Name: single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Membran Sac Hazırlama ve Fiksasyon <ol><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 ile etiketlenmiş zar levhaları hazırlanması <ol><li> DNA plazmid kodlayan iRFP-PAmCherry1-PH PLC, standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak 23 δ1 hazırlayın. </li><li> Kültür INS-1 # 1.5 ile hücreler 18 mm yuvarlak lamelleri standart INS-1 hücre kültürü protokolleri 38,39, aşağıdaki% 50-70 konflüansa 30 | ig / ml fibronektin ile önceden kaplanmış. 50 ila 70% konfluansa ulaştığında sonra hücreler bir gün transfekte. </li><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC ile transfekt hücreleri, üretici protokollerine göre lipozom transfeksiyon ayıracı kullanılarak δ1. Transfeksiyondan sonra, hücreler 48 saat için büyümeye olanak sağlar. </li><li> Deney gününde, ~ 0.5 ile kat lamelleri (tek tarafında) - 500 ug / mL poli-D-lizin, 1 ml, 1-2 saat süre ile (PDL dH 2 O seyreltilmiş). Sonra bir kağıt mendil koyarak PDL tahliyelamel kenarı. daha sonra kullanılmak üzere bir önceden soğutulmuş (4 ° C) metal levha üzerine lamelleri yerleştirin. </li><li> 1 mM EGTA ihtiva eden 1 ml buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) -, 0,5 lamelleri artan ön-transfekte edilen INS-1 hücreleri yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın ve PBS boşaltın. </li><li> cımbız ile önceden soğutulmuş metal levha üzerine PDL kaplı lamelleri kültüre hücreleri (hücre tarafı aşağı bakacak şekilde) ile lamelleri yerleştirin. Hücreler PDL kaplı lamelleri (Şekil 2) takmak için izin 10 dakika - 7 buzdolabında (4 ° C) plaka bırakın. Not: kuluçka süresi 7 aralığında olmalıdır - PDL kaplı yüzeye hücrelerin daha bağlanması için 10 dakika. buzdolabı ortamı kuru ve inkübasyon çok uzun olmamalıdır. </li><li> buzdolabından metal plaka çıkarın. Yavaşça cımbız kullanarak ön-transfekte hücreleri içeren lamel soyulabilir. Bu hücre zarı tabakanın ince bir tabaka oluştururlamel PDL kaplı. Yavaşça ~ 0.5 membran yaprak yıkama - 1 mi buz gibi soğuk PBS ve sonra ~ 0,5 tamir - 1 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) + 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 glutaraldehid (GA). Dikkat: formaldehit ve glütaraldehit zehirlidir. cilt ve göz koruması ile bir davlumbaz onları idare. </li><li> Tespit edildikten sonra, resim zar levhaları hemen (bölüm 3) ya da ~ 0.5 depolamak - 4 ° C&#39;de 1 ml PBS. Not: Membran tabaka çözdükten sonra sitoplazmada PI (4,5) P2 PH probları bağlama herhangi bir denge olacaktır. bağlı PH sondaları kademeli olarak membran tabakasından ayırmak ve (o hafta gün sürebilir rağmen) çözeltisi içine yayılır. Bu nedenle, doğru numune hazırlandıktan sonra görüntüye sabit örnekleri tavsiye edilir. </li></ol></li><li> PI (4,5) P2 özel antikor etiketleme için membran sayfaları hazırlamak <ol><li> Kültür INS-1 # 1.5 ile ilgili hücreler, 30 &#39;ile önceden kaplanmış 18 mm yuvarlak lamelleri# 181; g / ml fibronektin 50 ila% -70% izdiham. Aşama 1.1.3 tarif edildiği gibi DNA ile transfekt hücre Ertesi gün plazmit. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 1.1.7 için 1.1.4 den adımları tekrarlayın. NOT: 4 ° C&#39;de aşağıdaki prosedürleri uygulayın. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk PBS, 50 mM NH4CI ihtiva eden - ~ 0.5 olan sabit PM levhaları üç kez ihtiva lamelleri yıkayın. ~ 0.5 olan yaprak söndürün - 7 dakika boyunca PBS içinde 1 ml% 0.1 sodyum borohidrid ve yıkayın ~ 0,5-1 ml PBS (50 mM NH4CI olmadan). </li><li> Bloke etme çözeltisi, 1 ml, 45 dakika (% 5 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 5 (h / h) sığır serum albümini ve 50 mM NH4CI ihtiva eden PBS çözeltisi) -, 0,5 örnekleri bloke. 1 saat için çözüm engelleme: (300 seyreltme 1) 1 ml primer PI 2 antikoru (4,5) P - Sonra, ~ 0.5 ile kuluçkaya yatmaktadır. 1 ml PBS, 50 mM NH4CI ihtiva eden - ~ 0.5 ile üç kez (10 dakika, her zaman) yıkayın. </li><li> 1 mi sekonder F (ab &#39;) 2 keçi anti-fare - ~ 0.5 olan örnekleri inkübe1 saat süre ile blokaj tamponu: florofor (300 1) ile konjuge antikor. 1 ml PBS - ~ 0.5 ile üç kere yıkanır. </li><li> post-düzeltme örnekleri% 4 PFA +% 0.2, GA, 15 dakika boyunca, daha sonra, PBS (7 dakika, her zaman) olan numuneler, üç kez yıkayın. Görüntüleme için, Bölüm 3 geçin veya daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C ± 0.5 ~ 1 ml PBS içinde depolar. Not: 4 ° C&#39;de numune hazırlayın. PM fosfoinositidlerde fizyolojik dağılımını korumak için% 4 PFA +% 0.2 GA fiksatif kullanın. Yalnız% 4 PFA ile RT hazırlanması veya tespit önemli eserler (Şekil 4) neden olabilir. </li></ol></li></ol> MEOS3.1-PH PLC δ1 ile Canlı hücre Görüntüleme için 2. Hücre Kültürü Hazırlanması <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 23 mEOS3.1-PH PLC δ1 kodlayan DNA plazmid hazırlayın. </li><li> # 1,5 18 mm Kültür INS-1 hücreleri yuvarlak lamelleri 30 mg / ml fibronektin onlar ulaşana kadar% 50 -70% confl ile önceden kaplanmışStandart INS-1 hücre kültürü protokolleri 38,39 aşağıdaki uency. </li><li> Ertesi gün, DNA, plazmid üreticinin protokolü takip lipozom transfeksiyon ayıracı kullanılarak δ1 mEOS3.1-PH PLC INS-1 hücreleri transfekte. görüntüleme önce 48 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Membran Sheets ve Canlı Hücre 3. PALM Image Acquisition <ol><li> Membran levhalar PALM görüntü elde etme NOT: Burada, bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskop tabanlı SMLM sistemi (100X yağı, APO, NA = 1.49, WD 0.12 mm) 23 tüm görüntü elde etmek için kullanılır. <ol><li> Görüntüleme önce, 10 ml PBS + 50 mM MgCl2 floresan boncuk çözeltisi 1 ul seyreltilir. 10 dakika boyunca (adımlarda 1.1.8 / 1.2.6 itibaren) görüntüleme odası içeren hücre örneklerinin içine çözüm seyreltilmiş 200 ul ekleyin. Daha sonra, PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> PALM görüntüleme sistemi başlatın. ilişkili görüntüleme yazılımı olarak, &amp; &quot;iRFP kanalını seçin# 34; düğmesi (642 nm lazer uyarma, 700/75 nm emisyon). iRFP kanal pH probları eksprese eden hücre membranı Bul. NOT: Membran levha yakın bir floresan boncuk olmalıdır. Bu, daha sonra kayma düzeltme için gereklidir. </li><li> Gelecekteki görüntü rekonstrüksiyon için bir referans olarak iRFP kanalında hücre zarının geleneksel TIRF görüntü toplamak için &quot;Yakalama&quot; düğmesini kullanın. Görüntüleme ayarı TIRF açısı 2140 yazarak normal TIRF açısı (yani, kritik açı ulaştıktan sonra, başka bir 1.5 derece dönüş) ayarlayın. Aksi belirtilmediği sürece tüm adımlar için ayarı bu açıyı kullanın. NOT: Burada anlatılan TIRF sisteminde, 3,500 2,200 TIRF kritik açı ve 2140 TIRF kritik açı sonra 1.5 derece daha normal TIRF açısı olduğunu, yukarı dikey açısıdır. 3.2.3 aşağıda belirtilen dar TIRF açısı TIRF kritik açı ulaştıktan sonra başka bir 2 derece olan 2120 olduğunu. </li><li> th tıklayarak PAmCherry1 kanalına geçine RFP kanal düğmesi (561 nm uyarma, 600/50 nm emisyon filtresi). Arka plan membran floresan ağartmak için 10-20 saniye boyunca 561 nm lazer tam güç aydınlatmaya sahip sağa &quot;AOTF&quot; pad tüm yol kaydırma çubuğunu ayarlayın. </li><li> &quot;Format&quot; sekmesine ve &quot;ND dizisi edinme&quot; sekmesinde hızlı alım protokolünde optimum kamera ayarı (2x2 binning) Set (tipik olarak 20 Hz 10,000-40,000 görüntü). </li><li> &quot;Şimdi Çalıştır&quot; butonuna tıklayarak - düşük seviyede (% 1% 0.1) de eş zamanlı 405 nm lazer aktivasyonu ile PAmCherry1 görüntüleri (tam güçte 561 nm lazer, 50 milisaniye / çerçeve) edinimini başlatın. Her karede o uzamsal izole bireysel noktaları kolayca tanımlanabilir böylece 405 nm lazer yoğunluğunu ayarlayın. NOT: aktive edilebilir PAmCherry1 moleküllerinin sayısının alımı sırasında yavaş yavaş azalır. 