Nöral krest hücreleri, embriyolardaki kraniyal nöral kıvrımlardan veya kültüre yerleştirildiğinde göç eder. Bu, hücre ayrışması olmadan birincil göçmen nöral krest hücrelerini izole etmek için uygun bir yöntem sağlar. Nöral krest göçü tipik olarak üç boyutlu embriyonik ortamda meydana gelirken, iki boyutlu kültür, göçle ilgili süreçlerin görselleştirilmesini ve araştırılmasını sağlar.
Kraniyal nöral kıvrım kültürü protokolleri mevcut olmasına rağmen, bu yöntem eğitim ve organizmaya özgü adımlar gerektirir. Bu video, civciv kraniyal nöral kıvrım kültürlerinin tekrarlanabilir hazırlanmasını kolaylaştırma tekniklerini göstermektedir. Yeni başlayanlar genellikle nöral kıvrımları parçalara ayırmak ve kaplamak ve kültür sonuçlarını değerlendirmek için mücadele ederler.
Diseksiyon kılavuzlarını takip etmek ve burada açıklanan morfometrik analizi uygulamak tutarlı, nicel sonuçların elde edilmesini sağlar. Başlamak için, döllenmiş yumurtaları nemlendirilmiş bir inkübatörün içine 38 santigrat derecede dik bir konuma getirin. Yumurtaları inkübatörden çıkardıktan sonra,% 70 etanol püskürterek ve kurumasını sağlayarak kabukları dezenfekte edin.
Kültürleri sabitlemek ve boyamak için, çok kuyulu bir doku kültürü kabına yerleştirilmiş cam kapak fişleri ve kuyunun tabanını örtmek için yeterli fibronektin çözeltisi pipet kullanın. Daha sonra, kapağı değiştirin ve nöral kıvrımları parçalara ayırırken plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde en az bir saat boyunca 38 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Yumurta uzunluğunun 1/4 ila 1/3'ünde kabukta küçük bir delik açmak için künt forseps kullanın.
Künt forsepsleri dikkatlice küçük deliğe yerleştirin ve yumurta sarısını bozmadığınızdan emin olun. Daha sonra, yumurta kabuğunu yumurtanın etrafından kesin, yumurta kabuğunun üstünü çıkarın ve embriyoyu izolasyon için konumlandırın. Embriyoyu, yumurta sarısının embriyoyu kaplayan yüzeyindeki fazla albümini silmek için kapalı künt forsepslerin düz kenarını nazikçe kullanarak hazırlayın.
Embriyonun üzerine, embriyo çerçevenin penceresinde olacak şekilde bir filtre kağıdı destek çerçevesi yerleştirmek için forseps kullanın. Yumurta sarısına yapışmak için filtre kağıdına hafifçe bastırın. Filtre kağıdı çerçevesinin dışını diseksiyon makası ile kesin.
Çerçevenin kenarını kavramak için forseps veya makas uçları kullanın ve embriyoyu yumurta sarısından yavaşça kaldırın. Embriyoyu, kağıt çerçeve tarafı aşağı bakacak şekilde, kalem strepli Ringer's ile doldurulmuş 60 veya 100 mililitrelik bir Petri kabına yerleştirin. RNA veya proteine duyarlı bir aşağı akış uygulaması için toplanırsa, embriyo kabını buz üzerinde tutun.
Bir embriyoyu Ringer'ın kalem strep çözeltisini içeren temiz bir kaba aktarın. Görüşü gizleyen yumurta sarısını temizlemek için embriyoyu nazikçe ileri geri sallayın ve Ringer'ın kalem strep çözeltisini değiştirin veya bulanıklaşırsa taze bir kaba aktarın. Embriyo sırtını ve çerçeve tarafını diseksiyon mikroskobu altında yukarı doğru yerleştirin.
Embriyoyu gerilmiş ve yerinde tutmak için kağıt çerçevenin üzerinde bırakın. Ardından, nöral kıvrımları açığa çıkarmak için forseps kullanarak vitelin zarını çıkarın. Genişleyen optik veziküllere doku kaudalini ve eşkenar dörtgen daralmalarının yeni ortaya çıkmaya başladığı arka beyne rostral ekleyin.
Yaylı makas kullanarak, orta beyin nöral kıvrımlarını dikkatlice tüketin. Nöral tüpün minimum kontaminasyonu ve nöral olmayan ektoderm ile nöral kıvrımın en dorsal yönünü eksize etmeye özen gösterin ve nöral kıvrımları, bir P20 pipetör veya sarılı Ringer'ın kalem strep çözeltisi ile durulanmış steril bir cam Pasteur pipet kullanarak Ringer'ın kalem strep çözeltisini içeren temiz bir kaba aktarın. Ek kıvrımları parçalara ayırırken toplanan kıvrımları buz üzerinde saklayın.
