Name: imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

1. Kültür ve İnsan Farklılaşma Nötrofil gibi HL60 Hücreleri <ol><li> Hazırlama RPMI (Roswell Park Memorial Institute) RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat içeren 1640 kültür ortamı ve 25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1 -piperazineethanesulfonic asit). 37 ° C&#39;ye kadar bir RPMI 1640 kültür ortamı ısıtın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin log-faz büyüme aşamasında olduğundan emin olmak için HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu belirlemek. NOT: Hücreler Pasajlanması sonra üçüncü gününde log fazı genellikle. Log-faz hücrelerinin yoğunluğu genellikle 6-8 x 10 5 hücre / ml &#39;dir. Yeni bir kültürünü başlatmak için hücre yoğunluğu yaklaşık 1.5 x 10 5 hücre / ml &#39;dir. Not: Örneğin, T-75, düz bir şişe içinde 10 mi, yeni kültür, log-faz hücrelerinin daha sonra hücre yoğunluğu 6 x 10 5 hücre / mi, log-faz hücrelerinin (2.5 mL 6 X 10 5 ise, ) 10 m 1.5 x 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltilirl yeni kültür. 10 ml kültüre nihai bir hacim ilave edilir RPMI 1640 kültür ortamı içinde 7.5 ml yapmak için. </li><li> Düz bir şişeye ılık RPMI 1640 kültür ortamı hesaplanan hacim yerleştirin. T-75 düz bir şişe kültürü, hücre kültürü, toplam hacmi 10 ml&#39;dir. </li><li> 1.5 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğuna ulaşmak için, düz bir şişeye log-faz artan HL60 hücrelerinin hesaplanan hacim. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. NOT: HL60 iki katına zaman neredeyse 24 saattir. </li><li> RPMI 1640 kültür ortam maddesi ile Geçiş hücreler her 2-3 günde. HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu asla 1.5 x 10 6 hücre / ml aşıyor ve hücre geçit artık 2 aydan sürer önemlidir. </li><li> Deneylerde önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. Not: RPMI 1640 farklılaştırma ortamı RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM lH içerirEPES ve% 1.3 dimetil sülfoksit (DMSO). Diğer bir deyişle, bu RPMI 1640 kültür ortamı içinde% 1.3 DMSO. <ol><li> HL60 hücreleri ayırt etmek için, 37 ° C bir RPMI 1640 kültür ortamı önceden ısıtın. Düz balona sıcak RPMI 1640 kültür ortamı ekleyin. </li><li> DMSO hızlı bir RPMI 1640 kültür ortamı ile seyreltildi, böylece balon dönen ise bir son 10 ml HL60 farklılaşma kültürü için, düz bir şişede RPMI 1640 kültür ortamı, doğrudan 130 ul DMSO ilave edin. </li><li> Bir son 10 ml RPMI 1640 farklılaşma ortamı içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre yoğunluğu log-faz HL60 hücreleri ekleyin. Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de RPMI 1640 ortamı içinde farklılaşma HL60 hücreleri. </li></ol></li></ol> 2. 4well Odası Kapak Cam Yüzey Kaplama <ol><li> , Buzdolabından% 2 jelatin stok solüsyonu şişe almak% 70 etanol ile temizleyin ve kaputu yerleştirin. TAKE 1 ml% 2 jelatin stok solüsyonu ve hemen buzdolabına kalan jelatin stok solüsyonu döner. </li><li> jelatin çözeltisi tam 37 ° C&#39;de sıvılaştırılması ve iyice pipet izin verin. 9 mi önceden ısıtılmış 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi ile% 2&#39;lik bir jelatin stok solüsyonu seyreltik (HBSS)% 0.2 jelatin son konsantrasyonu tampon. </li><li> sırasıyla altındaki bir kapak camı ile 4 oyuklu odasının iki orta kuyu veya 1 oyuklu bölmeye HBSS içinde 0.5 ml ya da 2 ml% 0.2 jelatin ekleyin. Sıvı tüm yüzey alanını kaplayacak şekilde çeşitli yönlere plakaları eğin. </li><li> 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. Plakalar 1 saat içinde kullanıma hazır olur. Bunlar en fazla 5 gün için de kullanılabilir. Sadece hücrelerin ekim önce, 4-iyi ya da 1-kuyu odalarından jelatin çözüm kaldırmak. </li></ol> 3. Kemotaksis Deneyi kullanılarak hücre hareketliliği Analiz Cihazı <ol><li> RPMI olduğunu hazırlayın ve sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı,0.1 mM sodyum piruvat (isteğe bağlı) ve 25 mM HEPES içeren ortam. </li><li> orta açlıktan RPMI 1640 içinde, 100 nM fMLP (N-formilmetionil-lösil-fenilalanin), 100 ul hazırlayın. </li><li> % 1 sığır serum albümini 3 ml (BSA) Hazırlama / RPMI ortamı ve% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı 10 ml açlıktan RPMI 1640 içinde% 1 BSA içeren 1640 ortamı. </li><li> Ceket 22 mm&#39;lik kare lamel ve taze hazırlanmış% 1 BSA ile bir 5 mikron hücre hareketliliği analiz cihazı çip / RPMI 1640 ortamı oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> Aşağıdaki prosedürü kullanarak Holder birleştirin: <ol><li> kolları kullanıcı doğru eğin, böylece dikey pozisyonda kolları ile tutucu tabanını yerleştirin. 