This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Tüm işlemler İtalyan yasalarına göre idi. Murin AF örnekleri GFP adı C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J fareleri 13.5 gün sonra coitum (DPC) gebe farelerin hasat edilmiştir. 1. Transpozon Üretimi Not: Transposon sentezleme vektörleri standart klonlama prosedürleri kullanılarak elde edilmiştir. Fare AF hücreleri transfeksiyon için plazmid DNA, ticari kitler kullanılarak hazırlandı. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DH5α bakteri 50 ul plasmid DNA, 10 ng karıştırın. 20 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü inkübe edin. </li><li> 40 sn için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) lizojeni etsuyu (LB) suyu 250 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de (300 rpm) çalkalayın. </li><li> 0.1 mg / ml ampisilin ile LB levhaları üzerine her dönüşüm için 30 ul yayıldı. Plakalar kuru ve 37 ° C ov de ters inkübe izinernight. </li><li> Ertesi gün, öğleden sonra, her dönüşümden, steril 200 ul ipuçlarını kullanarak, 3 koloniler almak ve 0.1 mg / ml LB amp üzerine aktarın. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de (300 rpm) bakteri çalkalayın. </li><li> Plazmid Saflaştırma için, ticari kitler kullanın. -20 ° C&#39;de Hazır plazmid. </li></ol> 2. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) Kültür <ol><li> % 0.1 jelatin ile 6 oyuklu plakaların kaplanması <ol><li> Altı gözeneğin her steril% 0.1 jelatin 1 ml ilave başlık altında Coat plakalar. jelatin 1 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C) polimerize olsun. </li><li> aşırı atın ve 1 saat süre ile plakaları kurutunuz. </li><li> oda sıcaklığında saklamak plakaları mühür ve parafilm kullanın. </li></ol></li><li> Mitomisin C ile MEF inaktivasyonu <ol><li> 37 ° C banyo kullanılarak 4 x 10 6 MEF hücreleri şişe çözülme. </li><li> MEF ortamı ile bir Petri kabı (150 mm) başlık MEF tohumu. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li><li> (DİKKAT) hücreler konfluent mitomisin C (5 mg / ml) ekleyin. </li><li> Bir inkübatör içine yerleştirin hücreleri (37 ° C ve% 5 CO2) 3 saat karıştırıldı. </li><li> mitomisin C yıkama hücreleri ile 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez orta çıkarın. </li><li> 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine ticari tripsin ve yeri hücre 2 ml ilave edilir. Sonra, tripsin reaksiyonu durdurmak için kesme aracının 18 ilave edin. </li><li> üreticinin protokolüne göre bir Bürker odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 5 dakika boyunca 145 x g&#39;de santrifüje hücreleri. süpernatant atın. </li><li> Tohum 60.000 hücre /% 0.1 jelatin kaplı plakalar üzerinde inaktive EMB cm2. </li><li> AF ve / veya iPS AF hücreleri tohumlamadan önce 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li></ol></li></ol> 3. Fare AF Hücre İzolasyonu <ol><li> zamanlanmış çiftleşmesi kurmak ve vajinal PLU kontroleş yuva 24 saat sonra GS. </li><li> 13.5 DPC kadar gözlemleyin ve servikal dislokasyon yoluyla hamile baraj kurban. </li><li> % 70 etanol kullanılarak hayvanın karın duvarı temizleyin. </li><li> makas kullanarak, karın boşluğuna erişebilmek için karın duvarının uzunluğu incising orta hat laparotomi gerçekleştirin. </li><li> forseps kullanarak rahim Açığa. 1x PBS buz üzerine yerleştirildi steril dolu bir 100 mm Petri kabı içine makas ve transfer kullanarak rahim kaldırmak. </li><li> 10X büyütmede AF toplamak için Stereomikroskopta kullanın. </li><li> forseps ile rahim tutun ve makas ile rahim duvarına çıkarın. Fetal membranlar ve buna bağlı olarak amniotik sıvı sızıntısını önlemek için dikkatli olun. </li><li> Steril 1X PBS ile doldurulmuş bir 100 mm Petri kabı içine fetusu toplayın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Temiz bir 100 mm Petri kabı ince bir nokta forseps ve yer ile bir fetus plasenta kavrayın. </li><li> ince nokta forseps kullanarak kesesi sarısı çıkarın. </li><li&gt; ince nokta forseps kullanarak amniyon Disrupt ve 15 ml konik şişe içine bir insülin şırınga kullanarak her bir fetus için AF 30 ul toplamak. </li><li> AF toplandıktan sonra,% 1 fetal inek serumu (FBS) ile takviye edilmiş, steril 1 x PBS ile her fetus yıkayın ve 15 ml AF içeren konik tüp toplar. </li><li> 5 dakika boyunca 145 xg&#39;de Santrifüj AF. kaputun altında Süpernatantı ve pelet AF hücreleri tohum. </li></ol> 4. Fare AF Hücre Kültürü <ol><li> Fare AF Hücrelerinin tohumlama <ol><li> Bir gün önce, ekim için, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması. </li><li> AF toplandıktan sonra, AF kültür ortamı