Kültür kabını inkübatörden çıkardıktan sonra, fibronektin çözeltisini kapak kaymalarından, tabaklardan veya kuyudan çıkarmak için bir pipettor veya Pasteur pipet kullanın. Fibronektin kaplı substratı Ringer'ın kalem strep çözeltisi ile duruladıktan sonra, tabağa veya kuyuya uygun miktarda tam kültür ortamı ekleyin. Plastiği bloke etmek ve dokunun yapışmasını önlemek için bir P20 veya P200 pipetleyici kullanın ve pipet ucunu sarılı Ringer'ın kalem strep çözeltisiyle durulayın.
Daha sonra, izole edilmiş nöral kıvrımları fibronektin kaplı kapak kaymasının merkezine doğru aktarın ve mümkün olduğunca az Ringer'ın kalem strep çözeltisini aktarmaya özen gösterin. Eksplantların 10 ila 15 dakika boyunca yerleşmesine izin verdikten sonra, kültür kabını kaplanmış nöral kıvrımlarla yavaşça ve dikkatlice taşıyarak 38 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Kültür ortamını bir Pasteur pipetle çıkarın ve kuyucukları filtre ile sterilize edilmiş PBS ile durulayın.
% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir platform çalkalayıcıda tutun. Kuluçkanın sonunda, paraformaldehiti çıkarın, kuyucukları PBS ile üç kez durulayın ve% 5 serum içeren PBST ekleyin. Şimdi, pipet 30 mikrolitre 200-nanomolar Oregon Green, her kapak kayması için pürüzsüz bir yüzeye falloidin konjuge etti.
Bir çift forseps kullanarak,% 5 serum içeren PBST'den kapak kaymasını çıkarın ve hücrelerin yukarı bakacak şekilde yönlendirilmesini sağlayın. Kapak kaymasının kenarına hassas bir görev sileceğine kısaca dokunarak fazla sıvıyı uzaklaştırın. Her bir kapak kayma hücresini, seyreltilmiş falloidin damlasının üzerine yavaşça yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçka döneminden sonra, kapak kaymasını boyama çözeltisinden kaldırın ve tekrar kültür kabına yerleştirin, hücre tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Kapak kaymasını PBST ile örttüğünüzden emin olun ve kapak fişlerini kapalı ve karanlıkta tutarak 10 dakika boyunca bir platform çalkalayıcıya yerleştirin. PBST'yi çıkarın ve toplam üç 10 dakikalık yıkama için kapak kaymalarını iki kez yıkamayı tekrarlayın.
Bir damla montaj ortamını mikroskop slaydına yerleştirin. Kabarcıklar oluşmasını önlemek için kapak kaymasını montaj ortamına bir açıyla yavaşça indirerek kapak kayma hücresini yan yana doğru yerleştirin ve görüntülemeden önce ortamın ayarlanmasına izin verin. Son olarak, lekeli hücreleri görüntüleyin ve bunları TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
Nöral krest hücreleri, inkübasyondan sonraki üç ila dört saat içinde yapışkan nöral kıvrım eksplantlarından çıkmaya başladı ve yaklaşık 20 saat sonra göç tamamlandı. Göçmen nöral krest hücreleri HNK-1 kullanılarak etiketlendi ve çoğu hücrenin HNK-1 pozitif olduğu ortaya çıktı. Göç eden nöral krest hücreleri, filamentli aktinin falloidin ile boyanmasıyla görselleştirildi.
Falloidin lekeli hücrelerin görüntüleri, hücrelerin beyaz bir arka planla siyah göründüğü bir eşik görüntüsü üretmek için ImageJ kullanılarak işlendi. Eşik görüntüsü analiz edildi ve kontrast çubuk grafiklerde veya keman grafiklerinde çeşitli ölçümler görüntülendi. Örneğin, analiz edilen 69 hücrenin ortalama alanı, 60.27 ila 2.664.53 mikrometre kare arasında değişen yaklaşık 802.11 mikrometre kareydi.
Dairesellik, hücrenin çıkıntısını yansıtır ve 0.101 ila 0.875 arasında değişir. Alt değerler uzatılmış bir şekli gösterirken, birinin değeri mükemmel bir daireyi gösterir. Çoğu hücre, keman arsasında en kolay görülen uzun bir şekil sergiledi.
Bu alandaki göçmen nöral krest hücreleri ortalama en boy oranı yaklaşık 2.13'tü ve birinin en boy oranı simetrik bir şekli gösteriyordu. Dikkatli eksizyon ve eksplant kaplama, başarılı kültürler için çok önemlidir. Nöral kıvrımların 10 ila 15 dakika boyunca kesilmiş tarafa çökmesine izin verin ve daha sonra yapışmayı teşvik etmek için yavaşça inkübatöre aktarın.
Bu tekniklerdeki varyasyonlar, kültürleme öncesi geçici genetik manipülasyonu ve inkübasyon sırasında hızlandırılmış görüntülemeyi içerir. Ek olarak, bu protokol omik düzeyinde analiz için premigrasyon ve migrasyon nöral krest hücre popülasyonlarının toplanmasına izin verir.