41 mm&#39;lik cam yüzeyine% 70 etanol çözeltisi uygulanır. Dikkatle çizmemeye özen bir silme ile yüzeyleri silin. </li><li> tutucu üssü haline 41 mm cam yerleştirin. tutucu tabanında 41 mm cam üstünde BSA ile kaplanmış 22 mm kare lamel koyun. NOT: Kaplanmış kare c41 mm cam ve yonga arasındaki overslip kemotaksis kaplama yüzeyinin alt tabaka oluşmasına izin verir. </li><li> gofret konut dibine O-halkayı (küçük) yerleştirin ve arkada eliptik delik olan tutucu üssü haline gofret konut monte edin. konumunda gofret konut kilitlemek için yatay pozisyonda ileri tutucu tabanının iç düzeyini çekin. </li><li> bir hava silgi ile gofret yuvanın iç tozları üfleyin. Gofret yuva içine% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı içinde 4 ml. </li><li> aşağı cam ile temas yapısal yüzü ile gofret mahfazanın ortasında BSA ile kaplanmış hücre hareketliliği analiz cihazı çip monte edin. NOT: çip arka konumlandırma işareti (çip üstünde delik) ile takılması gerekir bu. </li><li> deliklere lastik conta iki çıkıntılar takarak gofret kelepçe altına lastik conta yapıştırın. </li><li> üzerine O-halkasını (büyük) monte edingofret konut üst. arka sensör delik ile gofret kelepçesini takın. yerine gofret kelepçe kilitlemek için yatay pozisyonda ileri konut tabanının dış kolunu çekin. </li><li> tutucu montajından sonra, kuyularda hiçbir hava kabarcığı olduğunu doğrulamak için ışık kutusu üzerinde sahibinin alt yerleştirin. Hava kabarcıkları tespit edilirse, bir örnek yükleme ucu ile donatılmış verilen plastik şırınga kullanarak bunları kaldırın. </li><li> Kapağı çıkarın ve hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin üstünde plaka üzerine montajını koydu. sahibine sensör bloğunu takın. </li></ol></li><li> Kemotaksis Deneyi için HL60 hücrelerinin hazırlanması: <ol><li> hemositometre ile Farklılaşmış HL60 hücreleri hücre yoğunluğu hesaplanır. Farklılaşma 5 gün sonra hücre yoğunluğu yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. </li><li> 2 x 10 6 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu HL60 hücreleri son hacim hesaplanır. Örneğin, hücre yoğunluğuFarklılaşmış HL60 hücreleri, 1.0 x 10 6 hücre / o mi, Farklılaşmış HL60 hücreleri 10 mi, 2 x 10 6 hücre / ml ulaşmak için 5 mi% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş olacaktır. </li><li> Santrifüj 200&#39;de HL60 hücreleri ayırt Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. % 0.1 BSA, hesaplanan hacmi ile hücrelerin Süpernatantı ve tekrar süspansiyon / 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre yoğunluğu RPMI aşama 3.6.2 de 1640 ortamı). </li></ol></li><li> görüntü elde etmek için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitesi ve PC başlatın. Üniteyi bilgisayara bağlayın. Hücre hareketlilik analizi aygıtı açın. Bilgisayarı açın. </li><li> Hücre Hareketlilik Analizi Device Software Up başlayın. <ol><li> Kamera, ısıtıcı, çekim, not ve kamera görüntüleri: 5 kontrol panelleri gözlemleyin. </li><li> Kamera görüntü kontrol panelinde, kamera görüntü panelinde kamera ortalamak için gerçek zamanlı olarak tutucu / görünüm konumunu ayarlamak için &quot;Yatay çizgi&quot; veya &quot;Dikey çizgi&quot; kullanın. </li><li> Kamera kontrol panelinde, belirlenen kanala kamera taşımak için CH6 CH1 seçin. Bir kanalın görünüm alanlarını ortalamak için, kameranın X-koordinatı ve yatay kameranın konumunu ortalamak ayarlamak için &quot;R Taşı&quot;, &quot;Taşı L&quot; tıklayın ya. </li><li> Ayarlayın dikey ekran ortalamak için Görüntüyü ayarlamak için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin ön panelindeki pozisyon düğmesini çevirerek kameranın Y koordinatı. </li><li> Isıtıcı kontrol panelinde, 37.0 ° C &quot;tutucu temp&quot; ve 39 ° C &quot;plaka sıcaklığı&quot; olarak ayarlayın. Isıtma başlatmak için &quot;Heat&quot; tıklayın. Ayrıca tutucuya bağlı termal sensör kullanarak sıcaklığı kontrol etmek için &quot;tutucu&quot; tıklayın. </li><li> Çekim panelinde, &quot;Aralık&quot; at &quot;15 sn&quot; ve aralıkları için &quot;Time&quot; de &quot;30 dakika&quot; ve kemotaksis testinde süresini girin. Kontrol güvenlik nedeniyle &quot;çekim sonunda kapalı ısıtıcı&quot;. Bir DE belirtinsaklanan görüntüler için stination. </li><li> Not panelinde, hücre hattı gibi deneylerin giriş özelliklerini, tedavi uygulandı olsun ya da olmasın, kullanılabilir ve kemo-cezbedici konsantrasyonu uygulanır. </li><li> Deneylerde kullanılacak tüm kanallar merkezi konumda olması garantilenir ve gerekirse, tüm kanallar için ayarlamasını tekrarlayın. </li></ol></li><li> Enjekte edilir ve takip Hücreleri hizalayın: <ol><li> tutucudan tamponu çıkarın ve her bir kanal için üstten üçüncü gelen tampon 8 ul çıkar. </li><li> Hücre sayısını kontrol etmek ve enjeksiyon esnasında akması için gerçek zamanlı olarak ekranda izleme sırasında aynı kanalda ikinci kuyuya hücre 2 ul enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Hücreler güzel hizalanmış sonra, derhal tampon 8 ul geri ekleyin. Diğer kanallar (Şekil 1B) için de aynı işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> geri sahibine tampon ml 2 ekleyin ve 1 ul 100 nM FM ekleyinüstten üçüncü oyuk LP. görüntü elde etme başlatın ve verileri kaydetmek. Görüntüyü yazılımını 9 izleme (Şekil 2) kullanılarak elde edilen verileri analiz edin. </li></ol> Elektroporasyon 4. Transfeksiyon <ol><li> Bölüm 2&#39;de belirtildiği gibi Bölüm 1. Kat 4-iyi ya da 1-kuyu odaları açıklandığı gibi deneyden önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. </li><li> Hazırlama ve 37 ° C&#39;de RPMI 1640 ortamı,% 20 (h / h) FBS, 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM HEPES içeren, sıcak RPMI 1640 elektroporasyon geri ortamı. </li><li> Sağ transfeksiyon deney başlamadan önce, sırasıyla, önceden kaplanmış 4-iyi ya da 1-kuyu odaları kuyulara 300 ul veya 3 ml RPMI 1640 kültür ortamı ya ekleyin. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde odaları inkübe edin. ileride kullanmak (iki hafta) inkübatöre hemen veya deposu bu odadan kullanın. </li><li> farklılaşmış HL6 hücre yoğunluğu sayısıBir hemasitometre 0 hücreleri. Not: Hücre yoğunluğu genellikle yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml&#39;ye ulaştığı. Hücre yoğunluğu daha 3.0 x 10 6 hücre daha / ml genellikle istenmeyen transfeksiyon verimi sağlar. HL60 hücrelerinin süspansiyon hücreleri olduğu için, herhangi bir re-süspansiyon gereklidir. </li><li> 200 hücreleri santrifüj Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. Süpernatantı ve transfeksiyon reaktifi, 100 ul 2 x 10 6 HL60 hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücreleri ve transfeksiyon reaktifler 100 ul karışımı içine GFP-PKD1 plazmid 9 4 ug ekleyin ve hafifçe ve iyice karıştırın. sağlanan küvetin içine karışımı ekleyin. </li><li> insan lökosit hücre hattı için üreticinin önceden ayarlanmış programı seçin ve elektroporasyon gerçekleştirin. NOT: Daha fazla bilgi üreticisinin web sitesinden edinilebilir. </li><li> Elektroporasyondan sonra, hemen ve yavaşça ilave hücrelere 500 ul RPMI 6140 elektroporasyon kurtarma ortamı önceden ısıtılmış veyavaşça verilen plastik pipetler ile 1.6 ml tüp küvet hücreleri aktarın. </li><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. Tohum 100 ul veya sırasıyla bir 4-kuyu kuyu veya 1-kuyu odasına, içine hücreleri 500 ul. </li><li> sırasıyla 1 ml veya bir 4-kuyusunun aynı oyuğuna 4 ml&#39;lik bir son hacim ya da 1-çukurlu odasına RPMI 1640 kültür ortamı. 3 saat,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin. Pre-sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı 37 ° C. </li><li> 1 ml pipet kullanarak, yavaşça sırasıyla 4 oyuklu bölmenin oyuk ya da 1-çukurlu haznesinden RPMI 1640 kültür ortamı, 0.8 ml veya 3 ml çıkarın. Nazik olun ve yapışan HL60 hücreleri uzakta emme kaçının. NOT: HL60 hücrelerin büyümesine ve süspansiyon medyada ayrılır. bazı tedaviler ile birlikte veya farklılaştırılmış sonra, HL60 hücrelerinin polilisin, kolajen, jelatin ya da fi ile kaplanmış alt tabaka bağlıbronectin. </li><li> sırasıyla 4-iyi ya da 1-de bölmenin kuyuya orta açlıktan 0.8 ml ya da RPMI 1640 3 ml ekleyin. 1 saat bekleyin. NOT: Bu noktada hücreler görüntüleme deneyleri 9 için hazırdır. </li></ol> 5. İzleme GPCR aracılı Çok kanallı Floresan Mikroskobu PKD1 Membran Translokasyon <ol><li> uyaran olarak orta aç RPMI 1640 içinde 100 nM fMLP ve 1 ug / ml Alexa 594 taze bir karışım hazırlayın. NOT: fMLP ve Alexa 594 ihtiyaçlar karışımı taze maksimum etkinlik sağlamak için yapılacaktır. </li><li> Dağı bir 4-iyi odasının 40X petrol lensin üzerinden hücreleri ile ekildi. </li><li> Şöyledir olarak Çok Kanallı Yapılandırması Floresan Mikroskop ayarlayın: <ol><li> yapışan HL60 hücrelerinin tanımlanması için kemoatraktan fMLP için GFP etiketli PKD1, kırmızı emisyon kanalı (580-620 nm) (Alexa 594) yeşil emisyon kanalı (500-530 nm) ve iletilen ışık kanalı ayarlayın. </li><li> Başlat &quot;canlı&quot; satın alma veÜç kanal toplama koşullarını optimize: </li><li> Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar görüntüleme uzun bir süre için ışıkla ağartma en aza indirmek için. </li><li> Gerekirse, görüntülerin daha iyi kalite için arka plan gürültü oranını azaltmak için her 2 ila 4 kare ortalama. 1 sn aralığı kullanın. </li></ol></li><li> GFP ve DIC (diferansiyel girişim kontrast) kanalın görünümünde güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. Yapışan hücreler morfolojik düz ve hızlı hareket etmezler. </li><li> Uzun vadeli görüntüleme (Şekil 3A) için ışıkla ağartma azaltmak için her bir kanal için dedektör kazancını artırırken yüksek ekspres GFP-PKD1, lazer gücünü düşürerek elde etme koşulunu optimize yapışan HL60 hücreleri belirlendikten sonra. </li><li> 200 ul pipetter ile fMLP / Alexa 594 çözüm 100 ul alın ve bir kenara koyun. &quot;Time-lapse edinimi&quot; seçin ve aralıkları ayarlamak2 sn ve kare sayısı 100&#39;e elde etmek. NOT: aralıkları ve elde etmek için kare sayısı deneylerin amacı bağlıdır. 1-2 saniye aralıklarla 100 kare genellikle Şekil 3&#39;de olduğu gibi, görüntüleme deneyleri için kullanılır. Yavaşça hücrelere taşımak için, uzun aralıklar uzun süreli görüntüleme için gereklidir. Bunun aksine, hücreleri hızla geçiş için, daha kısa aralıklarla hücre göçü sürekli ayrıntıları gözlemlemek için gereklidir. </li><li> Odanın konumu değişmez, böylece dikkatlice 4-iyi bir odasının kapağını çıkarmak. edinimi hemen başlayın ve bir rehber olarak lazer ışığının yerinde kullanarak hücreleri üzerinde doğrudan 200 ul pipetter konumlandırırken uyarılmamış hücrelerde 3-5 görüntüler elde. </li><li> hücreleri üzerinde fMLP / Alexa 594 karışımı akış ve time-lapse edinimi komple set bitirmek bile hızlı ile görüntülenmiş ve varlık pipetle. Ad ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek. </li></ol&gt; Görünür ve Kontrol Edilebilir Kemo-cezbedici Uyaranların 6. Görüntüleme chemotaxing Hücreleri <ol><li> 10 ul Mikropipet ve enjeksiyon ipuçlarını kullanarak, taze fMLP ve Alexa594 karışımı hazırlanmış 30 ul bir mikropipet dolgu. </li><li> , Istikrarlı bir degrade oluşturmak için mikropipet fMLP / Alexa594 çözümü serbest bırakmak için bir sabit basınç sağlayan bir cihaz, bir mikroskop sahne üstüne monte edilmiş bir mikropipet sahibine mikropipet takın ve basınç besleme ünitesine boru bağlayın. </li><li> Basınç kaynağı açın ve 70 hPa tazminat basıncı (Pc) ayarlayın. </li><li> konfokal mikroskop ya da ona eşdeğer floresan mikroskop 40X petrol lensin üzerinden PKD1-GFP ifade HL60 hücreleri ile seribaşı 1-iyi odacıklı lamel monte edin. </li><li> Aşağıdaki konfigürasyonda kanal modunda ayarlanabilir edinimi: GFP etiketli PKD1 için yeşil kanal (500-530 nm); kemoatraktan fMLP (Alexa594) kırmızı kanalı (580-620 nm); ve transyapışan HL60 hücrelerin belirlenmesi için hafif kanal sunulmamış. </li><li> &quot;Canlı&quot; satın alma başlatın ve üç kanal için satın alma koşulları optimize: görüntüleme verileri kantitatif analiz için her kanalın yoğunluklarını ayarlamak; Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar en kaliteli görüntü elde etmek ve fotoğraf çamaşır suyu en aza indirmek için. Gerekirse, daha iyi görüntü kalitesi için her 2 ila 4 kare ortalama. Biz genellikle bir 1 sn aralığı kullanınız. </li><li> &quot;Canlı&quot; satın alma başlatın ve GFP görünümü ve iletilen ışık kanallarda güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. FMLP degrade görselleştirmek için aydınlık alan optik, merkezi görünümünde (Şekil 4A) merkez alanında mikropipet kullanılarak ve PKD1-GFP ifade yapışan HL60 hücreleri. </li><li> time-lapse edinimi seçmek ve 100 elde etmek 2 sn aralıklarla ve kare sayısı aralıklarını ayarlayın. NOT: Her t topladıktan sonraime-lapse serisi, isim ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li><li>Wen, Z., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+nerve+growth+cones.">Directional guidance of nerve growth cones.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes.</a> The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Rex1+is+a+primary+Rac2+guanine+nucleotide+exchange+factor+in+mouse+neutrophils.">P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils.</a> Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensing+requires+G+beta+gamma-mediated+PAK1+and+PIX+alpha-dependent+activation+of+Cdc42.">Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42.</a> Cell. 114, 215-227 (2003).</li><li>Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR-Mediated+PLCbetagamma/PKCbeta/PKD+Signaling+Pathway+Regulates+the+Cofilin+Phosphatase+Slingshot+2+in+Neutrophil+Chemotaxis.">GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis.</a> Mol Biol Cell. , (2015).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PloS one. 5, e15309 (2010).</li><li>Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guenther+Gerisch+and+Dictyostelium,+the+microbial+model+for+ameboid+motility+and+multicellular+morphogenesis.">Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis.</a> Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+coupled+receptor+(GPCR)-mediated+signaling+events+that+control+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4, 164-167 (2004).</li><li>Eiseler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+regulates+cofilin-mediated+F-actin+reorganization+and+cell+motility+through+slingshot.">Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot.</a> Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).</li><li>Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+primary+acute+myeloid+leukaemia+blasts+and+myeloid+leukaemia+cell+lines.">Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines.</a> Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines.">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).</li><li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells.">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest for this work.

