Biz insan hücrelerini HIO118 sağlamak için, Dr. Andrew K. Godwin, Kansas Tıp Merkezi Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum. (; T028095 NYSTEM) Çocuk Sağlığı ve AFN İnsan Gelişimi (P50HD076210) Sağlık / National Institute National Institutes ve NYSTEM (C028125, C024174 ve hibe tarafından bu çalışmalar New York Kök Hücre Programı hibe ile desteklenmiştir T028095), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (CA182413) ve Ayn için Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu (327516) National Institutes of.

anlatılan tüm in vivo çalışma Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık Fat Pad Tahliller için 1. Örnek Hazırlıklar <ol><li> İzolasyon ve Kültür İlköğretim Tubal Epitel (TE) Hücreler <ol><li> CO 8 haftalık bakire β-aktin-Geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EFGP) ya da β-aktin-Discosoma Kırmızı Floresan Protein (DsRed) farelere servikal dislokasyon tarafından takip 2 yönetimini verici 6- euthanize. Bir ayak tutam başarılı ötenazi doğrulayın. </li><li> emici drape, ventral yüzü up bireysel fare yerleştirin ve sonra% 70 etanol ile karın silin. vücut orta hatta lateral kesi yaparak ve parmak uçları üzerinde ve fare baş ve kuyruk doğru kesi altında cilt çekme ile cilt açın. </li><li> Künt forseps kullanarak periton tutun ve vücut boşluğu açmak için ince makas ile kesim yapmak. Yavaşça intestin bobini itmekKenara e ve üreme organları bulun. </li><li> ince forseps ile bir uterin boynuz pick up ve rahim boynuzları ayrı noktasının üstünde 0,5 cm kesti. uterin boynuz tutarken, bağ uterin boynuz bağlı doku, rahim tüp, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığı uzak teşrih. 6 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanak içinde parçalara üreme yolu yerleştirin. İkinci üreme sistemi ile devam edin. </li><li> Bir Biyogüvenlik kabine çanak aktarın ve steril PBS 6 ml dokular 3 kere yıkayın. Biyogüvenlik kabinede yer alan bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya devam. ince cımbız ile uterin boynuz tut ve utero-tubal kavşakta kesilmesinin uterin tüp uterin boynuz ayırın. 25 G iğne kullanılarak yumurtalık çevreleyen yumurtalık bursa kesin. Not: Yumurtalık bursa çıkarıldıktan sonra, diseksiyon tamamlandıktan ve bireysel uterus borusu PBS çözeltisi kalır. </li><li> Bir Singl aktarın3,5 cm tabak PBS 50 ul damla e uterin boru ve 28 gauge iğne kullanılarak 0.1 mm parçalar halinde kıyma. 200 ul sindirim tamponu 1 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) F12 (Ham) ortamı 300 birim ml -1 kollajenaz ve 100 ünite ml -1 Hyaluronidaz ile takviye edilmiş) ve transfer, bir% 5 CO, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe 2 inkübatör. </li><li> İnkübasyondan sonra, 1 mi,% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 1 ml pipet ucu (aka mavi ucu), 3 dakika boyunca 20 kez yardımıyla çözelti askıya. (Ham) ortamı,% 2 fetal sığır serumu içeren 5 ml, + 4 ° C DMEM / F12 ekleyin. </li><li> ((Ham) ortamı 7 mg ml -1 Dispase II ve 10 ug ml -1 Deoksiribonükleaz I ile takviye santrifüj (600 RCF, 5 dakika, oda sıcaklığında (RT)), dokuları toplamak ve 1 mi sindirim tamponu 2 (DMEM F12 ekleme DNase I)). 1 ml pipet ti yardımıyla doku topağı 20 kez Askıyas. </li><li> 5 ml serum barındırmayan tüm fare tüp epitel büyüme ortamı (M-TE-GM, Tablo 1) ekleyin. </li><li> santrifüj hücreleri (600 RCF, 5 dakika, RT) toplayın. askıya alma ve hemasitometre hücreleri saymak, 1 ml M-TE-GM ekleyin. Tohum 1 x 10 5, 24, alçak bağlanma plakasında çukur başına 1 ml hücre ve 4 gün boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de M-TE-GM inkübe edin. </li><li> Her gün orta değiştirin. </li><li> Β-aktin EGFP ya da β-aktin-DsRed farelerden kültürlenen birincil süspansiyonu TE hücreleri tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. <ol><li> 24-iyi düşük bağlanma plakaları TE süspansiyon kültürleri toplayın. 1 mi% 0.25 tripsin-EDTA ile santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ve askıya hücre peletleri. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 5 ml DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ekleyerek tripsin aktivitesi durdurun. Santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ile hücre pelletleri toplayın. </li></ol></li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C), 4 ml, hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 10 ul PBS 1 x 10 5 hücre ekleyin, daha sonra 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. Not: steril koşullar altında bir Biyogüvenlik kabini içinde tüm diseksiyon ve doku kültürü çalışmaları yapın. </li></ol></li><li> Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hattı hazırlanması <ol><li> Ayrıca büyüme lentivirüs EGFP ve -mCherry etiketli insan immortalize over yüzey epitel hücresi lineHIO118 80 kadar - bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 cm yemekler% 90 konfluansa. </li><li> 10 ml PBS ile iki kez bulaşık yıkama, çanak başına 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. 10 mi DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Toplamaksantrifüjle hücre topakları (600 RCF, 5 dakika, RT). </li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C) 10 ml hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, 1.0 x 10 6 Lenti mCherry etiketli hücreleri + 1.0 x 10 6 Lenti EGFP 10 ul PBS hücreleri etiketli ekleyin. 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. </li></ol></li><li> Rahim Tüp hazırlanması <ol><li> 1.1.1-1.1.5 adımlarda açıklandığı gibi, 6- PBS içinde 8 haftalık bakire β-aktin-DsRed farelere ayrı ayrı rahim tüpleri teşrih. Bir diseksiyon mikroskobu altında PBS 200 ul damla içine tek rahim tüpleri aktarın. Yavaşça Mezosalpinksi, rahim tüp segmentleri destekleyen geniş ligament bir kısmını kaldırarak cımbız ve 28 gauge iğne yardımı ile rahim tüpleri uncoil. 2 bir damla tek kıvrıldığı rahim tüpleri yerleştirin00 ul buz gibi soğuk PBS alıcının yumurtalık yağ yastığı maruz kalan ve nakli için hazır kadar. </li></ol></li></ol> 2. Yumurtalık Fat Pad Nakli Not: Her hayvan cerrahisi arasındaki aletleri dezenfekte edin. Hazırlayın ve önceden tüm ekipmanı düzenlemek. Bu dalak önler olarak sağ over yağ yastığı dorsal transplantasyon tercihli vardır. Ancak, alıcılar hem yumurtalık yağ takviyesinde nakli olabilir. <ol><li> singeneik fareler veya birincil hücre alıcıları olarak ağır kombine immün yetmezlik (SCID / NCR) fareler kullanın. insan hücreleri gibi HIO118 hücreleri kullanımı Nod / SCID / gama (NTG) fareler veya SCID fareleri için. </li><li> 0.15 ml / 10 g vücut ağırlığı dozunda 2,2,2-tribromoetanol tek bir intra-peritonal enjeksiyon, alıcı fare anestezisi. hayvan kaput, bir ısıtma pedi üzerinde hayvan koyun ve pedal refleks (ayak tutam) kaybı ile doğru anesthetization onaylayın. ise kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürünhayvan anestezi altında olduğunu. ameliyat sonrası ağrı tedavisi için 4 mg / g vücut ağırlığı dozunda analjezik Ketoprofen hayvan deri altına enjekte edilir. Not: Alternatif olarak, anestezi izofluran kullanımı. indüksiyon odasında hayvan koyun ve 0.8-1.5 L / dk ve% 2-3 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlayın. , Odasından anestezi hayvan kaldırmak o zaman ameliyat başlatmak, bir maskeden izofluran nefes ve 0.4-0.8 L / dk ve% 1.5 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlamanızı sağlar. </li><li> 40. makası ile cerrahi alan Tıraş; , Bir alandan 2 kez cerrahi alan saç kaldırmak% 70 etanol ve ardından povidon-iyot üç antiseptik scrubs ile traş cildi hazırlamak ve steril bir örtü ile kaplayın. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde bulunan bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan taşımak. doğrudan yumurtalık yağ yastığı üzerinde dorsomedial pozisyonda bir kesi ile üreme yolu Açığa. Not: Critical adım: Hassas cilt kesi yara iyileşmesini kolaylaştırır, bir neşter kullanılması aşamasında 2.4 tavsiye edilir. </li><li> Kullanarak künt ince forseps sinirler ve büyük kan damarları zarar minimize dikkatle orta çizgisine doğru kesikten yumurtalık yağ yastığı çekin. Kritik Adım: kanama oluşursa, ameliyat durdurmak ve farklı bir konak hayvana nakli düşünün. </li><li> 28 ayar eğimli iğne yardımı ile diseksiyon mikroskobu kontrolü altında yumurtalık yağ yastığı içine 2-4 mm derinliğinde kesi, yumurtalık üzerinde 3-4 mm yapmak. Kritik adım: kesi sadece yağ yastığı yarısı geçer emin olun; alt tarafa tüm yol boyunca delme sızıntı olur. hızlı olun ve bu aşamadan sonra gecikmeden devam edin. </li><li> hücre nakli için, hücre bazal membran matris karışımı 10-20 ul bir şırınga (30 iğne) doldurmak ve yağ yastığı kesi içine enjekte edilir. rahim tüp nakli için, rahim tüp zekâ pick uph ince forseps ve 10 yer - 20 ul bazal membran matrisinin buz üzerinde tutulmalıdır. Bir 0.1-10 / 20 ul kullanarak XL (3 mm kısaltılmış) filtre ucu doku ve taban membran matris süspansiyonu pick up ve yağ yastığı kesi içine bırakın mezun oldu. </li><li> bazal membran matris kuvvetlendirmek ve geri periton içine üreme yolu yerleştirmek için 5 dakika bekleyin. 2 cerrahi sütür stiches ve iki küçük yara klipleri veya cerrahi sütür ile deri ile kasların kapatın. </li><li> Tekrarlayın kontrol olarak görev yapacak hayvan kontra yanal yağ yastığı içine PBS-bazal membran matris karışımı nakli 2.4-2.8 adımları tekrarlayın. Kritik adım: ısı kaybı anestezi farelerde hızlıdır çünkü Ameliyattan sonra bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. </li><li> Hayvan yerli kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde kurtarmak ve anestezi tamamen uyanık kadar hayvan inceleyelim. o sterna korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınl recumbence. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li><li> Ameliyat sonrası kafese yiyecek kuru ek olarak kafes içinde ön-ıslak gıda pelet bir avuç koyun. Önümüzdeki birkaç gün için gerekirse ameliyat sonrası analjezik uygulayın ve günlük yara inceleyin. yara enfeksiyonu oluşursa onaylı hayvan protokole göre antibiyotik uygulayın. Yara tamamen kapalı olduğunda ameliyat sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın. </li></ol> 3. Histoloji ve Image Acquisition <ol><li> Greft Toplanması ve Korunması <ol><li> 4 mi 10x PBS ve 10 ml% 16 paraformaldehit çözeltisi ile 26 ml GKD 2 O karıştırılarak% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir blok aşılanan yumurtalık yumurtalık yağ yastığı, uterin tüp, 1.1.1-1.1.4 adımda tarif edildiği gibi, 0.5 cm rahim teşrih. Hemen 2 mi% 4 paraformaldehid içinde yer ve oda sıcaklığında, 2 saat süre ile düzeltin. Aynı hayvandan olmayan engrafted teşrihBir kontrol olarak PBS-bazal membran matris karışımı ile nakledilen kontralateral over yağ yastığı sistemi (adım 2.9 bakınız). Düzeltmek ve aynı şekilde işlem. </li><li> sabitleme yıkamadan sonra, 5 dakika boyunca PBS ile üç kere, doku ve 4 ° C de PBS içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> yumurtalık yağ yastığı tüm montaj görüntüleme için 3.2.1 adıma geçin. Not: görüntü alma dokular dondurulmuş olabilir sonra (3.3.1) ya da parafine (3.3.2) için işlenmiş. 4 ° C&#39;de PBS içinde% 30 sukroz içinde bir gece inkübasyon donmuş dokular kalitesini artırır. </li></ol></li><li> Görüntü edinme <ol><li> Bir floresan eki, renkli kamera ve Plan ile donatılmış 4, 10x hedefleri ve stereomikroskopta, epi-floresan eki ve yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış PBS dolu yemekleri ve ters bir mikroskop kullanılarak görüntüde yumurtalık yağ yastığı sistemleri-bütün montaj yerleştirebilirsiniz apo 1xWD70, ED Planı 1.5xWD45 hedefleri. </li></ol></li><li> histoloji <ol><li> Takip etmetüm montaj görüntü toplama (3.2.1) Laboratuvar film ve forseps kullanarak bir 2 x 1 cm parçası üzerinde dondurulmuş doku örnekleri için orta gömme bir 200-500 ul damla yerleştirin damlasına kadar doku aktarın. bir kenarda filmi Pick up ve 1.8 ml kriyojenik flakon doku orta damla aktarın. şişeyi kapatın ve sıvı azot içine dalma. -80 ° C&#39;de donmuş dokular saklayın. </li><li> Alternatif olarak, standart parafine devam edin. Her adım için doku hacminin 20-40 hacimleri kullanın. <ol><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 65 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 70 etanol içinde dokuların bırakın. Bu aşamada örnekler oda sıcaklığında ay depolanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 90 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 95 etanol içinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca iki kez mutlak etanol (200 proof) içinde dokuların bırakın. </li> &lt;li&gt; RT&#39;de hafifçe sallayarak, 30 dakika boyunca kloroform iki kez dokuları daldırın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 30 dakika için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 12 saat için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de, 3 saat parafin kez dokuları bırakın. </li><li> Metal histoloji kalıplarında dokuları koyun ve 58 ° C parafin ile kalıpları doldurun. parafin üstüne plastik bir histoloji kaseti ekleyin ve + 4 ° C&#39;ye kadar parafin soğutmak. Oda sıcaklığında parafin doku blok ve mağaza ayıklayın. Not: Parafin sıcaklığı immünohistokimyasal için uygun dokuda optimal korunması için 58 ° C&#39;yi geçmemelidir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, Örnek İşleme Jel ile Parafin Gömme hazırlanın. <ol><li> PBS aspire ve% 70 etanol ile tüm montaj dokuları aktarın. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. bir su banyosu içinde, ön-ısıtma numune, 60 ° C&#39;ye jel işlem. </li><li> Pipette laboratuar film kaplı Petri kabı üzerine numune işleme jel 200 ul. Kullanarak ince diseksiyon forseps numune işleme jel düşmesi tüm montaj doku sistemini aktarmak. </li><li> örnek işleme jel yatağından oda sıcaklığında katılaşan, ya da 4 ° C &#39;de 10 dakika süre ile fiş katılaşmasına izin verin. </li><li> biyopsi köpük pedler arasına sıkıştırılan histoloji doku kasetlerde örnek işleme jel gömülü doku yerleştirin. adımlarda 3.3.2-3.3.2.10 gibi parafin gömün. Not: Numune işleme jel gömme kaybını önler ve küçük kırılgan doku örneklerinin korunmasını sağlar. Not: dondurma ya da parafine korunmuş dokular immünohistokimyasal 14,15 için uygundur. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+human+mammary+tissues+in+a+mouse+model.">Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model.</a> Nature protocols. 1, 206-214 (2006).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+breast+carcinomas+and+the+cancer+stem+cell+hypothesis.">Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).</li><li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA(H1047R)+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours.">PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525, 114-118 (2015).</li><li>Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -. P., Roy-Burman, P., Bagley, R. G., Teicher, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+stem+cells+and+cancer+in+animals.">Prostate stem cells and cancer in animals.</a> Stem Cells and Cancer. , 199-216 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160, 324-338 (2015).</li><li>Lu, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cell+populations+in+sweat+glands+and+ducts+reveals+roles+in+homeostasis+and+wound+repair.">Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair.</a> Cell. 150, 136-150 (2012).</li><li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche.">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li><li>Orsulic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ovarian+cancer+by+defined+multiple+genetic+changes+in+a+mouse+model+system.">Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system.</a> Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).</li><li>Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+ovarian+transplants+to+rescue+a+transgenic+line+of+mice.">Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice.</a> Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).</li><li>Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+therapeutic+treatments+in+an+orthotopic+mouse+model+of+ovarian+cancer.">In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Albihn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+capsular+material+by+equine+trophoblast+transplanted+into+immunodeficient+mice.">Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice.</a> Reproduction. 125, 855-863 (2003).</li><li>Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+knock-in+Foxj1(CreERT2::GFP)+mouse+for+recombination+in+epithelial+cells+with+motile+cilia.">A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia.</a> Genesis. 52, 350-358 (2014).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).</li><li>Capo-Chichi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+of+the+extracellular+environment+of+ovarian+surface+epithelial+cells+in+premalignant+transformation,+tumorigenicity,+and+metastasis.">Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis.</a> Cancer. 95, 1802-1815 (2002).</li><li>Roland, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+surface+and+cyst+epithelial+basement+membranes+and+preneoplastic+morphologic+changes+in+prophylactic+oophorectomies.">Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies.</a> Cancer. 98, 2607-2623 (2003).</li><li>Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+stem+cell+niche+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancers.">Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers.</a> Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).</li><li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovary+and+fimbrial+stem+cells:+biology,+niche+and+cancer+origins.">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469, 314-322 (2011).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2015.">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+high-resolution+imaging+of+epithelial+ovarian+cancer+by+laparoscopic+nonlinear+microscopy.">Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy.</a> Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Epitel hücrelerin ve dokuların doğru teslimat saptanmasına izin verir, bir yumurtalık yağ yastığı nakli deneyi kurduk. Yumurtalık yağ yastığı tahlil nakli prosedürü daha az teknik açıdan zor intrabursal enjeksiyon 10-12 daha ve daha düzgün ve intraperitoneal enjeksiyon 9 ile karşılaştırıldığında nakledilen hücrelerin tam yerini sağlar. Aynı zamanda, iyi bir rahim tüp gibi bir organ, uzun süreli nakli için uygundur. Önemlisi, yumurtalık yağ yastığı kadın üreme sisteminin epitel için tanıdık bir mikro sağlar. Bu rejenerasyon ve habis dönüşüm sırasında insan ve fare yumurtalık ve tubal epitel hücrelerinin moleküler ve hücresel çalışmalar için özellikle uygun olacaktır. Diğer organlarda aksine, çok az çalışma dişi r epitelde tanımlanması ve kök hücrelerin karakterizasyonuna odaklanmıştıreproductive yolu 18,19. Birçok kanser yetişkin kök hücrelerin 20 kaynaklandığı düşünülmektedir, çünkü bu tür çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Epitelyal over kanserlerinin henüz hücresel kökenleri 18 derece tartışmalı kalır. Epitelyal over kanserleri, yumurtalık kanserlerinin çoğunluğu için hesap ve ABD&#39;de 21 kadın tüm kanser bağlı ölümlerin arasında 5. sırada yer almaktadır. Mevcut transplantasyon teknikleri 9-12 üzerinde çeşitli avantajları ile ortotopik tahlil Böylece gelişme büyük ölçüde bu alandaki çalışmaları kolaylaştıracaktır. yumurtalık yağ yastığı yüzeysel konumu göz önüne alındığında, küçük hayvan görüntüleme sistemleri güçlü floresan veya bioluminescent gazetecilere ile etiketlenmiş engraftments takip etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu doğrusal olmayan mikroskopi 22 minimal invaziv yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme deneyleri, kurulması mümkün olmalıdır. yumurtalık yağ yastığı da organ kültürleri tutulabilir, böylece izinyakından hücrelerin organizasyonu ve hücre dışı matriks yansıtan koşullar altında normal ve neoplastik epitel üç boyutlu kültür ing. Gelecekteki çalışmalar bu umut verici olanakları ele almalıdır. Birkaç kritik adımlar dikkate alınmalıdır. bir ısıtma yastığı sağlanması ve ameliyat sırasında sıcak kemirgenleri tutarak büyük ölçüde hayatta kalma oranını artırır. yağ yastığı taşıma araçlarının Sterilite engrafted sistemler steril tutulmasını sağlar. Bizim deneyim, nakli büyüme geriliği önemli kanama sonuçlarında. Önemlisi, yağ yastığı kesi kesin yapılmalıdır yağ yastığı yırtılma veya kanama nedenleri aracılığıyla delinmesiyle çünkü. Koagülantlar gerekli kanamayı durdurmak için kullanılmalıdır. gelişmez engraftments takdirde, enjekte edilen hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu dikkate alınmalıdır. İlk başarılı çıkıntılar transplantasyon sonrası bir hafta kadar erken gözlenen ve en görünür biri olmalıdır engraftments edilebilirİşlemden sonra ay. nakli için, daha büyük bir çapa (23-25 ​​G) iğneler (çapı 10 um) üzerinden büyük hücreler kesme önlemek için de kullanılabilir. Ancak, bu tür iğneler yağ yastığı daha travmatik olabilir ve bunların kullanımı önceden test edilmelidir. Deneyler için biz 6 ila 8 hafta eski donör ve alıcı fareler kullanılmıştır. her iki amaç için daha küçük veya daha büyük farenin kullanılabilir. Bununla birlikte, enjekte edilen hücrelerin sayısı ayarlanması gerekebilir. genç vericilerden over yağ yastıkları küçük boyutta da dikkate alınması gerekir. herhangi bir yöntem olduğu gibi, fare yumurtalık yağ yastığı nakli testinin bazı sınırlamalar vardır. singeneik immüno-kompetan farelerde kemirgen birincil hücreler / dokular için kullanılabilecek olsa da, bizim teknik NTG veya insan malzemenin nakli için SCID fareleri gerektirir. Insan epitelyum hücrelerinin gelişimini desteklemek için yağ yastığı humanize mümkün muhtemeldir. Ancak, henüz bu yaklaşımı test değil. Genç fe Kullanımıerkekler daha düşük üreme maliyetleri yol açabilir; Bununla birlikte, yetişkin bakire dişi fareler (8 ila 10 haftalık) ve böylece daha büyük bir örneklerin nakli sağlayan daha büyük bir yağ yastığı bulunmaktadır. Son olarak, laboratuvar personeli prosedürün zamanında ve başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlamak, hayvan cerrahisi konusunda eğitilmelidir.

farelerde belirli vücut sitelerine hücre ve dokuların getirilmesini, Transplantasyon deneyleri, doku rejenerasyonu ve karsinogenez çalışmaları için önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir. hücrelerin Ortotopik transplantasyonlar, yani, bir ana ortamın içine yerleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin tanımlanması için özellikle önemlidir. Meme kök hücrelerin varlığı ilk farelerin 1 bezi serbest meme yağ pedleri içine epitel meme bezi parçalarının nakli önerildi. Insanlaştırılmış fare yağ yastığı 2 Aşı deneyleri, insan primer meme epitelyal hücrelerinin yeniden üretilebilir potansiyel ve normal gelişim özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, temizlenmiş ve memenin yağlı pedine fenotipik farklı hücre tiplerinin seri ve sınırlayıcı seyreltme transplantasyon meme kök hücrelerin 3-5 kendini yenileme ve multilinaj farklılaşmasını test etmek için çok önemliydi. combinat Transplantasyon deneyleriGenetik soy iyon meme karsinogeneziste 5 menşe hücrenin kanıt sağladı izleme. Böbrek kapsülü nakilleri sıklıkla putatif prostat kök hücreler 6 özelliklerini test etmek için kullanılmıştır. Normal ve neoplastik fare ve insan pankreas organoids ortotopik transplantasyon kanseri ilerlemesinde 7 değişmiş genleri ve yollar ortaya çıkardı. Yerli çevrenin önemi de sonra bu tür meme yağ yastıkları, omuz yağ pedleri ve arka cilt 8 olarak farklı yerlerde, içine ter bezlerinin engraftments farklı rejenerasyon gösterilmesi tarafından desteklenmektedir. Periton boşluğu ve yumurtalık bursa, genellikle dişi üreme yolunun 9-12 epitel hücrelerinin ortotopik transplantasyon için yerler olarak kullanılır. Bu yöntemlerin her ikisi de sınırlamaları bir dizi. hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu karın boşluğu farklı alanlarda implantasyon yol açar, bu şekilde comhücre büyümesini izlemek plicating. Ayrıca, mikro-varyasyonlar, örneğin damarlanma, innervasyon ve immün hücre temsil uzantısı olarak, periton boşluğu farklı alanlarda oldukça önemli olabilir. Yumurtalık bursa sıvının en fazla 10 ul enjekte etmeyi sağlamak, çok sınırlı bir hacme sahiptir. Bu önemli ölçüde tatbik edilebilir hücre miktarını sınırlar. Ayrıca, yumurtalık bursa içine enjeksiyonlar oldukça teknik olarak zor olabilir ve işlem süresi önemli miktarda gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz yumurtalık yağ yastığı özelliklerinin avantajlarından almış. Fare yumurtalık yağ yastığı, büyük bir boyuta sahip yumurtalık ve rahim tüp bitişik ve cerrahi ile kolayca erişilebilir. At trofoblast mouse over yağ yastığı 13 naklediliyor edilebileceği bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin ayrıntıları tarif edilmemiştir. Aynı zamanda bu benim eğer rapor değilmetod ile yetişkin hücre ve dokuları için uygulanabilir. Burada, fare ve dişinin üreme kanalında insan hücrelerinin nakli için güvenilir bir yöntem anlatılmaktadır, bu yöntem, aynı zamanda, uzun süreli, organ nakli için de uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:339px;">BD Becton Dickinson</td>
			<td style="width:155px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)</td>
			<td style="width:339px;">Kendall</td>
			<td style="width:155px;">30339</td>
			<td>Part Number: 8881500014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">basic fibroblast growth factor-2</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">F9786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">basement membrane matrix (Geltrex)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-actin-DsRed mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">6051</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-actin-EGFP mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">3291</td>
			<td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">bovine albumin</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">chloroform</td>
			<td style="width:339px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">EM-CX1058-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">collagenase/hyaluronidase</td>
			<td style="width:339px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">cryogenic vials</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:155px;">377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">dispase II</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:155px;">NPRO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DMEM F12 (HAM&#39;s)</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNaseI (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td style="width:339px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td>
			<td style="width:339px;">Sakura Finetek&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">epidermal growth factor</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:339px;">Koptec</td>
			<td style="width:155px;">V1001</td>
			<td>to prepare 70%&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">filter tip 0.1-10/20&#181;lXL&#160;</td>
			<td style="width:339px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:155px;">1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FOXJ1 antibody</td>
			<td style="width:339px;">eBioscience</td>
			<td style="width:155px;">E10109-1632</td>
			<td>used at concentration 1:1000 (no unmasking)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">hydrocortisone</td>
			<td style="width:339px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">laboratory film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:339px;">American National Can</td>
			<td style="width:155px;">PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">insulin-transferin-sodium selenite</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">I884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">isoflurane, 250 ml</td>
			<td style="width:339px;">Santa Cruz Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">low attachment plate 24-well</td>
			<td style="width:339px;">Costar</td>
			<td style="width:155px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">metal histology molds</td>
			<td style="width:339px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:155px;">62527-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microscope, inverted</td>
			<td style="width:339px;">Nikon</td>
			<td style="width:155px;">Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microscope, stereo</td>
			<td style="width:339px;">Nikon</td>
			<td style="width:155px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:331px;">Nod/SCID/gamma (NSG) mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">05557</td>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td style="width:339px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:155px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">paraffin (Paraplast, X-TRA)</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">23-021-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PAX8 antibody</td>
			<td style="width:339px;">Proteintech</td>
			<td style="width:155px;">10336-1-AP</td>
			<td>used at concentration 1:1000 (no unmasking)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">&#160;21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:331px;">severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)</td>
			<td style="width:339px;">NCI-Frederick Animal Production Program</td>
			<td style="width:155px;">01S11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">specimen processing gel (HISTOGEL)</td>
			<td style="width:339px;">Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:155px;">HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sucrose</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Trypsin-EDTA, 25%</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation into the mouse ovarian fat pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

Deneysel hücreler ve dokular doğru bir diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) altında yumurtalık yağ yastığı içine transplante edilebilir. Örnekler her yerde görülen EGFP (Şekil 2A) ya da DsRed (Şekil 2B) ve HIO118 16,17 hücreleri MCherry ve EGFP lentivirüs ile işaretlenmiş insan immortalize over yüzey epitel hücrelerinin (F - Şekil 2C) eksprese eden farelerden türetilen birincil fare tüp epitel hücrelerini içerir. Yaklaşım, aynı zamanda, fare uterus borusu (Şekil 3) gibi organların, uzun süreli nakli için geçerlidir. Immünohistokimyasal boyanma göre, her iki kirpikli (FOXJ1 pozitif 14) ve salgı (PAX8 pozitif 15) hücreleri nakledilen dokuların (Şekil 3B ve E) tuba epiteli korunur. <imgalt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. Transplantasyonu (ok) Yumurtalık Yağ Pad Nakli (A) Exposed alan. (B) Bir kesi 28 G iğne (ok) tarafından yapılır. Pipet (ok) (C) UT / bazal membran matris karışımı aşılanmasına. (D) UT engrafted (ok, parlak kırmızı, β-aktin-DsRed farelerin UT). FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. Ölçek çubuğu = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> Şekil 2:. Nakledilen Fare İlköğretim Tüp Epitel Hücreleri ve İnsan Algılama ölümsüzleştirdi Yumurtalık Yüzey Epitel Hücreleri (A, B) Out<html> birincil fare tüp epitel hücrelerinin 8 gün singeneik fare transplantasyon sonrası (A, yeşil) ve β-aktin-DsRed (B, kırmızı) β-aktin EGFP farelerin (oklar) büyümeleri. (C, D), 10 gün NTG farelere transplantasyonu sonrası Lenti-EGFP (yeşil) veya Lenti mCherry (kırmızı) ile ya etiketli karışık HIO118 hücrelerinin (oklar) Engraftments. (D) (C, ok) Genişletilmiş alan. (E, F) Greft SCID fare (oklar) D, 43 gün C ile aynı hücre naklinden sonra geliştirdi. AD, F, floresan; E, parlak bir alan, FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A, B, DF) Ölçek çubuğu = 500 mikron; (C) Ölçek çubuğu = 1.600 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reklam / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Uterus Tüp nakli Karakterizasyonu. (A) β-aktin-DsRed fare 6 gün yumurtalık yağ yastığı içine naklinden sonra tam rahim tüp (ok) (ok, parlak kırmızı). (B) (a) &#39;da gösterilen transplant yağ yastığı Floresan frozen. Kırmızı, DsRed; Mavi, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer counterstaining. (C) Rahim tüp greft (ok) NSG alıcı fare (ok) içine nakli sonrası 40 gün. Parafin bölümü. Doğru tüm ilke rahim tüp bileşenlerinin korunması ve transplantasyon ilişkili fibrozis ve inflamasyon olmayışına dikkat edin. Hematoksilen ve eozin boyama. (D, E) Algılama tuba epiteli işaretçileri Eşli kutu geni 8 (PAX8) ve Forkhead kutusunun J1 ve (FOXJ1 kahverengi nükleer renk, ok başları) gösterilen greft (oklar) hücrelerinde ( <sTrong&gt; C). Immünoperoksidaz sistemi. metil yeşili ile karşıt. FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A) Ölçek çubuğu = 1,000 mikron; (B) Ölçek çubuğu = 200 mikron; (CE) Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 1x DMEM F12 (Ham&#39;ın) orta </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum pruvate </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Epidermal büyüme faktörü </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> Temel fibroblast büyüme faktörü-2 </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> hidrokortizon </td><td> 500 ng mL -1 </td></tr><tr><td> ensülin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> sodyum selenit </td><td> 5 ng ml -1 </td></tr><tr><td> sığır albümini </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 100 birim mi -1/100 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Minimum gerekli ortam (MEM) temel olmayan amino asitler, </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Beta-merkaptoetanol </td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Fare Tüp Epithelim Gelişim Ortamı (M-TE-GM) Bileşenler sol sütununda sıralanan 1x DMEM F12 belirtilen konsantrasyonlarda (Ham) orta, sağ sütunda çözündürülür. Nihai orta kompozisyon serbest serum olduğunu.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad at JoVE.com

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar.

Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

transplantation-into-the-mouse-ovarian-fat-pad

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K Görüntüleme.  Cornell University.  Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar. 

Video: Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Amiloid için Anterior Fat Pad FNA Sahne ve İşleme

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Tıp

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS kolit Modelleri: Koliti içine Trendleri ve Diyet Yağ Etkileri sağlanması

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

Heterotopik Kalp Nakli bir Fare Modeli Kullanarak Pulmoner Vana Nakli

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Fare Böbrek Transplantasyonu: Allogreft Reddi Modelleri

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Mikro-Bilgisayarlı Tomografi ile Çıplak Fareler içine İnsan Yağ Enjeksiyonu Canlılığına Değerlendirilmesi

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).