kullanılarak (yaklaşık 1 x 10 7 hücre 6 fetusa elde edilen) mitotik inaktive MEF üzerine bir amniyosentez elde edilen hücreler tohum. </li><li> Her gün ortam değiştirilerek, 37 ° C ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin. </li><li> 7 günlük bir kültürden, trans sonraAşağıda tarif edilen prosedür takip fect AF hücreleri. </li></ol></li></ol> 5. Transfeksiyon iPS-AF Hücre Üretimi ve Kültür Not: Fare AF hücreleri (PB-CAG-rtTA) transpozon plazmid transposaz sentezleme plasmidi (mPBase) ile birlikte ters tetrasiklin transaktivatör ile, PB-tetO2-IRES-OKMS transpozon plasmidi ile transfekte edilmiştir. Bütün plasmidler Profesör Andras Nagy 33 tarafından temin edilmiştir. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde: (2 ug toplam DNA), 0.5 mPBase ug ve 0.5 PB-CAG-rtTA ug PB-tetO2-IRES-OKMS 1 ug karıştırın. </li><li> serumsuz ortam ile 100 uL (- DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) DNA seyreltilir. </li><li> (Plazmid DNA oranında 8 uL transfeksiyon ajanı 2 ug (DNA) transfeksiyon maddesi) (örneğin, Fugene) transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden DNA&#39;ya. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı inkübe edin. </li><li> / Oyuk 2 mL&#39;lik bir son hacme sahip fare AF hücreleri, 6 gözlü bir levhaya oyuk başına transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı, 100 uL damla damla eklenir ve yavaşça döndürülerek dağıtın. 24 saat boyunca bekletin. </li><li> Ertesi gün, doksisiklin 1.5 ug / mL (her bir oyuk için ortam, 2 mL) ile desteklenmiş taze iPS AF ortamı hücreleri beslenmesiyle Yamanaka en faktörleri (Oct4, Klf4 Myc&#39;nin, Sox2) ekspresyonunu indükler. </li><li> Taze Ortodoks içeren ortam (nokta 5.13 kadar doksisiklin ile desteklenmiş medya hücreleri korumak) ile, geçit olmadan, her gün hücreleri beslemek. </li><li> MCherry ifade 24 saat içinde ve günlük koloni oluşumu (koloniler tipik transfeksiyon sonra 20 ile 30 gün arasında görünür) hücreleri gözlemleyin. </li><li> Bir gün kolonisi seçmek önce, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile 96 oyuklu bir doku kültür plakası hazırlanır. </li><li> hacim usin 50 uL tek koloniler seçinga 200 uL pipetle ve tek tek oyuklara bir 96-çukurlu plaka sırayla transfer edin. </li><li> Sonraki gün, ticari bir tripsin 50 ul ekleyerek tek hücre içine her koloni ayırmak ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> koloni parçalara ayırma aşağı yukarı pipet ve. </li><li> doksisiklin ile desteklenmiş taze iPS AF ortamın 100 uL dolu 96 oyuklu bir plaka kaplama% 0.1 jelatin ile etkisizleştirilmiş MEF ile yeni bir kuyuya ayrışmış koloniyi içeren tripsin başına 50 uL. </li><li> Hücreler 60-70% konfluansa ulaştığında, 24 oyuklu plaka iyi ayrıldı. </li><li> koloniler doksisiklin olmadan durumda da görünüp görünmediğini doğrulamak için iki kuyu, doksisiklin olmadan doksisiklin ile diğeri, 2: Hücreler% 60-70 izdiham ulaştığınızda, 1 ayrıldı. </li><li> IPS-AF ortamında inaktive MEF üzerinde, doksisiklin bağımsız iPS-AF klonlar, korumaya devam ediyor. </li><li> CH, 37 ° C ve% 5 CO2, hücreleri yetiştirmekgünlük orta Anging. </li></ol> 6. Alkalin Fosfataz Boyama <ol><li> doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğunda imalatçının protokolü takip alkalin fosfataz boyama gerçekleştirin. </li></ol> 7. İmmünofloresan <ol><li> Doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğu zaman, inaktive MEF ile 24 oyuklu plaka iyi 150.000 hücre / cm2, tohum ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde 48 saat süre ile hücre büyür. </li><li> (DİKKAT), oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) oyuk başına 300 ul ilave edilerek hücreler sabitleyin. </li><li> % 0.1 NP-40 permeabilize hücrelerin 300 ul ekle. </li><li> % 0.1, PBS-Tween 20 300 ul hücreleri durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici tampon (1 x PBS içinde% 10 at serumu) 300 ul ekle. </li><li> (1:10 Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog: Aşağıdaki primer antikorlar kullanın0) ve SSEA1 (1:80). % 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu ile SSEA1 seyreltilir, 0.3 M glisin,% 0.1 PBS-Tween-20. 1 x PBS içinde% 10 at serumu ile diğer tüm antikorlar seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece antikorlar inkübe edin. </li><li> % 0.1 PBS-Tween-20 300 ul ile durulayın. </li><li> 1 x PBS içinde% 10 at serumu içinde seyreltilmiş sekonder antikor kullanarak: Alexa594 konjüge edilmiş keçi anti-fare IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş tavuk anti-keçi IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş, tavuk anti-tavşan IgG (1: 200), Alexa568-konjuge keçi anti-fare IgM (1: 200). Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile durulayın. </li><li> 1x PBS: Hoechst çözeltisi (10.000 1) ile Leke çekirdekleri. </li></ol> Vitro Hücre Farklılaşma 8. <ol><li> asılı damla embriyoid organları (EBS) oluşturmak için, farklılaşma ortamı kullanılarak, Petri kapağı üzerine (2.000 hücre / 20 ul) tek damla yetiştirmek. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin yemekler4 gün boyunca% 5 CO2. </li><li> farklılaşma ortamında 3 gün süspansiyon kültüründe 100 mm bakteriyel dereceli tabaklara EBS aktarın. </li><li> Başka bir 14 gün boyunca (DMEM içinde 1:10 oranında seyreltilmiş) bazal membran matris ile kaplanmış 24 oyuklu plakalarda ve plaka EBS. </li><li> T (1: 100), αfp (1: 200) ile Tubb3 (1: 500) 37 immünofloresan analiz için, birincil antikorlar kullanır. </li></ol> 9. Vivo teratom oluşumu <ol><li> / - - Γc - / - farelerde Rag2 ve hindlimb kas içine 1 x 10 6 iPS-AF hücreleri içeren 1x PBS 100 ul enjekte edilir. </li><li> 6 hafta Hücre enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon ile fareler kurban. </li><li> Aşağıdaki analizler için farelerin hindlimb itibaren, kendi boyutuna göre ayırt tümör kitleleri, çıkarın. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak izopentan dondurulmuş tümör 7-10 mikron kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> Hematoksilen And Eozin (HE) Leke: <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, tümör dokusu yapısını değerlendirmek, HE ile leke. </li></ol></li><li> Immunoperoksidaz Leke için: <ol><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile teratom bölümleri sabitleyin. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li></ol></li><li> Aşağıdaki antikorlar ile inkübe: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ile αSMA (1: 100), 1 x PBS içinde% 1 BSA içinde seyreltilmiştir. 1 (Tubb3 için), 37 ° C de saat ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de (diğer antikorlar için) inkübe edin. </li><li> 20 dakika% 100 metanol kullanılarak blok peroksidaz. </li><li> 37 ° C&#39;de 45 dakika süreyle inkübe HRP ile konjüge edilmiş (1: 150), ikincil antikor anti-fare. </li><li> 1x PBS ile durulayın. </li><li> 5 dakika boyunca peroksidaz (HRP) alt-tabaka (Malzeme Tablosu) kuluçkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca musluk suyu ile durulayın. </li><li> 9 saniye Hematoksilen QS ile Leke. </li><li> musluk suyuyla durulayın. </li></ol&gt; Hücreler 10. RNA Ekstraksiyonu <ol><li> İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanarak. </li></ol> Teratom 11. RNA Ekstraksiyon <ol><li> örnek çözdürme önlemek için bir havan ve sıvı azot kullanılarak teratom homojenize edilir. </li><li> Dokunun 25 mg tartılır. </li><li> RNA ekstraksiyonu için ticari reaktif 1 mL kloroform 200 uL ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 13.000 x g&#39;de santrifüj ve 15 dakika boyunca 4 ° C. </li><li> yeni bir tüpe süpernatant aktarın. </li><li> RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanmak saflaştırmak için. </li></ol> 12. Ters Transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu Analizi <ol><li> Ters transkripsiyon (RT) -polymerase zincir reaksiyonu (PCR) ve oligo (dT) edi bir ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal cDNA sentezlemeüreticinin protokolüne Ding, 50 ng / cDNA uL elde edildi. 10 ng / ml arasında bir konsantrasyonda RNaz içermeyen su ile cDNA seyreltilir. </li><li> RT-PCR 1 ng kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak DNA polimeraz kullanılarak gerçekleştirmek / cDNA uL. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

pluripotensin indüksiyon elde etmek için seçilen yöntem, uzun vadeli transplantasyonu ile ilgili hücre, klinik güvenliği için geçerlidir. Günümüzde, yeniden programlama için uygun çeşitli yöntemler vardır. Bütünleştirici olmayan yöntemler arasında, Sendai viral (SeV) vektörü bulaşmış hücreler 40 çekirdeği içine entegre olmayan proteinin büyük miktarlarda üretmek ve iPS hücreleri elde etmek için bir strateji olabilir bir RNA virüsüdür. SeV vektörleri ötelem...

Prenatal tanı genetik hastalıkların (örneğin kromozomal anormallikler, monogenetik veya çok faktörlü / polijenetik hastalıklar) ve konjenital anomali (yani konjenital diyafragma hernisi, kistik akciğer lezyonları, ekzomfalos, Gastroşizis) değerlendirmek için önemli bir klinik araçtır. Amniyotik sıvı (AF) hücreleri gebeliğin ikinci üç aylık döneminde rutin planlanan prosedürlerden elde etmek kolay (yani amniyosentez ve amniyoredüksiyon yapıldığında) ya da sezaryen bölümler 1, 2. Prenatal veya neonatal hastalarda AF hücrelerinin mevcudiyeti rejeneratif tıp için bu kaynak kullanma imkanı sağlar, ve birkaç araştırmacı AF 3, 4, 5, 6 izole bir kök hücre popülasyonu kullanarak farklı doku hasarları veya hastalıkları tedavi imkanı araştırıldı, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Kolayca Hastalık genellikle hareketsiz olduğu bir zaman penceresinde, hastalıklı hastaların AF hücreleri elde etme ihtimali, yeniden programlama amacıyla bu hücre kaynağı kullanma düşüncesine yol açar. Gerçekten de, AF hücrelerinden türetilen uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücreleri doğum öncesi uygun bir hastaya özgü tedavi hazırlamak amacıyla, in vitro ilaç testleri için veya doku mühendisliği yaklaşımlar ilgi hücrelerinde ayırt edilebilir. Birçok çalışma, daha önce AF hücrelerinin yeteneği hücre tipleri 13, 14, 15, 16, 17 &lt;geniş bir aralığı içine yeniden programlanması ve ayırt edilmesi göstermiştir/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Dört transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Myc&#39;nin ve Klf4) zorla ifade ile Takahashi ve reprogrammed somatik hücre Yamanaka 28 ile keşfinden bu yana, ilerleme yeniden programlama alanında yapılmıştır. farklı yöntemler göz önüne alındığında, biz viral ve viral olmayan yaklaşımlar ayırt edebilirsiniz. İlk kısmen yeniden programlanan hücre hattının sonucu ve risk hem de yüksek verim ama retroviral transgen genellikle eksik susturulması, sahip viral vektörler (retrovirüsler ve lentiviruses), kullanımını bekliyoraraya sokma mutajenez 29, 30, 31. Yani plazmidler, vektörler, mRNA, protein, transpozonlar: viral olmayan yöntem farklı stratejiler kullanır. Transgenik dizilerin ücretsiz iPS hücrelerinin türetilmesi sızdıran transgen ifade ve girmeyle mutagenez potansiyel zararlı etkileri engelleyecek amaçlamaktadır. Yukarıda açıklanan tüm viral olmayan stratejiler arasında, piggyBac (PB) transpozon / transposase sistemi ekleme veya eksizyon olayları 32 katalize bir transgen ve transposase enzimin geçici ifadesini yan sadece ters terminali tekrarlar gerektirir. iPS hücresi üretimi için diğer yöntemlere göre transpozonlar kullanılarak avantajı retroviral vektörler aynı etkinliğini gösteren bir viral olmayan vektör yaklaşımla vektörü içermeyen iPS hücrelerini elde etme imkanı vardır. Bu reprogr için entegre transposon kodlama iz az eksizyon ile mümkündüriPS hücrelerinin 33 transpozazın yeni, geçici ifade, aşağıdaki faktörler amming. PB farklı hücre tipleri, 34, 35, 36, 37 etkili olduğu göz önüne alındığında, viral vektörler ile ilgili klinik yaklaşımın için daha uygundur, ve ksenobiyotik kullanarak mevcut virüs üretim protokolleri aksine kseno içermeyen iPS hücrelerinin üretimi sağlar Koşullar, bu sistem, kemirgen AF iPS hücreleri elde etmek için kullanılır. Burada fare AF hücrelerinin (iPS-AF hücreleri) 38 dan pluripotent iPS klonların üretimini göstermek için zaten yayınlanmış çalışmaları takip ayrıntılı bir protokol öneriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21043</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21468</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21442</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11005</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85L1</td>
			<td>Alkaline Phosphatase&#160; staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>For bacterial selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DH5&#945; cells</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">18265-017</td>
			<td rowspan="2">Bacteria for cloning procedure</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965039</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>For exogenous factors expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)&#160;</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>72.706</td>
			<td>For PB production&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10439024</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>For MEF medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
			<td>AF isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>131</td>
			<td>Used 0.1%, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin QS</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H3404</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE&#160;</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-061010</td>
			<td>Histological analysis of teratoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc2005</td>
			<td>Secondary antibody (immunoperoxidase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT NovaRED&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4805</td>
			<td>Peroxidase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with needle (25G)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01H25161</td>
			<td>Amniocentesis procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klf4&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-20691</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>For bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td>For mouse AF and iPS-AF cells medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354234</td>
			<td>For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>Peroxidase blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 24 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog&#160;</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0002P-F</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S2000</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12087-87-0</td>
			<td>For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Oct4</td>
			<td rowspan="2">SantaCruz</td>
			<td rowspan="2">sc-5279</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG2b</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244</td>
			<td>PFA, fixative, diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150mm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF culture, tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac transposase expression plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>mPBase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>rtTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-17320</td>
			<td>Goat polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16285</td>
			<td>Mouse monoclonal IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Cell culture passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-047</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TRIzol Reagent</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">15596-026</td>
			<td rowspan="2">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tubb3&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Promega&#160;</td>
			<td rowspan="2">G712A</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;fp&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Mouse Monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">&#945;SMA&#160;</td>
			<td rowspan="2">Abcam</td>
			<td rowspan="2">ab7817</td>
			<td rowspan="2">Mouse Monoclonal IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (FuGENE HD)</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>E2311</td>
			<td>For AF cells transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM2645</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>70.760012</td>
			<td>To pick bacteria colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11 stainless 25U</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td>To clean the abdominal wall of the pregnant dam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture petri dish (150 mm)&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287-2MG</td>
			<td>For MEF inactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 96 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353071</td>
			<td>For iPS-AF culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the production of pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells using a transposon system

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

reprogramming kapasitesini değerlendirmek, fare AF hücreleri GFP farelerin fetusa toplanmıştır. Hücreler PB- (a doksisiklin indüklenebilir bir şekilde MCherry fluoresan proteine ​​bağlanmış Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2 Myc&#39;nin ve Klf4) ifade dairesel transpozon plazmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfekte ve tetrasiklin transaktivatör tersine edildi CAG-rtTA) transposaz ifade plazmidi (mPBase) ile birlikte plazmidler. Fare AF hücreleri MEF besleyici tabakası üzerinde...

Watch this Scientific Journal Video about The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System at JoVE.com

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Görüntüleme.  Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza. In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. 

Video: The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Gelişim Biyolojisi

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...