Bu çalışmada, biz kemotaksis deneyleri iki örnek gösterir: hücre hareketliliği analiz cihazı ile çok sayıda kemotaksis deneyleri ilk eş zamanlı izleme; ve ikinci, kemoatraktan degrade görüntüleme ve gerçek zamanlı olarak aynı hücrelerde sinyal olaylarının uzaysal dinamikleri. Aynı anda birden çok kemotaksis deneyleri için hücre hareketliliği analiz cihazı Bu çalışmada, biz bir hücre hareketlilik analizi cihazı kullanılarak aynı anda birden çok kemotaksis analizleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol tanıttı. Bu cihaz, kullanıcının, geleneksel parlak alan gözlem 10X objektif lens ile hücresel kemotaksis davranışlarını gözlemlemek için izin verir. Çünkü sıvı akışına difüzyon baskın özellikleri hücre hareketliliği analiz cihazı kolaylıkla tahmin edilebilir ve sabit bir geçişlerini oluşturan ve aynı zamanda gerçekleştirilebilir altı kemotaksis deneyleri izin verir. protokol kritik adımlarGüvenilir geçişlerini elde etmek ve teras hattında hücreleri hizalamak için. kullanıcı kesinlikle chemoattractants ve hücrelerin tutucu montaj ve enjeksiyon için üreticinin talimatlarını izlemelidir. Detaylı talimatlar da online olarak mevcuttur. Alternatif kemotaksis yöntemleri 11-13,15 ile karşılaştırıldığında, bu cihaz önemli derecede kemotaksis deneyleri etkinliğini ve güvenilirliğini artırır. ebatlarında hücre hareketlilik analiz cihazı çip dört boyutları 4, 5, 6, ve 8 mikron farklı tip ve hücrelerin boyutları karşılamak için kullanılabilir. Bir 4 ya da 5 mikron hücre hareketliliği analiz cihazı çip HL60 ve D için uygun olduğunu bulduk yaklaşık 10-15 um çapı olan discoideum hücreleri. Bununla birlikte, tek bir kısıtlama, bu cihaz, tüm hücre tipleri için uygun değildir olmasıdır. Biz Raw267.4 hücreleri ile hücre hareketliliği analiz cihazı kemotaksis testi kullanılarak küçük başarı vardı. nedeni Raw267.4 hücreleri çok yavaş göç olabilir. verimli che için gerekli süreRaw267.4 hücrelerinin motaxis gradyan cihazı tarafından tutulan bir süre daha uzun olabilir. Bunun yerine, bir Transwell göç tahlil Raw267.4 hücreleri 9 için çalıştı. Başka bir sınırlama floresan gözlem mevcut cihaz ile mümkün olmamasıdır. Bir gelecekteki yönünü daha yüksek büyütme ile floresan görüntüleme izlemektir. Bu floresan tespiti ve 100X objektif lens ile donatılmış gelişmiş hücre hareketlilik analizi cihazı ile mümkündür. Buna ek olarak, aynı anda deneylerin sayısı da Bütün bu gelişmeler kemotaksis deneyleri geliştirilmiş verim ve hücreleri göç eden hücre içi dinamiklerinin gözlemeyi kolaylaştırmak 12&#39;ye artırılır. HL60 hücrelerinin yüksek transfeksiyon verimi floresan protein etiketli proteini ifade etmek üzere HL60 hücrelerinin aktif bir şekilde bölünmesi lösemi hücre hattı ve süspansiyon içinde büyür. Daha önce 18-20 bildirdiği gibi, HL60 hücrelerinin g dirençliene transferi. Hem yağ ve elektroporasyon gibi gen transferi test edilmiştir ve elektroporasyon çünkü sonra elektroporasyon kaynaklanan ciddi hasar yüksek transfeksiyon verimi elde etmek için kritik olan, yüksek canlılığı elde bölüm 4&#39;de ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi daha yüksek transfeksiyon verimi, elektroporasyon ile elde edilmiştir. Daha sonra, tam ve nazik hücre işleme, özellikle elektroporasyon sonra, gereklidir. Tüm ortam önceden ısıtılmış ve yavaşça Elektroporasyon işleminden sonra herhangi bir adımda hücrelere ilave olması gerekir. Ayrıca, elektroporasyon reaktif hücrelerin maruz kalma süresini en aza indirmek için önemlidir. Hücre ölümünü önlemek için, Elektroporasyon işleminden sonra RPMI 1640 elektroporasyon geri kazanım aracı, hemen hücrelere ilave edilmelidir. Bu geri kazanım ortamı içinde% 20 FBS,% 10 FBS çok daha yüksek bir hücre elde oranı verir bulundu. Elektroporasyondan sonra, 30 dakika süre ile RPMI 1640 elektroporasyon geri ortamında kuluçka daha canlılığı ve transfeksiyon için kritiktirverimlilik. daha da transfeksiyon verimini artırmak için, üretici tarafından tavsiye edilen plazmid neredeyse iki katı kadardır transfeksiyon başına 4 ug plazmit DNA kullanılır. Protein ifade fanilik ve hücre sayısı sınırı (transfeksiyon başına 2 x 10 6 hücre): elektroporasyon transfeksiyon iki büyük sınırlamalar vardır. vektör plasmidi, her hücre bölünmesi sonrası yarıya seyreltilir yana farklılaşmamış hücreler, ekspresyon, sadece cep bölümleri ilk çift sırasında tespit edilebilir. farklılaşmış HL60 için hücreler fazla 48 saat hayatta. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir deneme, taze Transfeksiyonlar deney öncesinde 6 saat gerektirir. bir elektroporasyon için hücre sayısı sadece herhangi bir biyokimyasal deneyleri için asgari gereksinimi karşılar. tekrar kullanım veya büyük miktarda amaç için, güçlü bir şekilde farklılaşmamış HL60 hücre çizgisi kararlı bir şekilde ilgi WHI proteini eksprese tespit edilmesi önerilmektedirBir viral vektör, mevcut ya da imal edilebilir, eğer kanal, bir viral vektör ile floresan protein etiketlenmiş.

Ökaryotik hücreler algılar ve bir kemoatraktan degrade içinde yüksek konsantrasyonda doğru hareket, bir hücresel süreç kemotaksis olarak anılacaktır. Kemotaksis örneğin embriyojenez 1, nöron desen 2, kanser hücrelerinin 3 metastazı, enflamasyon 4 sitelerine nötrofillerin alımına ve model organizma Dictyostelium discoideum 5 gelişimi gibi birçok fizyolojik işlemlerde önemli bir rol oynar. Genel olarak, ökaryotik hücreler G protein-eşli reseptör 5 kullanılarak kimyasal çekici anlamda. Bu reseptörler ile chemoattractants geçme da sonuç olarak hücre göçü 5-9 sürmek için aktin hücre iskeletinin uzaysal organizasyonu düzenleyen aşağı akış sinyal iletim yolunu aktive heterotrimeric G proteinleri Gα ve Gβγ, ayrışmasına teşvik etmektedir. Hücre biyologları geliştirilmesi ve chemotax iyileştirilmesi olmuşturtahliller G-protein kenetli reseptör (GPCR) sinyal aracılık yapar, hücre göçü yönettiği nasıl incelemektir. Boyden odası veya Transwell göç tahlil Boyden 10 tarafından 1960 yılında geliştirilmiştir. Deney bir mikro-gözenekli membran ile ayrılmış, iki kuyu arasındaki kemoatraktan bileşiklerinin gradyanı oluşturarak çalışır. Sadeliği ve kullanım kolaylığı bugüne kadar en yaygın olarak kullanılan kemotaksi deneyi yapmak. Ancak, hücrelerin göç sürecini izin vermez tahlil görüntülenmiştir için. Zigmond odası bir kaynak kemoatraktan 11 doğru dar bir daralma karşısında bir lamel hücre göçü açık görüntüleme sağlayan ilk görsel mikroakışkan cihazdır. Dunn 12 ve Insall 13 modifiye ve Zigmond odası kemotaksis testin yüksek çözünürlüklü ve uzun süreli görüntüleme yeteneği gelişmiş. Çünkü sıvı akışının oldukça öngörülebilir, difüzyon baskın özellikleri, Mikroakiskan sonraki Generati için çözümler sunan olmuşturBu EZ-TAXIScan (hücre hareketliliği analiz cihazı) halinde kemotaksis deneyleri ile ilgili. Sağlanmış degrade istikrar ile, cihaz altı kemotaksis deneyleri aynı anda (Şekil 1A) yürütülen sağlar. Yukarıda çeşitli oda deneylerde üretilen yönsel sabit gradyanlar aksine, Günter Gerisch tarafından geliştirilen bir iğne ya da mikropipet deneyi hareketli bir kaynak 14 gradyanı oluşturur. tahlilde, kemoatraktan stabil gradyanı oluşturmak için hareket edebilen bir mikropipet salınır. Bu iğne testi ile, araştırmacılar farklı hücreler temelde farklı özelliklere sahip psödopod üretmek bulundu. Floresan mikroskop uygulayarak, biz 15 boyunca nicel ölçümünü kolaylaştırmak için degrade görselleştirmek için başardık. Bu çalışmada, biz aynı anda birden fazla kemotaksis assa izleme kemotaktik HL60 (insan promiyelositik lösemi) hücrelerinin hazırlanması için ayrıntılı yöntemleri tarifHücre hareket analiz cihazı ve görünür, spatiotemporally kontrol kemo-çekici uyarıcıya tepki olarak bu tip bir tekli canlı hücrelerde protein kinaz D1 sinyal molekülleri GPCR aracılı uzaysal dinamikleri görselleştirme ys. Gelişmiş görüntüleme yöntemleri, genel kemotaksis çalışmaları uygulanır ve memeli hücre sistemleri için özellikle uygundurlar.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td><td>Life technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scietific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES sterile solution, pH 7.3</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>A611-J848-06</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Cell Line Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Kit V including Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Solution, Singe use pipettes, Amaxa&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; certified 100 ml aluminum electrode cuvettes</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution)</td><td>Life technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single well Lab-Tek II coverglass chambers</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Four-well Lab-Tek II coverglass chambers</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-10438</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>F3506-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mm</td><td>Corning</td><td>2855-22</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>MIC-1001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>EZT-F01-5</td><td></td></tr><tr><td>1701RN 10 &amp;mu;l syringe</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II Injection tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5188900056</td><td></td></tr><tr><td>DIAS software</td><td>Solltech Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Birden fazla HL60 hücrelerin kemotaksisi eş zamanlı görüntülenmesi hücre hareketlilik analizi cihazı kullanılarak Bir gradyan 1 dakika içinde oluşturulan 5 dakika içinde stabilize ve 2 saat boyunca devam: Mikroakiskan 16 ilkesine dayanarak, üretici geçişlerini simüle profillerini sağlamıştır. Mikroakiskan tarafından üretilen kararlı geçişlerini son derece öngörülebilir profilleri birden fazla kemotaksis deneyleri aynı anda yapılmasını sağlar. Bu çalışmada, biz aynı anda üç kemotaksis deneyleri (Şekil 2A ve Film 1) gözlemledi. Biz kemoatraktan kemoakraktan kuyuya enjekte edildikten sonra HL60 hücrelerinin hemen chemotaxing başladı bulundu ve degrade istikrar için simülasyon sonuçları ile tutarlı takip eden 60 dakika boyunca düz bir yolda chemotaxing tuttu. seyahat yolu ve morfolojisi izlemehücrelerin nicel ölçüm ve hücreleri (Şekil 2B) &#39;nin toplam yol uzunluğuna, hız, yönlülük ve yuvarlaklık içeren bir kemotaksis dizini kullanarak kemotaksis davranışlarının daha sonra karşılaştırılmasını sağlar. Toplam yol uzunluğu yolunun sentroidler birleştiren hat kesimlerinin uzunlukları toplamıdır. Hız zaman toplam yol uzunluğuna bölünmesiyle elde edilir. toplam yol uzunluğuna bölünmesiyle (Y yolun sonuna koordinatı eksi Y başından koordinatı): Directionality yukarı ölçülür ve olarak tanımlanır. Bu doğrudan yukarı doğru hareket eden bir nesne için 1.0 veriyor. Hücrenin yuvarlaklığı çevre belirli bir miktarının açıklıktan kadar etkin (yüzde olarak) bir ölçüsüdür. Bir daire herhangi bir çevre için en büyük alana sahip ve% 100 yuvarlaklık parametresi vardır. Düz bir çizgi hiçbir alanı kapsayan ve% 0 bir yuvarlaklık parametresi vardır. Seçilen kemotaksi parametreleri tarafından açıklandığı gibi kantitatif ölçülen kemotaksi davranışı göstermek(Şekil 2C). Bir spatiotemporally görebilir ve kontrol fMLP uyaran altında HL60 hücrelerinde PKD hücre içi lokalizasyonu izleme Deneysel bir sisteme floresan etiketli uygulamak için büyük bir teknik ilerleme ve kontrol kemoatraktan stimülasyon olduğunu. Tarihsel olarak, hücre yanıtı ve davranışlarını gözlemlemek için homojen (diğer adıyla üniforma) stimülasyon ya da degrade stimülasyon ya uyguladık. Ancak, &quot;kör&quot; uyarılması teşvik hücrelerine ulaştığı konusunda hiçbir zamanmekansal bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda biz uyaran görmüyorum, çünkü stimülasyon hücre yanıtının herhangi bir &quot;anormal&quot; gözlemlere şüphelidir. Daha önce bu floresan boya (Alexa594) göstermiştir kemoatraktan konsantrasyonu ve m arasında doğrusal bir ilişki kurmak için kemoatraktan ile uygulanabilirgerdiricileriyle floresan boya yoğunluğu 15. Yeşil floresan proteini (GFP), floresan boya (Alexa594) ve aktarılan ışık kırmızı emisyonu bir alıcı konfigürasyonu ile, yapışan hücreler, uyarıcı uygulanmasını ve uyarıcı hücre yanıtını izlemek mümkün (Şekil Şekil 3A). Protein kinaz D yönlendirilmiş hücre migrasyonu 9,17 temel rol oynayan serin / treonin kinazlar ailesidir. Buna karşılık eşit bir şekilde uygulanan fMLP (kırmızı) stimülasyon, HL60 hücrelerinin GFP etiketli protein kinaz D1 (yeşil) sağlam bir membran translokasyonu (Şekil 3B ve Film 2) aracılık ettiği. Bir fMLP gradyanı (kırmızı) (Şekil 4A) olarak, HL60 hücreleri aktif ön kenarı (Şekil 4B ve Film 3) için PKD1 işe. ileri ucun çıkıntı GFP hücre içi lokalizasyonu yakın bir karşılaştırma PKD1 (hücum kenarı arkasındaki lokalize olduğunu gösterirŞekil 4C). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre hareketlilik analiz cihazı 6 eşzamanlı kemotaksis deneyleri izin verir. (A) Şema 6 bağımsız kemotaksis deneyleri eşzamanlı izlenmesi için bir hücre hareketliliği analiz cihazı çip tasarımını göstermektedir. Kırmızı gösterileri oyuklara ilave kemoatraktan. Hücrelerin kuyulara HL60 hücrelerinin (B) Giriş kemoatraktan sürekli fMLP degrade kurmak için yayılır iken. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> HL60 hücreleri ile çoklu kemotaksis deneyleri Şekil 2. Eşzamanlı izleme. (A </strong&gt;) Montaj hücre hareketliliği analiz cihazı kemotaksis testinde görüntüleri PKD özgü 0 zamanlarda kemotaksi üzerinde inhibitörleri ve degrade uygulamadan sonra 12 dakika inhibitör etkilerini incelemek gösterir. Kemotaktik HL60 hücrelerinin 30 dakika boyunca PKD önleyicisi 1 uM CID755673 ile ön muamele edilmiştir. veya PKD inhibitörünün tedavi olmadan HL60 hücrelerinin RPMI1640 açlıktan ortamı ya da 12 dakika süre ile, 100 nM fMLP gradyanları ya chemotax bırakılmıştır. (B) Şema takip HL60 hücrelerinin gezi yol uzunluğu ve şekil gösterir. Toplam yol uzunluğu, hız, yönlülük ve yuvarlaklık olarak kemotaksis (C) miktarının belirlenmesi. SD gösterilen ortalama ±; n = CID755673 tedavi ile hiçbir gradyan, fMLP degrade CID755673 tedavi olmadan ve fMLP tedavisi için 10, 12 ya da 11, sırasıyla. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. muntazam uygulanan fMLP uyarıcıya tepki olarak PKD1 sağlam membran translokasyonu GPCR aracılı (A). PKD1-GFP (yeşil) çok kanallı izleme, kemoatraktan (1 uM fMLP 0.1 ug ile karıştırılır / ml fluoresan boya Alexa 594, kırmızı) ve DIC (diferansiyel-interferans-kontrast) RPMI 1640 ortamında% 0.2 jelatin ile kaplanmış bir 4well bölmesinin bir kuyuda yapışan HL60 hücreleri tanımlamak için. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (B) Montaj eşit uygulamalı fMLP (kırmızı) PKD1-GFP (yeşil) sağlam membran translokasyonu uyardığını göstermektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> FigürHL60 hücreleri chemotaxing içinde PKD1 e 4. Öncü kenar yerelleştirme. (A) Kanal modu toplama yapılandırma fMLP degrade görselleştirme ve PKD1 uzaysal dinamiklerini kolaylaştırır. A - C, HL60 hücreleri geçici GFP etiketli PKD1 ifade; Mikropipet (DIC), 100 nM fMLP (Kırmızı) elde fMLP gradyanı görselleştirmek için 0.1 ug / ml fluoresan boya Alexa 594 (B) &#39;chemotaxing hücresi ön kenarında PKD1 zenginleştirilmiştir lokalizasyonu ile karıştırıldı. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (C) birleştirilmiş ve görüntüler PKD1 HL60 hücrelerinde ileri ucun arka lokalize olduğunu göstermektedir. Yeşil PKD1 hücresel yerleşimi gösterir ve DIC görüntü ön kenarı çıkıntılı alanı gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

imaging-g-protein-coupled-receptor-mediated-chemotaxis-its-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Görüntüleme.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. 

Video: Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Biyomühendislik

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biyoloji

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Farklı Sinyal Yollarının Tizlenmesi için Nötrofil Fonksiyonel Tahliller

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration, phagocytosis, degranulation of cytotoxic enzymes and metabolites, and release of DNA as neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system. As fresh neutrophils are terminally differentiated, short-lived, and highly variable among individuals, it is important to make the most of the collected samples. Researchers often need to perform screening assays to assess an overview of the many neutrophil functions that may be affected by specific conditions under evaluation. A set of tests following a single isolation process of normal density neutrophils was developed to address this need, seeking a balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy. The results can be used to reason and guide in-depth follow-up studies. This procedure can be carried out in an average time of 4 h and includes the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of yeast on glass slides, leaving enough cells for more detailed approaches like omics studies. Moreover, the procedure includes a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs after fast panoptic staining observed by light microscopy, with a lack of specific markers, albeit enough to indicate if further efforts in that way would be worthwhile. The diversity of functions tested combines common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The procedure was named NeutroFun Screen, and although having&#160;limitations, it balances the aforementioned factors. Furthermore, the aim of this work is not a definite test set, but rather a guideline that can easily be adjusted to each lab&#39;s resources and demands.

Yazar Spotlight: NeutroFun Ekran Protokolü ile Nötrofil Fonksiyon Değerlendirmesinde Hız, Maliyet ve Doğruluğun Dengelenmesi 

This protocol features a set of neutrophil functional assays to be used as a screening method to cover functions from different signaling pathways. The protocol includes an initial and simple evaluation of cell viability, purity, reactive oxygen species production, real-time migration, phagocytosis, and a preliminary suggestion of neutrophil extracellular traps.

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme₄ Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği