This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

1. Kültür ve İnsan Farklılaşma Nötrofil gibi HL60 Hücreleri <ol><li> Hazırlama RPMI (Roswell Park Memorial Institute) RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat içeren 1640 kültür ortamı ve 25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1 -piperazineethanesulfonic asit). 37 ° C&#39;ye kadar bir RPMI 1640 kültür ortamı ısıtın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin log-faz büyüme aşamasında olduğundan emin olmak için HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu belirlemek. NOT: Hücreler Pasajlanması sonra üçüncü gününde log fazı genellikle. Log-faz hücrelerinin yoğunluğu genellikle 6-8 x 10 5 hücre / ml &#39;dir. Yeni bir kültürünü başlatmak için hücre yoğunluğu yaklaşık 1.5 x 10 5 hücre / ml &#39;dir. Not: Örneğin, T-75, düz bir şişe içinde 10 mi, yeni kültür, log-faz hücrelerinin daha sonra hücre yoğunluğu 6 x 10 5 hücre / mi, log-faz hücrelerinin (2.5 mL 6 X 10 5 ise, ) 10 m 1.5 x 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltilirl yeni kültür. 10 ml kültüre nihai bir hacim ilave edilir RPMI 1640 kültür ortamı içinde 7.5 ml yapmak için. </li><li> Düz bir şişeye ılık RPMI 1640 kültür ortamı hesaplanan hacim yerleştirin. T-75 düz bir şişe kültürü, hücre kültürü, toplam hacmi 10 ml&#39;dir. </li><li> 1.5 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğuna ulaşmak için, düz bir şişeye log-faz artan HL60 hücrelerinin hesaplanan hacim. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. NOT: HL60 iki katına zaman neredeyse 24 saattir. </li><li> RPMI 1640 kültür ortam maddesi ile Geçiş hücreler her 2-3 günde. HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu asla 1.5 x 10 6 hücre / ml aşıyor ve hücre geçit artık 2 aydan sürer önemlidir. </li><li> Deneylerde önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. Not: RPMI 1640 farklılaştırma ortamı RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM lH içerirEPES ve% 1.3 dimetil sülfoksit (DMSO). Diğer bir deyişle, bu RPMI 1640 kültür ortamı içinde% 1.3 DMSO. <ol><li> HL60 hücreleri ayırt etmek için, 37 ° C bir RPMI 1640 kültür ortamı önceden ısıtın. Düz balona sıcak RPMI 1640 kültür ortamı ekleyin. </li><li> DMSO hızlı bir RPMI 1640 kültür ortamı ile seyreltildi, böylece balon dönen ise bir son 10 ml HL60 farklılaşma kültürü için, düz bir şişede RPMI 1640 kültür ortamı, doğrudan 130 ul DMSO ilave edin. </li><li> Bir son 10 ml RPMI 1640 farklılaşma ortamı içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre yoğunluğu log-faz HL60 hücreleri ekleyin. Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de RPMI 1640 ortamı içinde farklılaşma HL60 hücreleri. </li></ol></li></ol> 2. 4well Odası Kapak Cam Yüzey Kaplama <ol><li> , Buzdolabından% 2 jelatin stok solüsyonu şişe almak% 70 etanol ile temizleyin ve kaputu yerleştirin. TAKE 1 ml% 2 jelatin stok solüsyonu ve hemen buzdolabına kalan jelatin stok solüsyonu döner. </li><li> jelatin çözeltisi tam 37 ° C&#39;de sıvılaştırılması ve iyice pipet izin verin. 9 mi önceden ısıtılmış 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi ile% 2&#39;lik bir jelatin stok solüsyonu seyreltik (HBSS)% 0.2 jelatin son konsantrasyonu tampon. </li><li> sırasıyla altındaki bir kapak camı ile 4 oyuklu odasının iki orta kuyu veya 1 oyuklu bölmeye HBSS içinde 0.5 ml ya da 2 ml% 0.2 jelatin ekleyin. Sıvı tüm yüzey alanını kaplayacak şekilde çeşitli yönlere plakaları eğin. </li><li> 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. Plakalar 1 saat içinde kullanıma hazır olur. Bunlar en fazla 5 gün için de kullanılabilir. Sadece hücrelerin ekim önce, 4-iyi ya da 1-kuyu odalarından jelatin çözüm kaldırmak. </li></ol> 3. Kemotaksis Deneyi kullanılarak hücre hareketliliği Analiz Cihazı <ol><li> RPMI olduğunu hazırlayın ve sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı,0.1 mM sodyum piruvat (isteğe bağlı) ve 25 mM HEPES içeren ortam. </li><li> orta açlıktan RPMI 1640 içinde, 100 nM fMLP (N-formilmetionil-lösil-fenilalanin), 100 ul hazırlayın. </li><li> % 1 sığır serum albümini 3 ml (BSA) Hazırlama / RPMI ortamı ve% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı 10 ml açlıktan RPMI 1640 içinde% 1 BSA içeren 1640 ortamı. </li><li> Ceket 22 mm&#39;lik kare lamel ve taze hazırlanmış% 1 BSA ile bir 5 mikron hücre hareketliliği analiz cihazı çip / RPMI 1640 ortamı oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> Aşağıdaki prosedürü kullanarak Holder birleştirin: <ol><li> kolları kullanıcı doğru eğin, böylece dikey pozisyonda kolları ile tutucu tabanını yerleştirin. 41 mm&#39;lik cam yüzeyine% 70 etanol çözeltisi uygulanır. Dikkatle çizmemeye özen bir silme ile yüzeyleri silin. </li><li> tutucu üssü haline 41 mm cam yerleştirin. tutucu tabanında 41 mm cam üstünde BSA ile kaplanmış 22 mm kare lamel koyun. NOT: Kaplanmış kare c41 mm cam ve yonga arasındaki overslip kemotaksis kaplama yüzeyinin alt tabaka oluşmasına izin verir. </li><li> gofret konut dibine O-halkayı (küçük) yerleştirin ve arkada eliptik delik olan tutucu üssü haline gofret konut monte edin. konumunda gofret konut kilitlemek için yatay pozisyonda ileri tutucu tabanının iç düzeyini çekin. </li><li> bir hava silgi ile gofret yuvanın iç tozları üfleyin. Gofret yuva içine% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı içinde 4 ml. </li><li> aşağı cam ile temas yapısal yüzü ile gofret mahfazanın ortasında BSA ile kaplanmış hücre hareketliliği analiz cihazı çip monte edin. NOT: çip arka konumlandırma işareti (çip üstünde delik) ile takılması gerekir bu. </li><li> deliklere lastik conta iki çıkıntılar takarak gofret kelepçe altına lastik conta yapıştırın. </li><li> üzerine O-halkasını (büyük) monte edingofret konut üst. arka sensör delik ile gofret kelepçesini takın. yerine gofret kelepçe kilitlemek için yatay pozisyonda ileri konut tabanının dış kolunu çekin. </li><li> tutucu montajından sonra, kuyularda hiçbir hava kabarcığı olduğunu doğrulamak için ışık kutusu üzerinde sahibinin alt yerleştirin. Hava kabarcıkları tespit edilirse, bir örnek yükleme ucu ile donatılmış verilen plastik şırınga kullanarak bunları kaldırın. </li><li> Kapağı çıkarın ve hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin üstünde plaka üzerine montajını koydu. sahibine sensör bloğunu takın. </li></ol></li><li> Kemotaksis Deneyi için HL60 hücrelerinin hazırlanması: <ol><li> hemositometre ile Farklılaşmış HL60 hücreleri hücre yoğunluğu hesaplanır. Farklılaşma 5 gün sonra hücre yoğunluğu yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. </li><li> 2 x 10 6 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu HL60 hücreleri son hacim hesaplanır. Örneğin, hücre yoğunluğuFarklılaşmış HL60 hücreleri, 1.0 x 10 6 hücre / o mi, Farklılaşmış HL60 hücreleri 10 mi, 2 x 10 6 hücre / ml ulaşmak için 5 mi% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş olacaktır. </li><li> Santrifüj 200&#39;de HL60 hücreleri ayırt Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. % 0.1 BSA, hesaplanan hacmi ile hücrelerin Süpernatantı ve tekrar süspansiyon / 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre yoğunluğu RPMI aşama 3.6.2 de 1640 ortamı). </li></ol></li><li> görüntü elde etmek için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitesi ve PC başlatın. Üniteyi bilgisayara bağlayın. Hücre hareketlilik analizi aygıtı açın. Bilgisayarı açın. </li><li> Hücre Hareketlilik Analizi Device Software Up başlayın. <ol><li> Kamera, ısıtıcı, çekim, not ve kamera görüntüleri: 5 kontrol panelleri gözlemleyin. </li><li> Kamera görüntü kontrol panelinde, kamera görüntü panelinde kamera ortalamak için gerçek zamanlı olarak tutucu / görünüm konumunu ayarlamak için &quot;Yatay çizgi&quot; veya &quot;Dikey çizgi&quot; kullanın. </li><li> Kamera kontrol panelinde, belirlenen kanala kamera taşımak için CH6 CH1 seçin. Bir kanalın görünüm alanlarını ortalamak için, kameranın X-koordinatı ve yatay kameranın konumunu ortalamak ayarlamak için &quot;R Taşı&quot;, &quot;Taşı L&quot; tıklayın ya. </li><li> Ayarlayın dikey ekran ortalamak için Görüntüyü ayarlamak için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin ön panelindeki pozisyon düğmesini çevirerek kameranın Y koordinatı. </li><li> Isıtıcı kontrol panelinde, 37.0 ° C &quot;tutucu temp&quot; ve 39 ° C &quot;plaka sıcaklığı&quot; olarak ayarlayın. Isıtma başlatmak için &quot;Heat&quot; tıklayın. Ayrıca tutucuya bağlı termal sensör kullanarak sıcaklığı kontrol etmek için &quot;tutucu&quot; tıklayın. </li><li> Çekim panelinde, &quot;Aralık&quot; at &quot;15 sn&quot; ve aralıkları için &quot;Time&quot; de &quot;30 dakika&quot; ve kemotaksis testinde süresini girin. Kontrol güvenlik nedeniyle &quot;çekim sonunda kapalı ısıtıcı&quot;. Bir DE belirtinsaklanan görüntüler için stination. </li><li> Not panelinde, hücre hattı gibi deneylerin giriş özelliklerini, tedavi uygulandı olsun ya da olmasın, kullanılabilir ve kemo-cezbedici konsantrasyonu uygulanır. </li><li> Deneylerde kullanılacak tüm kanallar merkezi konumda olması garantilenir ve gerekirse, tüm kanallar için ayarlamasını tekrarlayın. </li></ol></li><li> Enjekte edilir ve takip Hücreleri hizalayın: <ol><li> tutucudan tamponu çıkarın ve her bir kanal için üstten üçüncü gelen tampon 8 ul çıkar. </li><li> Hücre sayısını kontrol etmek ve enjeksiyon esnasında akması için gerçek zamanlı olarak ekranda izleme sırasında aynı kanalda ikinci kuyuya hücre 2 ul enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Hücreler güzel hizalanmış sonra, derhal tampon 8 ul geri ekleyin. Diğer kanallar (Şekil 1B) için de aynı işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> geri sahibine tampon ml 2 ekleyin ve 1 ul 100 nM FM ekleyinüstten üçüncü oyuk LP. görüntü elde etme başlatın ve verileri kaydetmek. Görüntüyü yazılımını 9 izleme (Şekil 2) kullanılarak elde edilen verileri analiz edin. </li></ol> Elektroporasyon 4. Transfeksiyon <ol><li> Bölüm 2&#39;de belirtildiği gibi Bölüm 1. Kat 4-iyi ya da 1-kuyu odaları açıklandığı gibi deneyden önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. </li><li> Hazırlama ve 37 ° C&#39;de RPMI 1640 ortamı,% 20 (h / h) FBS, 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM HEPES içeren, sıcak RPMI 1640 elektroporasyon geri ortamı. </li><li> Sağ transfeksiyon deney başlamadan önce, sırasıyla, önceden kaplanmış 4-iyi ya da 1-kuyu odaları kuyulara 300 ul veya 3 ml RPMI 1640 kültür ortamı ya ekleyin. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde odaları inkübe edin. ileride kullanmak (iki hafta) inkübatöre hemen veya deposu bu odadan kullanın. </li><li> farklılaşmış HL6 hücre yoğunluğu sayısıBir hemasitometre 0 hücreleri. Not: Hücre yoğunluğu genellikle yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml&#39;ye ulaştığı. Hücre yoğunluğu daha 3.0 x 10 6 hücre daha / ml genellikle istenmeyen transfeksiyon verimi sağlar. HL60 hücrelerinin süspansiyon hücreleri olduğu için, herhangi bir re-süspansiyon gereklidir. </li><li> 200 hücreleri santrifüj Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. Süpernatantı ve transfeksiyon reaktifi, 100 ul 2 x 10 6 HL60 hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücreleri ve transfeksiyon reaktifler 100 ul karışımı içine GFP-PKD1 plazmid 9 4 ug ekleyin ve hafifçe ve iyice karıştırın. sağlanan küvetin içine karışımı ekleyin. </li><li> insan lökosit hücre hattı için üreticinin önceden ayarlanmış programı seçin ve elektroporasyon gerçekleştirin. NOT: Daha fazla bilgi üreticisinin web sitesinden edinilebilir. </li><li> Elektroporasyondan sonra, hemen ve yavaşça ilave hücrelere 500 ul RPMI 6140 elektroporasyon kurtarma ortamı önceden ısıtılmış veyavaşça verilen plastik pipetler ile 1.6 ml tüp küvet hücreleri aktarın. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. Tohum 100 ul veya sırasıyla bir 4-kuyu kuyu veya 1-kuyu odasına, içine hücreleri 500 ul. </li><li> sırasıyla 1 ml veya bir 4-kuyusunun aynı oyuğuna 4 ml&#39;lik bir son hacim ya da 1-çukurlu odasına RPMI 1640 kültür ortamı. 3 saat,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin. Pre-sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı 37 ° C. </li><li> 1 ml pipet kullanarak, yavaşça sırasıyla 4 oyuklu bölmenin oyuk ya da 1-çukurlu haznesinden RPMI 1640 kültür ortamı, 0.8 ml veya 3 ml çıkarın. Nazik olun ve yapışan HL60 hücreleri uzakta emme kaçının. NOT: HL60 hücrelerin büyümesine ve süspansiyon medyada ayrılır. bazı tedaviler ile birlikte veya farklılaştırılmış sonra, HL60 hücrelerinin polilisin, kolajen, jelatin ya da fi ile kaplanmış alt tabaka bağlıbronectin. </li><li> sırasıyla 4-iyi ya da 1-de bölmenin kuyuya orta açlıktan 0.8 ml ya da RPMI 1640 3 ml ekleyin. 1 saat bekleyin. NOT: Bu noktada hücreler görüntüleme deneyleri 9 için hazırdır. </li></ol> 5. İzleme GPCR aracılı Çok kanallı Floresan Mikroskobu PKD1 Membran Translokasyon <ol><li> uyaran olarak orta aç RPMI 1640 içinde 100 nM fMLP ve 1 ug / ml Alexa 594 taze bir karışım hazırlayın. NOT: fMLP ve Alexa 594 ihtiyaçlar karışımı taze maksimum etkinlik sağlamak için yapılacaktır. </li><li> Dağı bir 4-iyi odasının 40X petrol lensin üzerinden hücreleri ile ekildi. </li><li> Şöyledir olarak Çok Kanallı Yapılandırması Floresan Mikroskop ayarlayın: <ol><li> yapışan HL60 hücrelerinin tanımlanması için kemoatraktan fMLP için GFP etiketli PKD1, kırmızı emisyon kanalı (580-620 nm) (Alexa 594) yeşil emisyon kanalı (500-530 nm) ve iletilen ışık kanalı ayarlayın. </li><li> Başlat &quot;canlı&quot; satın alma veÜç kanal toplama koşullarını optimize: </li><li> Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar görüntüleme uzun bir süre için ışıkla ağartma en aza indirmek için. </li><li> Gerekirse, görüntülerin daha iyi kalite için arka plan gürültü oranını azaltmak için her 2 ila 4 kare ortalama. 1 sn aralığı kullanın. </li></ol></li><li> GFP ve DIC (diferansiyel girişim kontrast) kanalın görünümünde güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. Yapışan hücreler morfolojik düz ve hızlı hareket etmezler. </li><li> Uzun vadeli görüntüleme (Şekil 3A) için ışıkla ağartma azaltmak için her bir kanal için dedektör kazancını artırırken yüksek ekspres GFP-PKD1, lazer gücünü düşürerek elde etme koşulunu optimize yapışan HL60 hücreleri belirlendikten sonra. </li><li> 200 ul pipetter ile fMLP / Alexa 594 çözüm 100 ul alın ve bir kenara koyun. &quot;Time-lapse edinimi&quot; seçin ve aralıkları ayarlamak2 sn ve kare sayısı 100&#39;e elde etmek. NOT: aralıkları ve elde etmek için kare sayısı deneylerin amacı bağlıdır. 1-2 saniye aralıklarla 100 kare genellikle Şekil 3&#39;de olduğu gibi, görüntüleme deneyleri için kullanılır. Yavaşça hücrelere taşımak için, uzun aralıklar uzun süreli görüntüleme için gereklidir. Bunun aksine, hücreleri hızla geçiş için, daha kısa aralıklarla hücre göçü sürekli ayrıntıları gözlemlemek için gereklidir. </li><li> Odanın konumu değişmez, böylece dikkatlice 4-iyi bir odasının kapağını çıkarmak. edinimi hemen başlayın ve bir rehber olarak lazer ışığının yerinde kullanarak hücreleri üzerinde doğrudan 200 ul pipetter konumlandırırken uyarılmamış hücrelerde 3-5 görüntüler elde. </li><li> hücreleri üzerinde fMLP / Alexa 594 karışımı akış ve time-lapse edinimi komple set bitirmek bile hızlı ile görüntülenmiş ve varlık pipetle. Ad ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek. </li></ol&gt; Görünür ve Kontrol Edilebilir Kemo-cezbedici Uyaranların 6. Görüntüleme chemotaxing Hücreleri <ol><li> 10 ul Mikropipet ve enjeksiyon ipuçlarını kullanarak, taze fMLP ve Alexa594 karışımı hazırlanmış 30 ul bir mikropipet dolgu. </li><li> , Istikrarlı bir degrade oluşturmak için mikropipet fMLP / Alexa594 çözümü serbest bırakmak için bir sabit basınç sağlayan bir cihaz, bir mikroskop sahne üstüne monte edilmiş bir mikropipet sahibine mikropipet takın ve basınç besleme ünitesine boru bağlayın. </li><li> Basınç kaynağı açın ve 70 hPa tazminat basıncı (Pc) ayarlayın. </li><li> konfokal mikroskop ya da ona eşdeğer floresan mikroskop 40X petrol lensin üzerinden PKD1-GFP ifade HL60 hücreleri ile seribaşı 1-iyi odacıklı lamel monte edin. </li><li> Aşağıdaki konfigürasyonda kanal modunda ayarlanabilir edinimi: GFP etiketli PKD1 için yeşil kanal (500-530 nm); kemoatraktan fMLP (Alexa594) kırmızı kanalı (580-620 nm); ve transyapışan HL60 hücrelerin belirlenmesi için hafif kanal sunulmamış. </li><li> &quot;Canlı&quot; satın alma başlatın ve üç kanal için satın alma koşulları optimize: görüntüleme verileri kantitatif analiz için her kanalın yoğunluklarını ayarlamak; Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar en kaliteli görüntü elde etmek ve fotoğraf çamaşır suyu en aza indirmek için. Gerekirse, daha iyi görüntü kalitesi için her 2 ila 4 kare ortalama. Biz genellikle bir 1 sn aralığı kullanınız. </li><li> &quot;Canlı&quot; satın alma başlatın ve GFP görünümü ve iletilen ışık kanallarda güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. FMLP degrade görselleştirmek için aydınlık alan optik, merkezi görünümünde (Şekil 4A) merkez alanında mikropipet kullanılarak ve PKD1-GFP ifade yapışan HL60 hücreleri. </li><li> time-lapse edinimi seçmek ve 100 elde etmek 2 sn aralıklarla ve kare sayısı aralıklarını ayarlayın. NOT: Her t topladıktan sonraime-lapse serisi, isim ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li><li>Wen, Z., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+nerve+growth+cones.">Directional guidance of nerve growth cones.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes.</a> The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Rex1+is+a+primary+Rac2+guanine+nucleotide+exchange+factor+in+mouse+neutrophils.">P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils.</a> Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensing+requires+G+beta+gamma-mediated+PAK1+and+PIX+alpha-dependent+activation+of+Cdc42.">Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42.</a> Cell. 114, 215-227 (2003).</li><li>Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR-Mediated+PLCbetagamma/PKCbeta/PKD+Signaling+Pathway+Regulates+the+Cofilin+Phosphatase+Slingshot+2+in+Neutrophil+Chemotaxis.">GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis.</a> Mol Biol Cell. , (2015).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PloS one. 5, e15309 (2010).</li><li>Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guenther+Gerisch+and+Dictyostelium,+the+microbial+model+for+ameboid+motility+and+multicellular+morphogenesis.">Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis.</a> Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+coupled+receptor+(GPCR)-mediated+signaling+events+that+control+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4, 164-167 (2004).</li><li>Eiseler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+regulates+cofilin-mediated+F-actin+reorganization+and+cell+motility+through+slingshot.">Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot.</a> Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).</li><li>Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+primary+acute+myeloid+leukaemia+blasts+and+myeloid+leukaemia+cell+lines.">Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines.</a> Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines.">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).</li><li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells.">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest for this work.

Bu çalışmada, biz kemotaksis deneyleri iki örnek gösterir: hücre hareketliliği analiz cihazı ile çok sayıda kemotaksis deneyleri ilk eş zamanlı izleme; ve ikinci, kemoatraktan degrade görüntüleme ve gerçek zamanlı olarak aynı hücrelerde sinyal olaylarının uzaysal dinamikleri. Aynı anda birden çok kemotaksis deneyleri için hücre hareketliliği analiz cihazı Bu çalışmada, biz bir hücre hareketlilik analizi cihazı kullanılarak aynı anda birden çok kemotaksis analizleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol tanıttı. Bu cihaz, kullanıcının, geleneksel parlak alan gözlem 10X objektif lens ile hücresel kemotaksis davranışlarını gözlemlemek için izin verir. Çünkü sıvı akışına difüzyon baskın özellikleri hücre hareketliliği analiz cihazı kolaylıkla tahmin edilebilir ve sabit bir geçişlerini oluşturan ve aynı zamanda gerçekleştirilebilir altı kemotaksis deneyleri izin verir. protokol kritik adımlarGüvenilir geçişlerini elde etmek ve teras hattında hücreleri hizalamak için. kullanıcı kesinlikle chemoattractants ve hücrelerin tutucu montaj ve enjeksiyon için üreticinin talimatlarını izlemelidir. Detaylı talimatlar da online olarak mevcuttur. Alternatif kemotaksis yöntemleri 11-13,15 ile karşılaştırıldığında, bu cihaz önemli derecede kemotaksis deneyleri etkinliğini ve güvenilirliğini artırır. ebatlarında hücre hareketlilik analiz cihazı çip dört boyutları 4, 5, 6, ve 8 mikron farklı tip ve hücrelerin boyutları karşılamak için kullanılabilir. Bir 4 ya da 5 mikron hücre hareketliliği analiz cihazı çip HL60 ve D için uygun olduğunu bulduk yaklaşık 10-15 um çapı olan discoideum hücreleri. Bununla birlikte, tek bir kısıtlama, bu cihaz, tüm hücre tipleri için uygun değildir olmasıdır. Biz Raw267.4 hücreleri ile hücre hareketliliği analiz cihazı kemotaksis testi kullanılarak küçük başarı vardı. nedeni Raw267.4 hücreleri çok yavaş göç olabilir. verimli che için gerekli süreRaw267.4 hücrelerinin motaxis gradyan cihazı tarafından tutulan bir süre daha uzun olabilir. Bunun yerine, bir Transwell göç tahlil Raw267.4 hücreleri 9 için çalıştı. Başka bir sınırlama floresan gözlem mevcut cihaz ile mümkün olmamasıdır. Bir gelecekteki yönünü daha yüksek büyütme ile floresan görüntüleme izlemektir. Bu floresan tespiti ve 100X objektif lens ile donatılmış gelişmiş hücre hareketlilik analizi cihazı ile mümkündür. Buna ek olarak, aynı anda deneylerin sayısı da Bütün bu gelişmeler kemotaksis deneyleri geliştirilmiş verim ve hücreleri göç eden hücre içi dinamiklerinin gözlemeyi kolaylaştırmak 12&#39;ye artırılır. HL60 hücrelerinin yüksek transfeksiyon verimi floresan protein etiketli proteini ifade etmek üzere HL60 hücrelerinin aktif bir şekilde bölünmesi lösemi hücre hattı ve süspansiyon içinde büyür. Daha önce 18-20 bildirdiği gibi, HL60 hücrelerinin g dirençliene transferi. Hem yağ ve elektroporasyon gibi gen transferi test edilmiştir ve elektroporasyon çünkü sonra elektroporasyon kaynaklanan ciddi hasar yüksek transfeksiyon verimi elde etmek için kritik olan, yüksek canlılığı elde bölüm 4&#39;de ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi daha yüksek transfeksiyon verimi, elektroporasyon ile elde edilmiştir. Daha sonra, tam ve nazik hücre işleme, özellikle elektroporasyon sonra, gereklidir. Tüm ortam önceden ısıtılmış ve yavaşça Elektroporasyon işleminden sonra herhangi bir adımda hücrelere ilave olması gerekir. Ayrıca, elektroporasyon reaktif hücrelerin maruz kalma süresini en aza indirmek için önemlidir. Hücre ölümünü önlemek için, Elektroporasyon işleminden sonra RPMI 1640 elektroporasyon geri kazanım aracı, hemen hücrelere ilave edilmelidir. Bu geri kazanım ortamı içinde% 20 FBS,% 10 FBS çok daha yüksek bir hücre elde oranı verir bulundu. Elektroporasyondan sonra, 30 dakika süre ile RPMI 1640 elektroporasyon geri ortamında kuluçka daha canlılığı ve transfeksiyon için kritiktirverimlilik. daha da transfeksiyon verimini artırmak için, üretici tarafından tavsiye edilen plazmid neredeyse iki katı kadardır transfeksiyon başına 4 ug plazmit DNA kullanılır. Protein ifade fanilik ve hücre sayısı sınırı (transfeksiyon başına 2 x 10 6 hücre): elektroporasyon transfeksiyon iki büyük sınırlamalar vardır. vektör plasmidi, her hücre bölünmesi sonrası yarıya seyreltilir yana farklılaşmamış hücreler, ekspresyon, sadece cep bölümleri ilk çift sırasında tespit edilebilir. farklılaşmış HL60 için hücreler fazla 48 saat hayatta. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir deneme, taze Transfeksiyonlar deney öncesinde 6 saat gerektirir. bir elektroporasyon için hücre sayısı sadece herhangi bir biyokimyasal deneyleri için asgari gereksinimi karşılar. tekrar kullanım veya büyük miktarda amaç için, güçlü bir şekilde farklılaşmamış HL60 hücre çizgisi kararlı bir şekilde ilgi WHI proteini eksprese tespit edilmesi önerilmektedirBir viral vektör, mevcut ya da imal edilebilir, eğer kanal, bir viral vektör ile floresan protein etiketlenmiş.

Ökaryotik hücreler algılar ve bir kemoatraktan degrade içinde yüksek konsantrasyonda doğru hareket, bir hücresel süreç kemotaksis olarak anılacaktır. Kemotaksis örneğin embriyojenez 1, nöron desen 2, kanser hücrelerinin 3 metastazı, enflamasyon 4 sitelerine nötrofillerin alımına ve model organizma Dictyostelium discoideum 5 gelişimi gibi birçok fizyolojik işlemlerde önemli bir rol oynar. Genel olarak, ökaryotik hücreler G protein-eşli reseptör 5 kullanılarak kimyasal çekici anlamda. Bu reseptörler ile chemoattractants geçme da sonuç olarak hücre göçü 5-9 sürmek için aktin hücre iskeletinin uzaysal organizasyonu düzenleyen aşağı akış sinyal iletim yolunu aktive heterotrimeric G proteinleri Gα ve Gβγ, ayrışmasına teşvik etmektedir. Hücre biyologları geliştirilmesi ve chemotax iyileştirilmesi olmuşturtahliller G-protein kenetli reseptör (GPCR) sinyal aracılık yapar, hücre göçü yönettiği nasıl incelemektir. Boyden odası veya Transwell göç tahlil Boyden 10 tarafından 1960 yılında geliştirilmiştir. Deney bir mikro-gözenekli membran ile ayrılmış, iki kuyu arasındaki kemoatraktan bileşiklerinin gradyanı oluşturarak çalışır. Sadeliği ve kullanım kolaylığı bugüne kadar en yaygın olarak kullanılan kemotaksi deneyi yapmak. Ancak, hücrelerin göç sürecini izin vermez tahlil görüntülenmiştir için. Zigmond odası bir kaynak kemoatraktan 11 doğru dar bir daralma karşısında bir lamel hücre göçü açık görüntüleme sağlayan ilk görsel mikroakışkan cihazdır. Dunn 12 ve Insall 13 modifiye ve Zigmond odası kemotaksis testin yüksek çözünürlüklü ve uzun süreli görüntüleme yeteneği gelişmiş. Çünkü sıvı akışının oldukça öngörülebilir, difüzyon baskın özellikleri, Mikroakiskan sonraki Generati için çözümler sunan olmuşturBu EZ-TAXIScan (hücre hareketliliği analiz cihazı) halinde kemotaksis deneyleri ile ilgili. Sağlanmış degrade istikrar ile, cihaz altı kemotaksis deneyleri aynı anda (Şekil 1A) yürütülen sağlar. Yukarıda çeşitli oda deneylerde üretilen yönsel sabit gradyanlar aksine, Günter Gerisch tarafından geliştirilen bir iğne ya da mikropipet deneyi hareketli bir kaynak 14 gradyanı oluşturur. tahlilde, kemoatraktan stabil gradyanı oluşturmak için hareket edebilen bir mikropipet salınır. Bu iğne testi ile, araştırmacılar farklı hücreler temelde farklı özelliklere sahip psödopod üretmek bulundu. Floresan mikroskop uygulayarak, biz 15 boyunca nicel ölçümünü kolaylaştırmak için degrade görselleştirmek için başardık. Bu çalışmada, biz aynı anda birden fazla kemotaksis assa izleme kemotaktik HL60 (insan promiyelositik lösemi) hücrelerinin hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri tarifHücre hareket analiz cihazı ve görünür, spatiotemporally kontrol kemo-çekici uyarıcıya tepki olarak bu tip bir tekli canlı hücrelerde protein kinaz D1 sinyal molekülleri GPCR aracılı uzaysal dinamikleri görselleştirme ys. Gelişmiş görüntüleme yöntemleri, genel kemotaksis çalışmaları uygulanır ve memeli hücre sistemleri için özellikle uygundurlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">61870-036</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scietific</td>
			<td style="width:120px;">11360-070</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:107px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:120px;">100-106</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1M HEPES sterile solution, pH7.3</td>
			<td style="width:107px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:120px;">A611-J848-06</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:120px;">15140122</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:120px;">NucleofectorTM 2b</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">AAB-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="217">
			<td height="217" style="height:217px;width:120px;">AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">VCA-1003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">2 % Gelatin solution</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1393</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F1141</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">HBSS (Hanks&#8217; Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">14025-076</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:120px;">Bovine serum albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:120px;">A3803</td>
			<td rowspan="2" style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Single well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155361</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Four-well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Alexa 594</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A-10438</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma -Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F3506-5MG</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Cover glass thickness 2 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:120px;">2855-22</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">MIC-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">EZT-F01-5</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1701RN 10ul syringe</td>
			<td style="width:107px;">Hamilton</td>
			<td align="right" style="width:120px;">80030</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Femtotips II Injection tips</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5242956003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Femtotips II</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">930000043</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:120px;">TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5188900056</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">DIAS software</td>
			<td style="width:107px;">Solltech Inc.</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="181">
			<td height="181" style="height:181px;width:120px;">LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Birden fazla HL60 hücrelerin kemotaksisi eş zamanlı görüntülenmesi hücre hareketlilik analizi cihazı kullanılarak Bir gradyan 1 dakika içinde oluşturulan 5 dakika içinde stabilize ve 2 saat boyunca devam: Mikroakiskan 16 ilkesine dayanarak, üretici geçişlerini simüle profillerini sağlamıştır. Mikroakiskan tarafından üretilen kararlı geçişlerini son derece öngörülebilir profilleri birden fazla kemotaksis deneyleri aynı anda yapılmasını sağlar. Bu çalışmada, biz aynı anda üç kemotaksis deneyleri (Şekil 2A ve Film 1) gözlemledi. Biz kemoatraktan kemoakraktan kuyuya enjekte edildikten sonra HL60 hücrelerinin hemen chemotaxing başladı bulundu ve degrade istikrar için simülasyon sonuçları ile tutarlı takip eden 60 dakika boyunca düz bir yolda chemotaxing tuttu. seyahat yolu ve morfolojisi izlemehücrelerin nicel ölçüm ve hücreleri (Şekil 2B) &#39;nin toplam yol uzunluğuna, hız, yönlülük ve yuvarlaklık içeren bir kemotaksis dizini kullanarak kemotaksis davranışlarının daha sonra karşılaştırılmasını sağlar. Toplam yol uzunluğu yolunun sentroidler birleştiren hat kesimlerinin uzunlukları toplamıdır. Hız zaman toplam yol uzunluğuna bölünmesiyle elde edilir. toplam yol uzunluğuna bölünmesiyle (Y yolun sonuna koordinatı eksi Y başından koordinatı): Directionality yukarı ölçülür ve olarak tanımlanır. Bu doğrudan yukarı doğru hareket eden bir nesne için 1.0 veriyor. Hücrenin yuvarlaklığı çevre belirli bir miktarının açıklıktan kadar etkin (yüzde olarak) bir ölçüsüdür. Bir daire herhangi bir çevre için en büyük alana sahip ve% 100 yuvarlaklık parametresi vardır. Düz bir çizgi hiçbir alanı kapsayan ve% 0 bir yuvarlaklık parametresi vardır. Seçilen kemotaksi parametreleri tarafından açıklandığı gibi kantitatif ölçülen kemotaksi davranışı göstermek(Şekil 2C). Bir spatiotemporally görebilir ve kontrol fMLP uyaran altında HL60 hücrelerinde PKD hücre içi lokalizasyonu izleme Deneysel bir sisteme floresan etiketli uygulamak için büyük bir teknik ilerleme ve kontrol kemoatraktan stimülasyon olduğunu. Tarihsel olarak, hücre yanıtı ve davranışlarını gözlemlemek için homojen (diğer adıyla üniforma) stimülasyon ya da degrade stimülasyon ya uyguladık. Ancak, &quot;kör&quot; uyarılması teşvik hücrelerine ulaştığı konusunda hiçbir zamanmekansal bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda biz uyaran görmüyorum, çünkü stimülasyon hücre yanıtının herhangi bir &quot;anormal&quot; gözlemlere şüphelidir. Daha önce bu floresan boya (Alexa594) göstermiştir kemoatraktan konsantrasyonu ve m arasında doğrusal bir ilişki kurmak için kemoatraktan ile uygulanabilirgerdiricileriyle floresan boya yoğunluğu 15. Yeşil floresan proteini (GFP), floresan boya (Alexa594) ve aktarılan ışık kırmızı emisyonu bir alıcı konfigürasyonu ile, yapışan hücreler, uyarıcı uygulanmasını ve uyarıcı hücre yanıtını izlemek mümkün (Şekil Şekil 3A). Protein kinaz D yönlendirilmiş hücre migrasyonu 9,17 temel rol oynayan serin / treonin kinazlar ailesidir. Buna karşılık eşit bir şekilde uygulanan fMLP (kırmızı) stimülasyon, HL60 hücrelerinin GFP etiketli protein kinaz D1 (yeşil) sağlam bir membran translokasyonu (Şekil 3B ve Film 2) aracılık ettiği. Bir fMLP gradyanı (kırmızı) (Şekil 4A) olarak, HL60 hücreleri aktif ön kenarı (Şekil 4B ve Film 3) için PKD1 işe. ileri ucun çıkıntı GFP hücre içi lokalizasyonu yakın bir karşılaştırma PKD1 (hücum kenarı arkasındaki lokalize olduğunu gösterirŞekil 4C). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre hareketlilik analiz cihazı 6 eşzamanlı kemotaksis deneyleri izin verir. (A) Şema 6 bağımsız kemotaksis deneyleri eşzamanlı izlenmesi için bir hücre hareketliliği analiz cihazı çip tasarımını göstermektedir. Kırmızı gösterileri oyuklara ilave kemoatraktan. Hücrelerin kuyulara HL60 hücrelerinin (B) Giriş kemoatraktan sürekli fMLP degrade kurmak için yayılır iken. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> HL60 hücreleri ile çoklu kemotaksis deneyleri Şekil 2. Eşzamanlı izleme. (A </strong&gt;) Montaj hücre hareketliliği analiz cihazı kemotaksis testinde görüntüleri PKD özgü 0 zamanlarda kemotaksi üzerinde inhibitörleri ve degrade uygulamadan sonra 12 dakika inhibitör etkilerini incelemek gösterir. Kemotaktik HL60 hücrelerinin 30 dakika boyunca PKD önleyicisi 1 uM CID755673 ile ön muamele edilmiştir. veya PKD inhibitörünün tedavi olmadan HL60 hücrelerinin RPMI1640 açlıktan ortamı ya da 12 dakika süre ile, 100 nM fMLP gradyanları ya chemotax bırakılmıştır. (B) Şema takip HL60 hücrelerinin gezi yol uzunluğu ve şekil gösterir. Toplam yol uzunluğu, hız, yönlülük ve yuvarlaklık olarak kemotaksis (C) miktarının belirlenmesi. SD gösterilen ortalama ±; n = CID755673 tedavi ile hiçbir gradyan, fMLP degrade CID755673 tedavi olmadan ve fMLP tedavisi için 10, 12 ya da 11, sırasıyla. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. muntazam uygulanan fMLP uyarıcıya tepki olarak PKD1 sağlam membran translokasyonu GPCR aracılı (A). PKD1-GFP (yeşil) çok kanallı izleme, kemoatraktan (1 uM fMLP 0.1 ug ile karıştırılır / ml fluoresan boya Alexa 594, kırmızı) ve DIC (diferansiyel-interferans-kontrast) RPMI 1640 ortamında% 0.2 jelatin ile kaplanmış bir 4well bölmesinin bir kuyuda yapışan HL60 hücreleri tanımlamak için. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (B) Montaj eşit uygulamalı fMLP (kırmızı) PKD1-GFP (yeşil) sağlam membran translokasyonu uyardığını göstermektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> FigürHL60 hücreleri chemotaxing içinde PKD1 e 4. Öncü kenar yerelleştirme. (A) Kanal modu toplama yapılandırma fMLP degrade görselleştirme ve PKD1 uzaysal dinamiklerini kolaylaştırır. A - C, HL60 hücreleri geçici GFP etiketli PKD1 ifade; Mikropipet (DIC), 100 nM fMLP (Kırmızı) elde fMLP gradyanı görselleştirmek için 0.1 ug / ml fluoresan boya Alexa 594 (B) &#39;chemotaxing hücresi ön kenarında PKD1 zenginleştirilmiştir lokalizasyonu ile karıştırıldı. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (C) birleştirilmiş ve görüntüler PKD1 HL60 hücrelerinde ileri ucun arka lokalize olduğunu göstermektedir. Yeşil PKD1 hücresel yerleşimi gösterir ve DIC görüntü ön kenarı çıkıntılı alanı gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

imaging-g-protein-coupled-receptor-mediated-chemotaxis-its-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. 

Video: Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Ferumoxides implantasyonu Kıkırdak Kusur İnsan Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Biyoloji

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler