This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Membranblatt Vorbereitung und Fixierung <ol><li> Bereiten Membranblätter markiert mit iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 <ol><li> Bereiten Sie die DNA - Plasmid - Codierung iRFP-PAmCherry1-PH PLC 23 molekularen Standardbiologische Techniken mit &amp; dgr; 1. </li><li> Kultur INS-1 - Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deck vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin zu 50-70% Konfluenz folgenden Standard INS-1 - Zellkulturprotokolle 38,39. Transfizieren einen Tag, um die Zellen nach 50 bis 70% Konfluenz erreicht ist. </li><li> Transfizieren Zellen mit iRFP-PAmCherry1-PH PLC &amp; dgr; 1 der Protokolle folgenden Hersteller Liposom Transfektionsreagenz verwenden. Nach der Transfektion erlauben, die Zellen für 48 Stunden wachsen. </li><li> Am Tag des Experiments coat Deckgläser (auf einer Seite) mit ~ 0,5-1 ml von 500 ug / ml Poly-D-Lysine; für 1-2 h (PDL in dH 2 O verdünnt). Dann PDL Drain durch ein Tissue-Papier Platzierung aufder Rand des Deckglases. Platzieren Sie die Deckgläser auf einem vorgekühlten (4 ° C) Metallplatte zur späteren Verwendung. </li><li> Waschen vorge transfizierten INS-1-Zellen wachsen auf Deckgläser mit ~ 0,5-1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM EGTA. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal und Drain-PBS. </li><li> Platzieren Sie die Deckgläser mit kultivierten Zellen (cell-Seite nach unten) auf den PDL-beschichtete Deckgläser auf einem vorgekühlten Metallplatte mit einer Pinzette. Verlassen , um die Platte in einem Kühlschrank (4 ° C) für 7 bis 10 min Zellen zu ermöglichen, den PDL-beschichtete Deckgläser (Abbildung 2) zu befestigen. HINWEIS: Die Inkubationszeit in dem Bereich von 7 sein sollte - 10 min für eine bessere Befestigung der Zellen an der PDL-beschichteten Oberfläche. Der Kühlschrank Umgebung ist trocken und Inkubation sollte nicht zu lang sein. </li><li> Entfernen Sie die Metallplatte aus dem Kühlschrank. schälen Sie vorsichtig das Deckglas die Pre-transfizierten Zellen mit einer Pinzette enthält. Dies erzeugt eine dünne Schicht der Zellmembran Blatt auf derPDL-beschichtete Deckglas. Waschen Sie sich leicht die Membranblätter mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem PBS und dann fix mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) + 0,2% Glutaraldehyd (GA) in PBS für 15 min bei 4 ° C. Achtung: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig. Behandeln Sie sie in einem Abzug mit der Haut und Augenschutz. </li><li> 1 ml PBS bei 4 ° C - Nach der Fixierung Bild sofort die Membranfolien oder lagern in ~ 0.5 (siehe Abschnitt 3). HINWEIS: Nachdem das Membranblatt Fixierung, wird es kein Gleichgewicht sein Bindung von pH - Sonden von Cytosol PI (4,5) P2. Die gebundenen pH-Sonden werden nach und nach aus dem Membranblatt dissoziieren und diffundieren in die Lösung (obwohl es Tage bis Wochen dauern kann). Daher ist es die festen Proben direkt nach der Probenvorbereitung auf Bild empfohlen. </li></ol></li><li> Bereiten Membranblätter für PI (4,5) P 2 - spezifische Antikörper - Markierung <ol><li> Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5, 18 mm rund Deck vorbeschichtet mit 30 &amp;# 181; g / ml Fibronektin zu 50% -70% Konfluenz. Transfizieren Zellen mit Plasmid-DNA, am nächsten Tag als 1.1.3 in Schritt beschrieben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 1.1.4 bis 1.1.7, wie oben beschrieben. ANMERKUNG: Führen Sie die folgenden Verfahren, bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser befestigt PM Blätter enthält , dreimal mit ~ 0,5 bis 1 ml eiskaltem PBS 50 mM NH 4 Cl enthält. Quenche die Blätter mit ~ 0,5-1 ml 0,1% Natriumborhydrid in PBS für 7 min, und wasche mit ~ 0,5-1 ml PBS (ohne 50 mM NH 4 Cl). </li><li> Blockieren der Proben mit ~ 0,5-1 ml Blockierungslösung (PBS - Lösung , enthaltend 5% (v / v) normales Ziegenserum, 5% (v / v) Rinderserumalbumin und 50 mM NH 4 Cl) für 45 min. Dann inkubieren mit ~ 0,5-1 ml primären PI (4,5) P 2 - Antikörper (1: 300 Verdünnung) in Lösung für 1 h blockiert. Waschen