405 nm lazer yoğunluğu tedricen her ayrı molekül sinyallerinin uygun yoğunluğunu tutmak için artırılmalıdırçerçeve. </li><li> Hiçbir PAmCherry1 tek molekül sinyali devreye kadar görüntü almak devam edin. </li></ol></li><li> canlı hücrelerde PALM görüntüleme <ol><li> Aşama 3.1.1 tarif edildiği gibi görüntüleme önce, 10 dakika süre ile görüntüleme odasına flüoresan boncuklar seyreltin. Sonra ilişkili görüntüleme yazılımı açarak PALM görüntüleme başlayın. NOT: canlı hücre görüntüleme için manyetik hızlı çıkarma görüntüleme odası kullanın. 135 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.6 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 3 mM glukoz ve 20 mM: hücre dışı tamponu (hücre-dışı çözelti sürekli perfüzyon altında bir ısı kontrol 35 ° C&#39;de görüntüleme alanının merkezine sahip HEPES, pH = 7.3). </li><li> GFP kanal düğmesine (525/50 nm emisyon) seçin. 488 nm lazer uyarma altında mEOS3 yeşil floresan dayalı flüoresan millerini ifade hücre zarı tanımlayın. Yakın zamanda bu şekilde görüntüleme sırasında yer almaktadır floresan boncuk çevrimdışı Sondaj için daha sonra gerekli olduğundan emin olunft düzeltme. </li><li> Bir referans görüntü olarak mEOS3 (yeşil) kanal hücre zarının bir TIRF görüntü toplamak için &quot;Yakalama&quot; butonuna tıklayın. canlı hücre görüntüleme ayarı TIRF açısı 2120 yazarak (kritik açı ulaştıktan sonra, başka bir 2 derece dönüş) sığ kaybolan dalga uyarma aydınlatma kullanın. Not: Bu, plazma zarına sitosol bitişik bağlanmamış mEos3-PH floresan en aza indirir. </li><li> &quot;RFP kanalı&quot; düğmesi (561 nm uyarma, 600/50 nm emisyon) geçin. (3.1.4 bakınız) &quot;AOTF pad&quot; in kaydırma çubuğu ile 10 ~ 20 saniye boyunca membran yaprak arka plan floresan beyazlatmak tam güç 561 nm lazer kullanın. </li><li> eşzamanlı 405 nm lazer aktivasyonu ile ( &quot;kamera&quot; sekme ayar 10 milisaniye / karede set 561 nm tam güç) kırmızı kanalda &quot;Şimdi Çalıştır&quot; butonuna tıklayarak görüntü alımı başlatabilirsiniz. mekansal ayrılmış noktaları aktive etmek için 405 nm lazer yoğunluğunu ayarlayınher çerçeve içinde. NOT: molekül sayısı yavaş yavaş azalır mEOS3.1-PH PLC un dönüştürülmüş δ1 edinme ilerledikçe olarak. Yavaş yavaş tek bir molekülün sinyalini optimize etmek için 405 nm lazer gücünü artırmak. Görüntüleme edinme uzunluğu deneysel amacına bağlıdır. Normal koşullar altında, 5 dakika boyunca sürekli olarak görüntüler elde. Daha uzun bir satın alma gerekiyorsa, bunun yerine tek bir büyük görüntü yığının birden fazla görüntü yığınları toplamak. Her görüntü yığını dosya boyutu 4 GB geçmemelidir veya daha sonra yazılım analizi etkileyecektir. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Görüntü İşleme ve Yeniden <ol><li> Bir görüntü analizi istasyonuna görüntü dosyaları (.tif görüntü yığınları) aktarın. Daha sonra &quot;yeni bir dosya&quot; &quot;açık&quot;, daha önce 37 açıklandığı gibi Matlab görüntü oluşturma programı (özel yazılmış) başlatın ve ana menüde &quot;Dosya&quot; sekmesini tıklayarak Görüntü yığını yükleyin. </li><li> Belirlemek ve locaher çerçeve tek tek moleküler olayları lize. &quot;Dalgacık&quot; bir eşik sayısı (1-10) ile yoğunluk eşik filtreleme ayarlayın. görsel yeniden önce nokta tespiti için en uygun parametre ayarlarını doğrulayın. Ardından &quot;PALM&quot; sekmesine gidin ve görüntü yeniden başlatmak