad. This method can be used to monitor cell regeneration and tumor transformation via non-invasive techniques.

Yumurtalık Yağ Yastığı Nakli Testi: Fare Modellerinde Hücreleri Yumurtalık Yağ Yastığına Sokmak İçin İn Vivo Bir Teknik

Source: Flesken-Nikitin, A. et al. Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad. J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate an assay for ...

Intact Ovary Harvest from Mouse: A Surgical Procedure to Isolate Complete Ovary from Murine Model

Source: Mason, J. B. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56638">Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a surgical procedure to harvest intact ovary from a mouse model.

Fareden Sağlam Yumurtalık Alımı: Tam Yumurtalığı Murin Modelinden İzole Etmek İçin Cerrahi Bir İşlem

Source: Mason, J. B. et al. Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in ...