dreimal (je 10 min) mit ~ 0,5-1 ml PBS 50 mM NH 4 Cl enthält. </li><li> Inkubieren Proben mit ~ 0,5-1 ml Sekundär F (ab &#39;) 2-Ziege-Anti-MausAntikörper mit Fluorophoren konjugiert (1: 300) Puffer für 1 h bei der Blockierung. Waschen dreimal mit ~ 0,5-1 ml PBS. </li><li> Postfix-Proben mit 4% PFA + 0.2% GA für 15 min, dann waschen Proben dreimal mit PBS (7 min jedesmal). Fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Bildgebung oder lagern in ~ 0.5 ~ 1 ml PBS bei 4 ° C für die spätere Verwendung. HINWEIS: Bereiten Proben bei 4 ° C. Verwenden Sie 4% PFA + 0,2% GA Fixiermittel die physiologische Verteilung von Phosphoinositid in der PM zu erhalten. RT Vorbereitung oder Fixierung mit 4% PFA allein kann erhebliche Artefakte (Abbildung 4). </li></ol></li></ol> 2. Zellkultur Vorbereitung für das Live-Cell - Imaging mit mEOS3.1-PH PLC δ1 <ol><li> Bereiten Sie die DNA - Plasmid , das die mEOS3.1-PH PLC δ1 wie zuvor 23 beschrieben. </li><li> Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deckgläschen vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin, bis sie erreichen 50% -70% confluency folgende Standard - INS-1 - Zellkulturprotokolle 38,39. </li><li> Am folgenden Tag, transfizieren INS-1 - Zellen mit dem mEOS3.1-PH PLC &amp; dgr; 1 - DNA - Plasmid - Liposom - Transfektionsreagenz unter Verwendung des Protokolls nach der Herstellung. Inkubieren für 48 Stunden vor der Bildgebung. </li></ol> 3. PALM Image Acquisition von Membranblätter und lebenden Zellen <ol><li> PALM Bildaufnahme von Membranfolien HINWEIS: Hier wird eine interne Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskop auf Basis SMLM System (100X Öl, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 wird für alle Bildaufnahme verwendet. <ol><li> Vor Bildgebung, verdünnen 1 ul fluoreszierenden Beadlösung in 10 ml PBS + 50 mM MgCl 2. In 200 ul verdünnte Lösung in die Abbildungskammer enthält, Zellproben (aus den Schritten 1.1.8 / 1.2.6) für 10 min. Dann waschen mit PBS dreimal. </li><li> Starten Sie das PALM-Bildgebungssystem. In der zugehörigen Imaging-Software, wählen Sie den &quot;iRFP Kanal &amp;# 34; Taste (642 nm Laseranregung, 700/75 nm-Emission). Finden Sie die Zellmembran PH Sonden im iRFP Kanal exprimieren. HINWEIS: Die Membranfolie eine fluoreszierende Perle in der Nähe haben. Dies wird später für Driftkorrektur erforderlich. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Aufnahme&quot; Taste ein herkömmliches TIRF Bild von der Zellmembran in iRFP Kanal als Referenz für zukünftige Bildrekonstruktion zu sammeln. Stellen Sie einen normalen TIRF Winkel (dh nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 1,5 Grad) von in 2140 in den TIRF Winkel Eingabe für die Bildgebung zu setzen. Verwenden Sie diesen Winkel für alle Schritte einstellen, sofern nicht anders vermerkt. HINWEIS: In der TIRF hier beschriebenen System 3500 ist die vertikale up Winkel, 2200 ist der TIRF kritische Winkel, und 2140 ist der normale TIRF Winkel, der 1,5 Grad mehr nach TIRF kritische Winkel. Der schmale TIRF Winkel unten erwähnt in 3.2.3 ist 2120, das ist ein weiterer 2 Grad nach TIRF kritischen Winkel erreicht. </li><li> Wechseln Sie in den PAmCherry1 Kanal durch th klickene RFP Kanaltaste (561 nm Anregung, 600/50 nm Emissionsfilter). Stellen Sie die Bildlaufleiste in der &quot;AOTF&quot; pad den ganzen Weg auf der rechten Seite für 10-20 sec volle Leistung Beleuchtung von 561-nm-Laser zu haben, um die Hintergrund Membran Fluoreszenz bleichen. </li><li> Stellen Sie die optimale Kameraeinstellung (2x2 Binning) im Register &quot;Format&quot; und die schnelle Akquisitionsprotokoll in &quot;ND Sequenzerfassung&quot; Register (typischerweise 10.000-40.000 Bilder bei 20 Hz). </li><li> Starten Sie Erwerb von PAmCherry1 Bilder (561-nm-Laser bei voller Leistung, 50 ms / Frame) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung auf einem niedrigen Niveau (0,1% - 1%), indem Sie auf den &quot;Jetzt ausführen&quot; klicken. Passen Sie die Intensität von 405 nm Laser, so dass räumlich getrennt einzelne Punkte in jedem Frame leicht identifizierbar sind. HINWEIS: Die Anzahl der aktivierbaren PAmCherry1 Moleküle nimmt allmählich während der Erfassung. 405 nm Laserintensität allmählich erhöht werden sollte, um die optimale Dichte der einzelnen Molekül Signale in jedem zu haltenRahmen. </li><li> Weiter Bilder zu erwerben, bis kein PAmCherry1 einzelnes Molekül Signal aktiviert wird. </li></ol></li><li> PALM-Bildgebung in lebenden Zellen <ol><li> Vor der Bebilderung, verdünntem fluoreszierenden Kügelchen in die Abbildungskammer für 10 min, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. PALM Bildgebung durch Öffnen der zugehörigen Imaging-Software Starten Sie dann. HINWEIS: Verwenden Sie eine magnetische Schnellspann Imaging-Kammer für Live-Cell-Imaging. Aufrechterhaltung der Mitte des Abbildungsfeldes bei 35 ° C mit einem Temperaturregler unter konstanter Perfusion mit extrazellulären Puffer (extrazelluläre Lösung: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 3 mM Glucose und 20 mM HEPES; pH = 7,3). </li><li> Wählen Sie die GFP-Kanal-Taste (525/50 nm-Emission). Identifizieren Sie die Zellmembran fluoreszierende Sonden auf Basis von grün fluoreszierenden von mEOS3 unter 488 nm Laseranregung ausdrückt. Stellen Sie sicher, dass fluoreszierende Kügelchen in der Nähe auch während der Bildgebung wie diese enthalten sind später für die Offline-dri erforderlich istft Korrektur. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Aufnahme&quot; Taste, um ein TIRF Bild von der Zellmembran in mEOS3 (grün) Kanal als Referenzbild zu sammeln. Verwenden Sie eine flache abklingende Welle Anregungsbeleuchtung (nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 2 Grad) von in 2120 in der TIRF Winkel eingeben Einstellung für Live-Cell-Imaging. ANMERKUNG: Dies minimiert die Fluoreszenz von dem ungebundenen mEos3-PH im Cytosol angrenzend an die Plasmamembran. </li><li> Wechseln Sie in den &quot;RFP-Kanal&quot; Taste (561 nm Anregung, 600/50 nm-Emission). Verwenden Sie die volle Leistung 561 nm Laser-Hintergrundfluoreszenz der Membranblätter zu bleichen für 10 ~ 20 sec mit dem Scrollbar in der &quot;AOTF pad&quot; (siehe 3.1.4). </li><li> Starten der Bildaufnahme die &quot;Run Now&quot; durch Klicken auf die Taste im roten Kanal (561 nm volle Leistung, eingestellt bei 10 ms / Frame in der &quot;Kamera&quot; Einstellung Tab) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung. Stellen Sie die 405-nm-Laserintensität zu aktivieren räumlich getrennten Punktenin jedem Rahmen. HINWEIS: Erwerb Erlös, un-umgewandelt mEOS3.1-PH PLC δ1 Molekülzahl langsam abnimmt. Erhöhen Sie die 405 nm Laserleistung des einzelnen Moleküls Signal zu optimieren. Die Abbildungsakquisitionslänge ist abhängig von der experimentellen Zweck. Erwerben Sie Bilder kontinuierlich für 5 min unter normalen Bedingungen. Wenn eine längere Akquisition erforderlich ist, sammeln mehrere Bildstapel statt eines einzelnen, großen Bildstapel. Die Dateigröße der einzelnen Bildstapel sollte nicht mehr als 4 GB oder es wird später Software-Analyse beeinflussen. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Bildverarbeitung und Wiederaufbau <ol><li> Übertragen Sie die Bilddateien (TIF-Bildstapel) zu einer Bildanalysestation. Starten Sie die Bildwiederaufbauprogramm (speziell geschriebenen) in Matlab wie zuvor 37 beschrieben und laden Sie die Bildstapel durch die Registerkarte &quot;Datei&quot; im Hauptmenü klicken, dann auf &quot;öffnen&quot;, dann &quot;neue Datei&quot;. </li><li> Identifizieren und locaLize einzelnen molekularen Ereignisse aus jedem Rahmen. Stellen Filterung Intensitätsschwelle mit einer Schwellenzahl (1-10) in der &quot;Wavelet&quot;. Überprüfen Sie die optimalen Parametereinstellungen für Punkterkennung visuell vor dem Umbau. Dann gehen Sie auf die &quot;PALM&quot; und klicken Sie &quot;einen Schritt Prozess&quot; Bildrekonstruktion zu starten. HINWEIS: Intensitäts-Grenzwert für Punkterkennung ist willkürlich und hängt von persönlichen Erfahrungen. Mehrere Studien kann eine optimale Detektionsschwelle zu erzeugen, erforderlich sein, dass weder zu viele unqualifizierte aufgreift (dim) Punkte noch filtert zu viele qualifizierte (hell) Punkte aus. Stellen Sie andere Parameter Datenanalyse zu optimieren. Hier Nachbarschaft Abstand (Fluoreszenzpunkte in den benachbarten Rahmen in einem Abstand kombiniert werden) wird als 65 nm (1/2 Pixelbreite) und als ein einzelnes Molekül eingebaut. Gap-Frames (Einzelmolekül Ereignisse, die innerhalb dieser Rahmen und Nachbarschaft Entfernung auftraten, wurden kombiniert und als ein einzelnes Molekül Ereignis vorhanden) istSet als 26 Frames (1,3 sec) für PAmCherry1 Bildgebung 40. Stellen Sie diese Parameter entsprechend den Eigenschaften der Einzelmolekülsonden und Erfassungsrate zu vermeiden 40 in SMLM Über zählen. Anwenden Driftkorrektur mit fluoreszierenden Kügelchen während der Rekonstruktionen. <ol><li> Für die Abbildung der festen Membranblätter gekennzeichnet durch iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruieren die ganze Bildstapel aus der gleichen Membranfolie in einem einzigen Super-Resolution Bild 37. </li><li> Für lebende Zelle markierten Proben von mEOS3.1-PH PLC δ1, den gesamten Bildstapel in mehrere kleinere Stapel von 1.000 Frames trennen , so dass 1000-konsekutiven Rahmen Stapel wird als ein einzelnes Superauflösungsbild rekonstruiert, die eine zeitliche Auflösung hat von 10 sec. Am Ende vereinen alle Zeitreihen - Bilder in der letzten Zeitreihenstapel 23. HINWEIS: In lebenden Zellen PALM-Bildgebung kann eine kleine Anzahl der aktivierten Sonden bewegen oder trennenvon PI (4,5) P 2 in der PM vor dem Bleichen. Um der Überabtastungs der Sonden verbinden einzelnen Molekül Signale in den benachbarten Einzelbildern innerhalb von 130 nm (anstelle von 65 nm) in einem einzigen Emissionsereignis während der Bildanalyse. </li></ol></li><li> Nachdem die rekonstruierten Bilder zu erhalten, führen Sie weitere Bildanalyse mit dem speziell geschriebenen Programm in Matlab Moleküldichte, Mikrodomänendichte / Größe und Clusteranalyse mit paar Korrelation 41 zu quantifizieren. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Zur Fehlersuche, müssen zwei Prozesse besondere Aufmerksamkeit: Membranfolie Produktion und Probenfixierung. Wie in dem Protokoll beschrieben, ist die Inkubationszeit von den Deckgläsern in Schritt 1.1.6 wichtig für die Membranfolie Produktion. Optimale Inkubationszeit unter unseren experimentellen Bedingungen ist 7-10 min (Abbildung 2). Länger als 10 Minuten Inkubation werden intakte Zellen produzieren anstelle der Membranblätter auf PDL Deck und kürzere Inkubation wird weniger oder kein Membranblätter auf den PDL-beschichtete Deckgläser führen. Wie in dem Protokoll beschrieben, sind die Fixiermittel und Temperatur während der Fixierung der kritischen PI (4,5) P 2 -Verteilung im PM aufrechtzuerhalten. Die Fixierung bei RT oder die Verwendung von 4% -PFA allein könnte die normale Lipidverteilung in der PM verzerren. Durch die Anwendung PALM - Mikroskopie Lipidforschung an der Membran, sind wir in der Lage , die Nanometer - Skala Verteilung von PI (4,5) P2, ein Schlüssel Phosphoinositid , die m vermittelt zu beobachtenalle grundlegenden zellulären Aktivitäten. Diese räumliche Verteilung von PI (4,5) P2 mit begrenzter Konzentrationsgradienten in INS-1 - Zellen bietet einen Rahmen Lipid-Protein - Wechselwirkungen und lokale Signalereignisse von PI (4,5) P 2 in diesen Zellen für ein Umdenken. Darüber hinaus sind die in dieser Arbeit entwickelten Methoden können auch mit der richtigen Sonden, wodurch bietet neue Werkzeuge zum Studium Phosphoinositiden in biologischen Prozessen zu anderen Membran Phospholipid Forschung angewendet werden. Die Verwendung von Membranfolien in dieser Arbeit umgeht zwei wichtige Anliegen in Phospholipid morphologische Studien: Detergens-Behandlung und mögliche Signal Kontamination aus dem Cytosol. Waschmittel verursachen oft Clustering und einen erheblichen Verlust von PM Phospholipid-Signal. Die Kontamination von zytosolischen Signal ist besonders problematisch im Fall von geringer Häufigkeit Phosphoinositiden auf der PM 23, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Membranfolienproben sind in der Lage Circumvent diese Probleme ohne wesentliche Strukturen mit der Plasmamembran, wie kortikale Aktin meshwork und Clathrin-beschichtete Pits 42,43 zugeordnet stören. Die relative homogene Verteilung von PI (4,5) P2 in der PM ist in guter Übereinstimmung mit anderen schnellen Einfrieren EM - Studien unter Verwendung von GST-PH PLC δ1 Sonden in der Fibroblasten - Membran 44. Es ist wichtig zu beachten, dass unsachgemäßer Probenverarbeitungsbedingungen irreführende Ergebnisse erzeugen kann. Erstens ist es wichtig, die Befestigungsschritte bei einer niedrigeren Temperatur (4 ° C) und Verwendung der Fixiermittel GA für Membranfolienherstellung durchzuführen. Wie in 3 gezeigt, warme Temperatur und PFA Fixierung ohne GA ist nicht ausreichend Phosphoinositid in Zelle PM zu beheben. Dies könnte die intakten PI (4,5) P 2 Verteilung verzerren und scharfe Cluster erzeugen , die in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen beobachtet werden , nicht. Zweitens ist die Verwendung von PAmCherry1 alsdie SMLM Sonde, eher als andere Sonden ist, ausschlaggebend für die quantitative PALM-Bildgebung. Der Vorteil der PAmCherry1 Anwendung kommt von seiner gut charakterisierten einzelnen molekularen photophysikalischen Eigenschaften 35,40,45, wie Helligkeit, hohe Photoaktivierung Effizienz und vor allem sehr begrenzt Photo Blinken. Diese Eigenschaften ermöglichen es uns , potenzielle Cluster Artefakte aus Photo Blinken zu beseitigen und quantitativ die molekulare Dichte der Membran PI analysieren (4,5) P 2. Dieser Ansatz hat auch seine Grenzen. Erstens verwendet das Membranblatt Verfahren in dieser Studie nicht vollständig kann die physiologische Verteilung von PI (4,5) P 2 nachahmen , da die Zelle vor der Abbildung gestört wird. Aber unsere Live - PALM - Bildgebung zeigt ähnliche relativ homogene Verteilung von PI (4,5) P2, die Ergebnisse beobachtet , die mit Membranfolie Proben unterstützen. Zweitens, wie wir in unserer bisherigen Arbeit 23 diskutiert, erfordert SMLM Imaging Expertise und extra antention Bildartefakte zu vermeiden, die von verschiedenen Prozessen, einschließlich der verwendeten Sonden, Probenvorbereitung und Fixierung, Bild Probenahme und Wiederaufbau entstehen könnten. Schließlich, obwohl die PH - Domäne basierte Sonden und Antikörper sind weit verbreitet in der Phosphoinositid Studien 46,47 verwendet worden bleibt es möglich , dass nicht alle PI (4,5) P2 in der Membran kann durch diesen Ansatz nachgewiesen werden. Beispielsweise PI (4,5) P 2 durch andere endogene Proteine gebunden sind, können nicht auf pH - Sonden oder Antikörper zugänglich sein, und dies kann eine Unterschätzung von PI (4,5) P 2 aufgrund der Raum Hinderung der Sonden selbst verursachen. Eine alternative Möglichkeit zur Etikettierung PI (4,5) P 2 würde auf den Schwanz des ursprünglichen Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, a pre-markierten PI (4,5) P 2 Analogon mit einer Modifikation verwendet werden , PI (4,5) P 2. Allerdings kann es schnell in andere Phosphoinositid-Subtypen durch schnelle Live-Zellstoffwechsel umgewandelt werden, da seine Inositolrings die gleiche wie endogenou ists PI (4,5) P 2. Damit stellt sich die Sorge , ob diese voretikettierten PI (4,5) P 2 analoge in lebenden Zellen treu PI (4,5) P 2 nicht seine Stoffwechselprodukte darstellen kann. Daher ist trotz einiger Einschränkungen, PH - Domäne basierte Sonden sind immer noch zu den besten Sonden , die häufig verwendet wurden PI (4,5) P 2 Verteilung und Dynamik auf dem PM von Zellen zu überwachen. Die künftige Anwendung dieser Methodik kann auf andere Phosphoinositid Studien erweitert werden, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Zusammenfassend verwendet die neuartige SMLM Ansatz eröffnet hier neue Wege Phosphoinositid in Zellen zu untersuchen. Verwendung von PI (4,5) P 2 als Beispiel zeigen wir die einzigartigen Eigenschaften von PALM Bildgebung in die morphologische und quantitative Untersuchung der Zellmembran - Moleküle sowie ihre Nachteile. Dieser Ansatz kann an andere Moleküle von Interessen angepasst werden und breite Anwendungen in der Zellbiologie haben.

Phosphoinositiden tragen zu einem geringen Teil der gesamten Membranlipiden, sondern in einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. Sie umfassen sieben Mitglieder abgeleitet von reversible Phosphorylierung oder Dephosphorylierung des inositol Ringe auf der 3., 4. und 5. Positionen 1. Phosphatidylinositol - 4-phosphat (PI4P) und Phosphatidylinositol - 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) sind zwei wichtige Phosphoinositiden , die relativ unabhängig wie die Determinante Lipide der Zellplasmamembran (PM) 2,3 funktionieren. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) viel weniger reichlich als PI4P und PI (4,5) P 2, aber es hat einzigartige Funktionen in verschiedenen zellulären Prozessen , einschließlich Krebs und Diabetes 4 5. Diese Lipide haben komplexe molekulare Interaktionen mit ihren Effektoren und viele andere Proteine. Daher ist es entscheidend, die räumliche Organisation dieser pho zu verstehensphoinositides im PM auf der Nanometer-Skala. Montage Beweise hat gezeigt , dass Proteinkomplexe oder Molekülcluster in den engen PM Bereichen als Signal Hotspots 6 dienen kann. Zum Beispiel Syntaxin 1a, ein Schlüsselprotein , das die Membranfusion 7-9, zeigt Cluster - Organisation in der PM reguliert. Unterscheidet sich von der Konsensusansicht der Clusterorganisation von Syntaxin 1a, die räumliche Verteilung von Phosphoinositiden in der PM ist umstritten. PI (4,5) P 2 Verteilungsmuster reichen von Uniform 10-12, große Flecken 13,14, zu dichten Büscheln 14-18, je nach Zelltypen und experimentelle Methoden verwendet. Die räumliche Organisation von PI (4,5) P 2 mit höherer Auflösung ist auch widersprüchlich. Eine Studie unter Verwendung von stimulierten Emission-Depletion (STED) Mikroskopie 19 hat eine große Anzahl von dicht PI (4,5) P 2 Nanocluster (~ 73 nm Durchmesser) in den PM Blätter PC-12 - Zellen 20 ergab </sup&gt;. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von Studien unter Verwendung von Schnellfroster Elektronenmikroskopie (EM) 21,22, ein Ansatz, der die intakte PM Struktur von lebenden Zellen viel besser als chemische Fixierung bewahrt. Diese zeigten einen deutlichen Pools von PI (4,5) P 2; relativ konzentrierten PI (4,5) P 2 in Caveolae und beschichtet sowie eine gleichmäßige Verteilung auf der flachen Region PM Pits. Darüber hinaus nanoskaligen PI (4,5) P 2 Organisation in Membranfolien können in lebenden und fixierten Zellen unterscheiden. Unsere jüngsten Arbeiten untersucht dieses Problem in stationären und leben INS-1 - Zellen Einzelmolekül - Lokalisationsmikroskopie (SMLM) 23 verwendet wird . SMLM basiert auf stochastisch Einschalten nur eine kleine Teilmenge von Fluorophoren zu einem bestimmten Zeitpunkt, so dass einzelne Fluorophore mit hoher Genauigkeit lokalisiert werden. Viele Super-Resolution Imaging-Ansätze wurden unter Verwendung ähnlicher Prinzipien entwickelt, um die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie zu überwinden, wie eins Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM) 24, Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisationsmikroskopie (FPALM) 25, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) 26,27 und direkte STORM (dSTORM) 28. Mit photoschaltbare oder photoaktivierbaren Fluorophore (Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine), erlauben SMLM Techniken Wissenschaftler Bild biologischen Strukturen in Nanometer - Auflösung 24,29,30 mit Video-Rate in lebenden Zellen 31,32. Mit PI (4,5) P 2 als Beispiel, haben wir das SMLM Ansatz die nanoskalige Verteilung von Phosphoinositid auf dem PM zu studieren. Die PH - Domäne von PLCδ1 (Phospholipase C δ1) , die PI bindet spezifisch an (4,5) P 2 eine gut etablierte Sonde zur Bildgebung PI (4,5) P 2 subzelluläre Verteilung und Dynamik 33,34 in der PM . Wir haben genetisch diese Domäne mit zwei fluoreszierenden Proteinen markiert, PAmCherry1 35 und 36 iRFP </sup&gt; , um eine Zweifarben - Fusionsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (1A-B). PAmCherry1 dient als photoaktivierbare Sonde von PH - Domäne für PALM und iRFP dient als allgemeiner Indikator zu transfizierten Zellen zu identifizieren , bevor PALM Erwerb . Wir wenden diese zweifarbige Fluoreszenzsonde für SMLM Bildgebung in den festen Membranfolien. Für Live - PALM - Bildgebung, getaggt wir mEOS3 37 anstelle von PAmCherry1 an die PH PLCδ1 Domäne der mEOS3.1-PH PLCδ1 Sonde für seine bessere Photoneneffizienz und Helligkeit (1C-D) zu erzeugen. SMLM Bildgebung mit dieser neuartigen Sonden in der PM von insulinsezernierenden INS-1 - Zellen 38 hat homogene Markierung von PI (4,5) P 2 in der Mehrzahl der PM Regionen sowie konzentrierte PI (4,5) P 2 freigelegt Mikrodomänen , die in der Wohnung PM und einige Filopodien artige Strukturen 23 dünn miteinander vermischt werden. Dann einnoScale Verteilung von PI (4,5) P 2 eine strukturelle Basis für ein Umdenken , wie es funktioniert in lebenden Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Die Lokalisierungsunsicherheit (σ) unserer Super-Resolution - System ist 14,73 nm 23. Direkte Vergleiche zwischen TIRF und PALM Bilder zeigten eine signifikante Verbesserung der räumlichen Auflösung. 3A-B zeigt die repräsentative PI (4,5) P 2 TIRF Bilder markiert mit PI (4,5) P 2 - Antikörper und iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 in typischen Membranfolien und lebenden Zellen. Die Bilder mit herkömmlichen TIRF - Mikroskopie in Membranblätter bemerkenswert ähnlich sind zu denjenigen in intakten lebenden mit dem enhanced green fluorescence protein markierten Zellen (EGFP) tagged PH Domänen (EGFP-PH PLCδ1) (3C). Alle Proben zeigten eine gleichmäßige Verteilung von Sonden. Im Gegensatz dazu führte nicht optimale Fixierung der Proben in scharfen dichten PI (4,5) P 2 -Clustern und eine Abnahme der Signalintensität (Abbildung 4). Unter optimalen Fixierbedingungen, ter super-aufgelöste Bilder von PI (4,5) P 2 in fixierten Zellen (Figur 5) zeigte eine homogene Verteilung von Sonden in einem erheblichen Teil des PM nur begrenzten Konzentrationsgradienten. Einige Membranflecken angereichert mit PI (4,5) P2 - Sonden wurden dünn verteilt und hatten verschiedene Größen. Live Cell PALM Bilder zeigen eine ähnliche räumliche Verteilung als feste Zellen (Abbildung 6). Eine detaillierte Analyse von PI (4,5) P2 Signale über die Zeit resultiert in schnelle Dynamik in lokalen Bereichen, ohne wesentliche Änderungen ihrer Fülle in weiten Bereichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema für Fluoreszenzsonden in dieser Studie verwendet. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 Sonde in den festen Membranfolie Experimente verwendet. Während herkömmliche TIRF imaging (A), eine 640 nm<html> Laser wird verwendet, um die iRFP zu erregen (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF Bild in diesem Zustand genommen dient als TIRF Referenzbild für die superauflösende Bildgebung von PALM - Bildgebung (B) erhalten. A 405-nm-Laser verwendet wird Photo aktivieren Sie die PAmCherry1 Fluorophor und ein 561-nm-Laser verwendet wird PAmCherry1 zu erregen (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) für PALM-Bildgebung. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 Sonde in den lebenden Zellen Experimente verwendet. (C) Bei der konventionellen TIRF Bildgebung, ein 488 nm - Laser verwendet mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm) anzuregen. (D) Nach dem Photokonversion von einem 405 - nm - Laser, wird mEos3.1 in die rote Form (Beispiel: 573 nm; Em: 584 nm). Und einem 561 - nm - Laser wird für PALM Akquisitionen <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Schema für Membranblatt Vorbereitung von INS-1 - Zellen. (A) Legen Sie das Deckglas mit kultivierten Zellen nach unten auf einen PDL-beschichtete Deckglas und warten auf 7 ~ 10 min bei 4 ° C Zellbindung an die PDL- zu ermöglichen beschichtete Deckglas. (B) die obere Deckglas mit einer Pinzette abziehen und fixieren Sie die Folienmembran auf die vorbeschichteten Deck PDL angebracht. (C) Bild der Proben mit TIRFM und PALM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Abbildung 3. PI (4,5) P 2 räumliche Organisation ist ähnlich zwischen den Membranblättern und intakten lebenden Zellen unter konventionellen TIRF - Mikroskop. (A) Atypische TIRF Bildbögen Membran bei 4 ° C mit 4% PFA und 0,2% GA fixiert. PI (4,5) P 2 wurde mit PI (4,5) P 2 spezifische Antikörper markiert. (B) ein Membranblatt von der INS-1 - Zellen iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 exprimieren. (C) TIRF - Bild von zwei intakten lebenden Zellen EGFP-PH PLCδ1 auf verschiedenen Ebenen. Maßstabsbalken: (A): 3 &amp; mgr; m; (B) und (C):. 5 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Abbildung 4. PI (4,5) P 2 räumliche Organisation in Membranblätter ist empfindlich gegen gemeinsamen Fixierbedingungen. (A) Membranblätter bei 37 ° C mit 4% PFA alleinund PI (4,5) P 2 - spezifischen Antikörpers (wie in 3A) markiert. (B) Membranfolie bei RT mit PFA fixiert allein und mit PI (4,5) P 2 spezifische Antikörper markiert. Man beachte , dass die dichten Cluster von PI (4,5) P 2 Sonden unter TIRF Mikroskop deutlich sichtbar sind, im Gegensatz zu den viel gleichmäßiger Fluoreszenzbilder in 3A gezeigt. Maßstabsbalken: AB:. 3 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> Abbildung 5. PALM Bildgebung von PI (4,5) P 2 Sonden zeigt ihre Nanometer - Skala Verteilung in einem INS-1 - Zellen Uhr. (A) iRFP TIRF Bild einer Membranfolie aus einer INS-1 - Zellen exprimiert iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) entsprechende PALM Bild von PM in der gleichen Region basierend auf PAmCherry1 Signalrekonstruktion. Beachten Sie die homogene PI (4,5) P 2 räumliche Verteilung in großen PM Regionen und mehrere PI (4,5) P 2 Mikrodomänen. (C) eine vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereichs in (B). Pfeile zeigen dünn mit PI (4,5) P 2 Sonden angereichert PM Mikrodomänen verteilt. Maßstabsbalken: A und B: 3 um; C: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Abbildung 6. PALM Bildgebung in der Live - INS-1 - Zellen. (A) TIRF Bild von PI (4,5) P 2 in einer Live - INS-1 - Zellen mEos3.1-PH PLC exprimierenδ1. Das Bild wurde in den grünen Kanal vor PALM Erwerb (35 ° C) schnell erworben. (B) Sequential lebenden Zellen PALM Bilder in 10 Sekunden - Intervall. Einschübe zeigen die Intensitätsprofile des lokalen PI (4,5) P 2 Dichte entlang der gleichen Position gerade Linie 1 zu verschiedenen Zeitpunkten in (B) und (C). Beachten Sie ihre großen lokalen Intensitätsänderungen innerhalb von 10 Sekunden. (D) Zeitverlauf der durchschnittlichen Intensitätsänderungen von PI (4,5) P 2 in der großen Fläche (box2, 3x3 um) und kleine Kreise (3, 4, und 5, 500 nm Durchmesser) in (B) während 5 min von PALM-Bildgebung (Rahmen / 10 sec). Beachten Sie die schnelle Intensitätsschwankungen der lokalen PI (4,5) P 2 Sonden (Kreis 3, 4 und 5) im Vergleich zu sehr kleine Veränderungen in der breiten Fläche (Kasten 2). (E) Vergrößerte PALM Bilder der box2 Region in (B) zu den angegebenen Zeiten. Die Pfeile zeigen PI (4,5) P 2 angereicherte Membranflecken unter physiological Bedingungen. Maßstabsbalken: C: 3 um; E: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren . 

Serie: Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Forschung

Biochemie

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...