için &quot;bir adım süreci&quot; tıklayın. NOT: nokta tespiti için Yoğunluk eşiği keyfi ve kişisel deneyime bağlıdır. Birkaç çalışmalar ne çok sayıda niteliksiz (dim) puan alır ne de çok sayıda nitelikli (parlak) noktaları filtreler olduğunu optimal algılama eşiğini üretmek için gerekli olabilir. veri analizi optimize etmek için diğer parametreleri ayarlayın. Burada, mahalle mesafesi (kombine bir mesafede komşu karelerde floresan puan) 65 nm (1/2 piksel genişlik) olarak ayarlanmış ve tek bir molekül takılmıştır. Gap çerçeveleri (kombine ve tek bir molekül olayı olarak monte edilen bu çerçeveleri ve mahalle mesafesinde meydana gelen bireysel molekül olaylar) &#39;dirPAmCherry1 görüntüleme 40 26 kare (1.3 sn) olarak ayarlayın. SMLM içinde 40 sayım aşırı önlemek için tek bir molekül prob ve alma hızı özelliklerine göre bu parametreyi ayarlayın. rekonstrüksiyon sırasında floresan boncuklar ile sürüklenme düzeltme uygulayın. <ol><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 etiketli sabit membran yaprak görüntüleme için tek bir süper çözünürlüklü görüntüye 37 içine aynı membran levhadan tüm görüntü yığınlarını yeniden. </li><li> MEOS3.1-PH PLC δ1 etiketli canlı hücre örnekleri, 1000 kare birkaç küçük yığınlarının içine bütün görüntü yığını ayrı 1.000-ardışık kare yığını bir zamansal çözünürlüğe sahip tek bir süper çözünürlüklü görüntü olarak yeniden böylece 10 sn. Sonunda, nihai zaman serisi yığınına 23 içine tüm zaman serisi görüntüleri birleştirir. NOT: canlı hücre PALM görüntülemede, aktif prob az sayıda taşıma veya ayırmak olabilirağartma önce PM PI (4,5) P 2. prob oversampling hesaba katmak için, görüntü analizi sırasında tek bir emisyon olay haline (yerine 65 nm) 130 nm içinde komşu çerçeveler bireysel molekül sinyallerini birleştirir. </li></ol></li><li> Yeniden görüntüler elde ettikten sonra, çift-korelasyon 41 ile molekül yoğunluğu, mikro etki yoğunluğu / boyutunu ve küme analizi ölçmek için Matlab özel olarak yazılmış bir program ile daha fazla görüntü analizi yürütmek. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

membran levha üretimi ve örnek tespit: Sorun giderme için, iki işlem ekstra dikkat gerekir. protokolde tarif edildiği gibi aşama 1.1.6 lamelleri inkübasyon süresi membran levha üretimi için önemlidir. Bizim deneysel koşullar altında optimum inkübasyon süresi 7-10 dakika (Şekil 2). 10 dakika inkübasyon daha uzun veya daha az PDL kaplı lamelleri üzerinde hiçbir zar yaprak yol açacaktır yerine PDL lamelleri ve kısa inkübasyon üzerine membran levhalar sağlam hücreler üretecek. Protokolde tarif edildiği gibi, tespit sırasında fiksatif ve sıcaklık PM PI (4,5) P2 dağılımının muhafaza edilmesi için çok önemlidir. Oda sıcaklığında Fiksasyon ya da tek başına% 4 -PFA kullanımı PM normal lipit dağılımını bozar olabilir. Lipid araştırma membran PALM mikroskopi uygulayarak, biz (4,5) P2, m aracılık önemli bir fosfoinositid PI nanometre ölçekli dağılımını gözlemlemek mümkünherhangi bir temel hücre etkinliklerini. INS-1 hücrelerinde sınırlı konsantrasyon geçişlerini PI (4,5) P 2 Bu mekansal dağılımı, lipid-protein etkileşimleri ve PI bu hücrelerde (4,5) P2 yerel sinyal olaylarını yeniden düşünmek için bir çerçeve sunmaktadır. Ayrıca, bu işin geliştirilen yöntemler, biyolojik süreçlerde Fosfoinosititler çalışma yeni araçlarla sağlar ve böylece, uygun problar diğer zar fosfolipid araştırma uygulanabilir. Deterjan tedavi ve sitoplazmada potansiyel sinyal kirliliği: Bu çalışmada membran tabakaların kullanılması fosfolipid morfolojik çalışmalarda iki önemli endişeleri atlar. Deterjanlar genellikle kümeleme ve PM fosfolipid sinyali anlamlı kaybına neden olurlar. Sitozolik sinyalin kirlenme gibi PI (3,4,5) P3 ve PI (3,4) P2 olarak PM 23 düşük bolluk fosfoinositidlerde durumunda özellikle sorunludur. Membran tabaka numuneleri Circu edebiliyoruzönemli ölçüde kortikal aktin ağ ve klatrin kaplı çukurlar 42,43 plazma membranı ile bağlantılı yapılar, bozmadan bu sorunları mvent. PM PI (4,5) P2 göreceli homojen dağılım fibroblast zarında 44 GST-PH PLC δ1 problar kullanılarak diğer şoklama EM çalışmaları ile iyi bir anlaşma olduğunu. Yanlış örnek işleme koşulları yanıltıcı sonuçlar üretebilir dikkat etmek önemlidir. İlk olarak, daha düşük bir sıcaklıkta (4 ° C) &#39;de tespit adımları ve membran levha üretimi için sabitleyici GA kullanımı için çok önemlidir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, GA olmayan sıcak sıcaklık ve PFC sabitleme hücre PM Fosfoinosititler düzeltmek için yeterli değildir. Bu sağlam PI (4,5) P2 dağılımını bozar ve fizyolojik koşullar altında, canlı hücrelerde gözlenen olmayan keskin kümeleri oluşturabilir. İkinci olarak, PAmCherry1 olarak kullanımıSMLM probu, yerine başka problar daha nicel PALM görüntüleme için çok önemlidir. PAmCherry1 uygulamasının yararı parlaklık, yüksek foto-aktivasyon verimliliği ve en önemlisi, çok sınırlı fotoğraf yanıp sönen olarak iyi karakterize tek bir moleküler fotoğraf fiziksel özellikleri 35,40,45, geliyor. Bu özellikler foto-yanıp sönen potansiyel küme eserler ortadan kaldırmak ve kantitatif membran PI (4,5) P2 moleküler yoğunluğunu analiz etmemizi sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda sınırlamaları vardır. Hücre görüntüleme önce bozulur, çünkü Birincisi, bu çalışmada kullanılan membran levha yöntemi tamamen PI (4,5) P2 fizyolojik dağılımını taklit olmayabilir. Ancak, bizim canlı PALM görüntüleme membran levha örnekleri ile gözlemlenen sonuçları destekleyen, PI (4,5) P2 benzer görece homojen dağılımını göstermektedir. Daha önceki çalışmalarında 23 tartışıldığı gibi İkincisi, SMLM görüntüleme uzmanlık ve ekstra olarak gerektirirTENTION kullanılan sondalar, örnek hazırlama ve fiksasyon, görüntü örnekleme ve yeniden yapılanma gibi farklı süreçler, doğabilecek görüntüleme eserler önlemek için. PH alanı göre sondalar ve antikorlar yaygın fosfoinositid çalışmalarında 46,47 kullanılmıştır da Son olarak, zarda tüm PI (4,5) P2, bu yaklaşım ile tespit etmek mümkündür kalır. Örneğin, diğer endojen proteinlerin bağlı PI (4,5) P2 PH prob veya antikorlar için erişilebilir olmayabilir ve bu durum kendilerini prob uzay engel için PI (4,5) P2 bir küçümsenmesi neden olabilir. Etiketleme PI (4,5) P2 alternatif bir yol orijinal kuyruk bir değişiklik ile En Fluor PI (4,5) P2 48, bir ön-etiketli PI (4,5) P2 analog kullanarak olurdu PI (4,5) P2. onun inositol halka endogenou aynı olduğundan Ancak, hızlı canlı hücre metabolizması diğer fosfoinositid alt tiplere hızla dönüştürülebilirs PI (4,5) P2. Bu canlı hücrelerde bu ön-etiketli PI (4,5) P2 analog sadakatle PI (4,5) P 2 ziyade metabolik ürünlerini temsil edip endişe uyandırmaktadır. Bu nedenle, bazı sınırlamalara rağmen, PH alanı tabanlı sondalar yaygın hücrelerin PM PI (4,5) P2 dağıtım ve dinamiklerini izlemek için kullanılan en iyi prob arasında devam etmektedir. Bu metodolojinin gelecekteki uygulama böyle PI (3,4,5) P3 ve PI (3,4) P2 gibi diğer fosfoinositid çalışmaları, kadar uzatılabilir. Özetle, burada kullanılan yeni SMLM yaklaşımı hücrelerinde fosfoinositid incelemek için yeni yollar açar. Örneğin, PI (4,5), p, 2 kullanarak, özel hücre membran moleküllerinin morfolojik ve nicel çalışma PALM görüntüleme özelliklerinin yanı sıra sakıncaları göstermektedir. Bu yaklaşım çıkarlarının diğer moleküllere adapte edilebilir ve hücre biyolojisi geniş bir uygulama olacaktır.

Fosfoinosititler toplam membran lipidlerine küçük bir kısmı katkıda hücresel süreçlerin çeşitli kritik roller oynar. Onlar 3 rd inositol halkaların geri dönüşümlü fosforilasyon veya defosforilasyonundan türetilen yedi üye, 4 th ve 5. pozisyonları 1 bulunmaktadır. Fosfatidilinositol 4-fosfat (PI4P) ve fosfatidilinositol 4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) hücre plazma zarı (PM) 2,3 belirleyici lipidler gibi nispeten bağımsız işlev iki büyük fosfoinositidler vardır. Fosfatidilinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) daha az bol PI4P ve PI (4,5) P2 daha, ancak kanser 4 ve diyabet 5 dahil olmak üzere farklı hücresel süreçleri benzersiz işlevleri vardır. Bu lipidler kendi etkileyiciler ve birçok diğer proteinler ile kompleks moleküler etkileşimler vardır. Nedenle, bu pho mekansal organizasyonunu anlamak için çok önemlidirnanometre ölçeğinde PM sphoinositides. Montaj kanıtlar sınırlı PM alanlarında protein kompleksleri veya molekül kümeleri noktaları 6 sinyal olarak hizmet verebilir göstermiştir. Örneğin, sintaksin 1a, membran füzyon 7-9 düzenleyen önemli bir protein PM küme organizasyonunu gösterir. sintaksin 1a küme organizasyonunun uzlaşma görünümünden ayrı, PM fosfoinositidlerde mekansal dağılımı tartışmalıdır. PI (4,5) P2 dağılımları kullanılan kümeleri 14-18, hücre türlerine bağlı olarak ve deneysel yöntemler yoğun üzere, üniforma 10-12, büyük yamalar 13,14 arasında değişmektedir. Yüksek çözünürlükte PI (4,5) P2 mekansal organizasyonu da tutarsızdır. Uyarılmış emisyon-tükenmesi ile bir çalışma (STED) mikroskopi 19 yoğun PI (4,5) P2 nano kümeleri çok sayıda ortaya koymuştur (~ çapı 73 nm) PC-12 hücrelerinde 20 PM levhalar </s&gt; Yukarı. Bu sonuç, hızlı dondurma elektron mikroskobu (EM) 21,22, kimyasal sabitleme çok daha iyi, canlı hücrelerin sağlam PM yapısını koruyan bir yaklaşım kullanarak çalışmalardan farklıdır. İkinci PI (4,5) P2 belirgin havuzu gösterdi; Nispeten konsantre PI (4,5) kaveolanın ve kaplamalı çukurlara P 2 yanı sıra düz PM bölgeye homojen dağılımı. Ayrıca, membran yaprak nano PI (4,5) P2 organizasyon, canlı ve sabit hücrelerde farklılık gösterebilir. Bizim son çalışma tek-molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM) 23 kullanılarak hem sabit hem de canlı INS-1 hücrelerinde bu sorunu araştırdık. SMLM bağımsız flüoroforlar, yüksek hassasiyet ile lokalize edilebilir ve böylece stokastik herhangi bir zamanda florofor yalnızca küçük bir bölümünde devreye dayanır. Birçok süper çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımları, geleneksel ışık mikroskobu kırınım limitini aşmak için benzer ilkeleri kullanarak geliştirilmiştir böyle birs fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) 24, floresan fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (FPALM) 25, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (Fırtına) 26,27 ve doğrudan STORM (dSTORM) 28. Foto-değiştirilebilir veya ışıkla fluorophores (boyalar veya floresan proteinleri) ile, SMLM teknikleri canlı hücreler 31,32 video-oranı ile nanometre çözünürlükte 24,29,30 de görüntü biyolojik yapıları bilim adamları sağlar. Örnek olarak PI (4,5) P 2 kullanarak, ÖS fosfoinositidlerde ve nano ölçekli dağılımını incelemek için SMLM bir yaklaşım getirdi. Özellikle PI bağlanan PLCδ1 (fosfolipaz C δ1) PH alanı (4,5) P2 PM görüntüleme PI (4,5) P2 alt hücresel dağılımı ve dinamikleri 33,34 için köklü bir sonda olduğu . Biz genetik olarak iki floresan proteinleri, PAmCherry1 35 ve iRFP 36 Bu etki alanını etiketledi </sup&gt; çift renkli füzyon proteininin (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) üretilmesi için (Şekil 1A-B). PAmCherry1 PALM PH alanının fotoaktıfleştırılebılır prob olarak hizmet vermekte ve iRFP PALM satın önce transfekte edilmiş hücrelerin belirlenmesi için genel bir göstergesi olarak hizmet veren . Biz sabit zar tabaka halinde SMLM görüntüleme için bu iki renkli floresan prob geçerlidir. Canlı PALM görüntüleme için, onun daha iyi foton verimliliği ve parlaklık (Şekil 1C-D) mEOS3.1-PH PLCδ1 probu oluşturmak için PH PLCδ1 etki mEOS3 37 yerine PAmCherry1 etiketledi. Insülin salgılayan INS-1 hücreleri 38 PM bu yeni problarla SMLM görüntüleme PI (4,5) ayarlanmıştır bölgelerin çoğunda P2 hem de konsantre PI (4,5) P2 homojen etiketleme ortaya çıkardı seyrek düz PM ve bazı filopodia benzeri yapıların 23 intermixed olan mikro bölgeler. Sonra birPI (4,5) P 2 noScale dağılımı o canlı hücrelerin nasıl işlediğini yeniden düşünmek için bir yapısal temel sağlar.

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk</td><td>Yokogawa</td><td>CSU X-1, 10,000 rpm&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td><td>Agilent</td><td>MLC400</td><td>laser original powers &amp;amp; powers at the end of optical fiber)&lt;br/&gt; 405&amp;nbsp;nm: 15 mW &amp;amp; 13&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 488&amp;nbsp;nm: 45 mW &amp;amp; 42&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 561&amp;nbsp;nm: 45 mW &amp;amp; 40&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 640&amp;nbsp;nm: 35 mW &amp;amp; 16&amp;nbsp;mW.</td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Nikon</td><td></td><td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Nikon acquisition and analysis software (NIS Element)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Warner</td><td>64-0714</td><td>Round 18&amp;nbsp;mm coverslip, #1.5</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 (transfection reagent)</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>#16120</td><td></td></tr><tr><td>PI(4,5)P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53412</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody&amp;nbsp; F(ab&amp;rsquo;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>Tetraspeck beads</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>magnetic quick release imaging chamber&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>Cat#641994</td><td></td></tr><tr><td>temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3780</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldyhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Bizim süper çözünürlük sisteminin yerelleştirme belirsizlik (σ) 14.73 nm 23 olduğunu. TIRF ve PALM görüntüler arasında doğrudan karşılaştırmalar uzaysal çözünürlüğü önemli bir gelişme gösterdi. Şekil 3A-B PI (4,5) P2 antikoru ve iRFP-PAmCherry1-PH PLC ile etiketlenmiş temsili PI (4,5) P2 TIRF görüntüleri gösterir tipik membran yaprak ve canlı hücrelerde δ1. Membran levhalar konvansiyonel TIRF mikroskopi ile görüntüleri gelişmiş yeşil floresan protein etiketli sağlam canlı hücrelerde olanlara oldukça benzer olan (EGFP) (Şekil 3C) (EGFP-PH PLCδ1) PH etki etiketledi. Tüm numuneler problar eşit dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Bunun aksine, numunelerin optimum olmayan sabitleme keskin yoğun PI (4,5) P2 kümeleri ve sinyal yoğunluğundaki bir azalma (Şekil 4) ile sonuçlanmıştır. optimum sabitleme koşulları altında, tO PI sabit hücrelerde (4,5) P2 (Şekil 5) süper çözünürlüklü görüntüler sadece sınırlı konsantrasyon geçişlerini ile PM önemli bir kısmında prob homojen dağılımını ortaya koydu. PI (4,5) P2 prob ile zenginleştirilmiş bazı zar yamalar seyrek dağıtılan ve çeşitli boyutlarda vardı. Canlı hücre PALM görüntüleri (Şekil 6) sabit hücreler olarak benzer bir mekansal dağılımını gösterir. Geniş alanlarda bolluk önemli değişiklikler olmadan PI (4,5) P yerel alanlarda hızlı dinamikleri zaman sonuçları üzerinden 2 sinyal ayrıntılı analizi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Bu çalışmada kullanılan floresan probları Şekil 1. Şema. Sabit membran tabaka deneylerinde kullanılan (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 prob. Geleneksel TIRF görüntüleme (A), 640 mil boyunca<html> Lazer iRFP heyecanlandırmak için kullanılır (Örn: 692 nm; Em: 713 nm). Bu durumda alınan TIRF görüntü PALM görüntüleme (B) ile elde edilen süper çözünürlüklü görüntüleme için bir TIRF referans görüntü olarak hizmet vermektedir. A 405 nm lazer için kullanılan PAmCherry1 fluorofor foto-etkinleştirmek ve bir 561 nm lazer PAmCherry1 heyecanlandırmak için kullanılır (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) PALM görüntüleme için. (CD) canlı hücre deneylerinde kullanılan mEos3.1-PH PLCδ1 sonda. Geleneksel TIRF görüntüleme sırasında (C), bir 488 nm lazer mEOS3.1 (:;: 519 nm Em 506 nm Ex) heyecanlandırmak için kullanılır. (: 573 nm; Em: Ex 584 nm) 405 nm lazer ile Fotoçevrim sonra (D), mEos3.1 kırmızı forma dönüşür. PALM satın almalar için kullanılır ve bir 561 nm lazer <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; INS-1 hücreleri membran levha hazırlanması için Şekil 2. Şema (A). Bir PDL kaplı lamel üzerine aşağı bakacak şekilde kültürlenmiş hücreler ile lamel yerleştirin ve PDL- hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere, 4 ° C &#39;de 7 ~ 10 dakika bekleyin kaplanmış lamel. (B) cımbız ile üst lamel soyun ve PDL önceden kaplanmış lamel bağlı membran sayfasını düzeltmek. (C) Görüntü TIRFM ve PALM ile numune. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Şekil 3. PI (4,5) P2 mekansal organizasyon geleneksel TIRF mikroskop altında membran çarşaf ve sağlam canlı hücreler arasındaki benzer. (A)zar levhaları tipik TIRF görüntüsü% 4 PFA ve% 0.2 GA ile 4 ° C &#39;de sabit. PI (4,5) P2 PI (4,5) P2 spesifik antikor ile etiketlenmiştir. (B) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 ifade INS-1 hücreden bir zar tabaka. Farklı seviyelerde EGFP-PH PLCδ1 ifade iki tam canlı hücre (C) TIRF görüntüsü. Ölçek çubukları: (A): 3 um; (B) ve (C):. 5 mikron <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Şekil 4. PI zar levhaları 2 mekansal organizasyon ortak sabitleme koşulları duyarlıdır (4,5), s. (A) zar levhaları tek% 4 PFA ile 37 ° C &#39;de sabit bir(Şekil 3A&#39;da gibi) PI (4,5) P2, belirli bir antikor ile işaretlenmişlerdir. (B) Membran levha yalnız PFA oda sıcaklığında sabit ve PI (4,5) P2 spesifik antikor ile etiketlenmiş. PI yoğun kümeleri (4,5) P2 probları Şekil 3A&#39;da gösterilen daha da floresans görüntüleri aksine, TIRF mikroskop altında açıkça görülebilir olduğuna dikkat edin. Ölçek çubukları: AB:. 3 mikron <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> PI Şekil 5. PALM görüntüleme (4,5) P 2 sondaları INS-1 hücre PM kendi nanometre ölçekli dağılımını ortaya koymaktadır. (A) iRFP-PAmCherry1-PH ifade INS-1 hücreden bir zar tabakasının iRFP TIRF görüntü PLCPAmCherry1 sinyali yeniden dayalı aynı bölgede PM PALM görüntüsünü İlgili δ1. (B). Homojen PI (4,5) P majör PM bölgeler ve çeşitli PI (4,5) P2 mikro bölgeler 2 mekansal dağılımı unutmayın. (C) (b) &#39;de kutulu bölgesinin büyütülmüş bir görünüşüdür. Oklar seyrek PI (4,5) P2 sondaları ile zenginleştirilmiş PM mikro bölgesini dağıtılan göstermektedir. Ölçek çubukları: A ve B: 3 um; C: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Canlı INS-1 hücreleri Şekil 6. PALM görüntüleme (A). MEos3.1-PH PLC eksprese eden bir canlı INS-1 hücre PI (4,5) P2 ve TIRF resmiδ1. Görüntü hızla PALM edinme (35 ° C) daha önce yeşil kanal satın alındı. (B) 10 sn aralıklarla Sıralı canlı hücre PALM görüntüler. Insets yerel PI (4,5) P2 (B) farklı zamanlarda aynı düz çizgi 1 pozisyon boyunca yoğunluk ve (C) yoğunluk profillerini göstermektedir. 10 saniye içinde onların büyük yerel yoğunluk değişiklikleri unutmayın. (D) PI ortalama yoğunluğu değişikliklerin zaman seyri (4,5), (B) &#39;de geniş bir alana (box2, 3x3 mm) ve küçük daire (3, 4 ve 5, 500 nm çapında) içinde p 2 5 içinde PALM görüntüleme dak (kare / sn 10). Yerel PI (4,5) P2 sondaları hızlı yoğunluk dalgalanmaları Not (daire 3, 4 ve 5) geniş bir alana (kutu 2) çok küçük değişikliklere göre. Belirtilen zamanlarda (B) &#39;de box2 bölgesinde (E) Genişletilmiş palmiye ve görüntüler. Oklar p altında PI (4,5) P2 zenginleştirilmiş membran yamaları gösterirhysiological koşullar. Ölçek çubukları: C: 3 um; E: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif . 

Video: Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Kimya

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Nörobilim

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Biyomühendislik

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Biyokimya

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Biyoloji

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...