Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi PJ bir hibe ile desteklenmiştir (BBSRC; ref hibe BB / K018442 / 1.).

1. Arabidopsis Bitkilerin Büyüme ve Stres Tedavisi <ol><li> 1 L iyondan arındırılmış su kadar MS temel tuz karışımı içinde 4.3 g, 10 g sakroz, 0.5 g 2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) eklenerek Murashige ve Skoog (MS) ortamı 1 L hazırlanmakta ve ayarlamak potasyum hidroksit ile pH&#39;ı 5.7&#39;ye (KOH). 120 ° C de 20 dakika süreyle phytoagar ve otoklav 6 g ekleyin. <ol><li> katılaşma önce, (- plaka başına 25 ml MS ortamı 20 ile çapı 9 cm, yükseklik 1.5 cm) yuvarlak Petri kapları içine orta dökün. Plakalar kapakları kapatmadan önce bir laminer akış kaputu 1 ~ için h kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> % 70 1 ml% 0.02 (h / h) Triton X-100 ihtiva eden ve sürekli, 5-10 dakika boyunca çalkalama (h / h) etanol ilave yüzey sterilizasyonu için 1.5 ml bir test tüpüne, Arabidopsis thaliana tohumları yerleştirin. 150 fidan - Her genotip / durum için, 10 Petri plakaları her taşıyan ~ 100 hazırlar. </li><li> Tohumlar yerleşmek kadar yaklaşık 10 saniye bekleyinDaha sonra tüpün alt ve pipetleme süpernatant atın. % 100 etanol 1 mL ekleyin ve 10 dakika için daha tüp çalkalayın. </li><li> tohumlar sterilize ederken laminer akış kaputu hazırlayın. , Örnek başına filtre kağıdı tek parça almak ekim kolaylaştırmak için ikiye katlayın ve kaputu% 100 etanol içinde ıslatın. tamamen kurur kadar bekleyin. daha hızlı bir şekilde,% 70 etanol daha buharlaştıkça yani% 100 etanol kullanılır edin. </li><li> İnce ucundan 1 ml pipet kesim ~ 5 mm kullanarak pipetleme filtre kağıdı üzerine tohum aktarın. 15 dk - onları yaklaşık 10 almalı, hangi kurumaya bırakın. </li><li> Her MS ortamı Petri plaka üzerine eşit 150 sterilize tohumları ve cerrahi bant ile her plaka mühür - ~ 100 Sow. </li><li> teşvik ve çimlenmesini senkronize 4 d - ters 2 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. Eski tohumlar 4 ° C&#39;de (bir hafta kadar) daha uzun kalmak gerekebilir. </li><li> bir bitki doku kültürü odasına plakaları aktarın ve baş yukarı bırakın.Uzun gün döngüsü altında 8 gün boyunca bitkiler büyümek (16 saat 100 ľmol · m - 2 · s - 1 ışık, 8 saat karanlık) 20 ° C&#39;de. </li><li> Bitkiler akış kaputu, 8 d eski stres tedavisi için, hafifçe stres içeren sıvı MS ortamında bir sterilize balona, etanol sterilize eldiven giyen elle onları kazıma, agar ortamı aktarabilirsiniz (örneğin 200 mM mannit). agar ortamı üzerinde taşıyan kaçının. steril folyo ile şişe ağzı kapatılır ve bitkiler hafifçe çalkalanarak (-100 rpm) ile orbital bir karıştırıcı üzerinde ek 2 gün boyunca adım 1.8 ile aynı koşullar altında büyümeye olanak sağlar. </li></ol> 2. in vitro transkripsiyon ile öncü proteinin yapma / yaptı Not: Bu protokol, şablon / preprotein olarak D öncüsü (pPsaD) kompleksi Arabidopsis fotosistem kullanımını varsaymaktadır, ancak yöntem diğerleri ile uyumludur. <ol&gt; <li> PBluescript II SK vektör (veya akış yukarı T7 promoteri ile benzer başka vektör) 13 çoklu klonlama bölgesinin (MCS) içerisine pPsaD kodlama dizisi (CDS) klonlama. DNA izolasyon kiti kullanılarak plazmid (pBSK-pPsaD) saflaştınlır ve DNA dizilimi yolu ile sekansının doğrulanması. NOT: Tüm bu adımlar, standart moleküler klonlama teknikleri kullanır. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre kullanılarak pBSK-pPsaD plazmit DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 ng / ml bir son konsantrasyona kadar plazmid seyreltilir. </li><li> şablon olarak seyreltildi plasmidi kullanılarak (35 çevrim için) 20 uL PCR çalışması. 2 ul 10 x polimeraz tamponu, 2 uL 2mM dNTP, 1 uL 5 mM M13 ileri primeri (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 uL 5 mM M13 ters primeri (5: aşağıdaki reaksiyon hazırlanması &#39;-CAG GAA ACA-3 ACC GCT ATG&#39;), 1 uL pBSK-pPsaD plazmid, 1 U Taq polimeraz ve damıtılmış su ile seyreltilir kadar toplam reaksiyon hacmi oluşturmak için20 uL. aşağıdaki gibi standart bir PCR programı kullanarak: 95 ° C, 5 dak; [95 ° C, 30 saniye 35 döngü; 56 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 30 saniye); ve 72 ° C, 5 dakika. </li><li> TAE tamponu (Tris-HCI, pH 7.6, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) içinde agaroz jeli cDNA doğru amplifikasyon kontrol ve ilgili ölçmek için (ağ / hac),% 1 üzerinde PCR ürünün 5 uL başlat standartlara bant göreli konsantrasyonunu onaylayın. diğer uygulamalar için -20 ° C &#39;de, ürünün geri kalan saklayın. </li><li> Aşağıdaki gibi PCR DNA ile uyumlu olan bir tavşan retikülosit lizat göre hücresiz transkripsiyon / translasyon sistemi kullanılarak 50 ml&#39;lik bir reaksiyon hazırlanması: 40 uL retikülosit lizatı transkripsiyon / translasyon sistemi, 2.5 uL radyo işaretli [35S] metionin, 11 uCi / ml (spesifik aktivite:&gt; 1000 Ci / mmol), 2.5 uL steril damıtılmış su ve 5 uL pPsaD PCR ürünü (100-800 ng). Dikkat: eldiven, laboratuvar giysi ve emniyet glas Wearses radyoaktif madde taşırken. Monitör ve çalışma yüzeyi ve araçlarını temizlemek. onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atık bertaraf edin. </li><li> 30 ° C su banyosu içinde 90 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. Buz üzerinde numunesinin ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme ardından standart sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine doğrulaması için bir test örneği olarak reaksiyon (aynı hacmi de aşama 5.7 için bir giriş kontrol olarak hizmet görebilir) 1 uL çıkarın. İyi bir sonuç pPsaD (~ 23 kD) molekül ağırlığına karşılık gelen bir tat ve güçlü bant gözlem ile gösterilir. diğer uygulamalar için, -80 ° C&#39;de reaksiyon kalan saklayın. </li></ol> 3. Kloroplast İzolasyon <ol><li> Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: <ol><li> 0.6 M sorbitol, 10 mM magnezyum klorür: Kloroplast izolasyon tamponunda (CIB, 2x) hazırlanması(MgCI2), 10 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 20 mM sodyum bikarbonat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) ; KOH ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. 2x CIB 2 L hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C&#39;de. damıtılmış su ile 1;: 1x CIB ettirmek için, 2x CIB 1 seyreltin Bu kloroplast yalıtım deney gününde taze olarak hazırlanabilir. </li><li> HEPES-MgSO 4 sorbit tamponu (HMS, 1 x) hazırlanması: 50 mM HEPES, 3 mM magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), 0.3 M sorbitol; Sodyum hidroksit (NaOH) ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. , 400 mL kadar tamponu hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C&#39;de. </li></ol></li><li> soğuk oda veya buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri yürütün. st önce çözümler, gereç, ekipman ve rotor tüm ön soğutmaArting. </li><li> 13 mL Percoll, 13 mL 2x CIB tamponu ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde 5 mg glutatyon karıştırılması ve 4 ° C&#39;de 30 dakika (fren kapalı) için 43,000 x g&#39;de karışım santrifüj ile sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Santrifüj işleminden sonra, degrade rahatsız etmemek ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutmak için dikkatle tüp kolu. </li><li> 1 L&#39;lik bir behere genotip / durum başına 1 x CIB 100 mL aktarın. <ol><li> bir elek içine devrilme sıvı ortamdan fidan kaldırmak ve başka CIB içeren beher içine aktarabilirsiniz; Daha sonra, taze CIB 100 mL ile değiştirmeden önce herhangi bir kalıntı sıvı ortam kaldırmak için CIB ile doku durulayın. </li></ol></li><li> homojenizasyon için, 50 ml beher düzenlenen taze CIB 20 mL kullanarak yuvarlak homojenizasyon beş ardışık tur, her numune başına 100 mL 1x CIB toplam kullanın. <ol><li> homojenizasyon ilk turu için, izin elle 50 ml beher içine bitki doku transferiBir önceki tutma tampon parmaklarının arasından boşaltmak için. ilk turda dokusunun en kullanmaya çalışın, ama tamponu ile batırılır emin olun; Bu mümkün değilse, ikinci turda kalan kullanılmamış dokuyu tanıtmak. </li></ol></li><li> doku içine doku homojenleştirici duyargasını ve 1 iki darbeleri ile homojenize - 2 sn her. yumuşak bir sıkarak 250 mL&#39;lik santrifüj tüpü içine filtre bezi iki katmanı boyunca Homojenat filtre. süzüntü saklayın ve 50 ml beher geri doku aktarın. </li><li> homojenizasyon ilk turunda kullanılmayan kalan doku ekleyerek, 50 ml beher içine ikinci bir 20 mL CIB kısım yerleştirin ve homojenizasyon ve filtrasyon adımları tekrarlayın. Bu nedenle, tekrar CIB 100 ml (yani, 5 20 mL alikotları), ve elde edilen süzüntüler bir araya kullanıldıktan tüm kadar 3.5 ve 3.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 5 dakika (fren) için 1000 x g&#39;de toplanmış Homojenat ve kapalı dökünsüpernatant hemen pelet rahatsız etmemek için özen, santrifüj tamamlanmasını takiben. yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan kalıntı süpernatant pelletini. pipetle veya vorteks kuvvetlice tekrar süspansiyon yok. </li><li> Yavaşça alıcı borunun çeperi yoluyla uygulamak için bir Pasteur pipeti kullanılarak, önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanı üst kısmına Homojenat aktarın. degrade rahatsız etmemek. 4 ° C&#39;de 10 dakika (fren kapalı) için 7800 x g&#39;de bir sallanan kepçeli rotor santrifüjleyin. Alt bant sağlam kloroplast içerir ve üst bant kırık kloroplast içerir: İki yeşil bantlar santrifüj sonra degrade görülebilir: NOT. </li><li> pipetleme En bant atın, sonra gradyanı başına 8 mL&#39;lik bir hacmi koruyarak, yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne Pasteur pipeti ile alt bant aktarın. </li><li> t ~ 1x HMS 25 ml tüp içine tampon ekleyin ve iki kez tüp terso kloroplastlar gelen Percoll yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca (fren) için 1000 x g&#39;de sallanan kovalı rotor ve santrifüj içinde tekrar tüp yerleştirin. </li><li> Süpernatantı dökün ve dikkatlice yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan artık HMS kloroplast pelletini. (Pelet boyutu ve Bölüm 4&#39;te sayma dayanarak) gerekirse HMS 300 uL, ama çok fazla örneği sulandırmak için değil deneyin - ek bir 100 ekleyin. <ol><li> buz üzerinde kloroplast tutun. kloroplastlar, aşağı uygulamalar için kullanılır önce her zaman onları tekrar süspansiyon tüp sallayın. Her zaman kloroplast aktarmak için (büyütülmüş gözenek) ile bir kesim pipet kullanın. </li></ol></li></ol> Kloroplast Verim ve Bozulmamışlık 4. Analizi <ol><li> 1.5 ml tüp içinde 495 uL 1x HMS tamponuna izole kloroplastların 5 mcL ekleyin ve sonra 1 elde etmek için tersini tüp hafifçe karıştırın: 100 seyreltme. </li><li> Plahaemositometre sayma odasının üstüne bir kapak camı ce. Yavaşça pipet ~ 40 - kapak cam ve sayım odasına arasındaki boşluğa seyreltilmiş kloroplast süspansiyonu 60 ul. 10X veya 20X amacı ile bir faz-kontrast mikroskop kullanarak, bozulmamış kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünmesini ve ışık halesi ile çevrilidir. NOT: Mikroskop altında, 25 büyük meydanlar, sayma odasının merkezinde her biri 16 küçük kareler ile 1 mm 2 sayma alanı yoktur. </li><li> 10 büyük kareler kloroplastlar sayısını. çok az veya çok fazla kloroplast varsa, buna göre seyreltme faktörü (yukarıdaki adım 4.1) ayarlayabilir ve prosedürü tekrarlayın 10 ila 30 büyük kare başına kloroplastların sayısı ortalama gerekir. </li><li> aşağıdaki gibi mL (konsantrasyon) başına kloroplastların sayısını hesaplayın: n (Adım 4.3 hesaplanan büyük kare başına kloroplastların ortalama sayısı), büyük kareler 25 (toplam sayısını ×) 100 (seyreltme faktörü) x 25 kareler üzerinde hacmi 0.1 mm3 olduğu), 1 mL başına veri ifade 10 4 (ölçekleme faktörü ×. </li><li> Adım 3.12 &#39;de elde edilen kloroplast süspansiyon hacimce konsantrasyonu çarpılarak kloroplast gerçek verimini hesaplayın. Normal olarak, birden fazla 50 x 10 6 kloroplast elde edilebilir. </li></ol> 5. Kloroplast Protein İthalat <ol><li> Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: <ol><li> 10x HMS tamponu hazırlayın: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 ve 3.0 M sorbitol; NaOH ile pH&#39;ı 8.0&#39;a ayarlayın. uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;da, bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlanması ve kısa süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de. </li><li> 1x HMS tampon içinde çözünmüş 50 mM EDTA: İthalat durdurma tamponu hazırlayın. -20 ° C&#39;de bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlayın. </li><li> (60 w mM Tris-HCl, pH 6.8,% 10 (h / h) gliserol,% 2: 2x protein yükleme tamponu hazırlayın/ H) SDS,% 0.005 (ağ / hac) bromofenol mavisi. 4 ° C&#39;de 50 mL, ve mağaza sağlayın. Kullanımdan hemen önce, tampon 900 uL 1 M, 1,4-ditiyotreitol (DTT), 100 uL ilave edin. </li></ol></li><li> 3 zaman noktaları ile bir zaman ders çalıştırmak 3 tüpleri ithal durdurma tamponu 130 mcL kısım içeren her hazırlamak ve buz üzerinde bunları bırakın. (Genotip / durum başına) 2 ml tüp içinde 450 uL ithalat reaksiyonu hazırlayın. kullanımdan hemen önce tüm malzemeyi çözülme. <ol><li> Bir içe reaksiyonu için tipik bir uL hacim içinde 10 x 10 6 kloroplast kullanımı; Örneğin kloroplast konsantrasyonu 2.5 x 10 8 ug / ml 40 uL kloroplast süspansiyonu kullanmak faydalı olacaktır. Üç zaman noktaları 3 × A uL gerekir (yani, bizim örneğimizde 120 uL). </li><li> Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde reaksiyonlar bileşenleri karıştırmak: damıtılmış su (toplam hacim 600 uL yapmak için), B uL 10x HMS tamponu (B = [600-3 x A] / 10, yani, 48 bizim örneğimizde), 12 uL1 M glukonik asit (potasyum tuzu), 6 uL 1 M NaHCO 3, 6 uL% 20 BSA, 30 uL 100 mM adenozin 5&#39;-trifosfat, magnezyum tuzu (MgATP), 24 uL 250 mM metionin (a / h) (radyoaktif olmayan ) ve 30 uL protein öncüsünün. Hemen ithalat reaksiyonu başlamadan önce, 3 × kloroplast bir uL ekleyin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. </li></ol></li><li> 2 · s - 1 - ışık 100 umol · m altında bir su banyosu içinde 25 ° C &#39;de, reaksiyon tüpü inkübe edin. Bazen kloroplast tekrar süspansiyon tüpler hafifçe vurun. </li><li> Zamana karşı yapmak için, pPsaD için ~ 12 dakika (4, 8 ve 12 dakikalık zaman noktalarında uygun kadar olan içe doğrusal aralığı içinde gerekli zaman noktalarında reaksiyonundan 130 uL&#39;lik geri bu durumda). Lineer aralığı süresi farklı proteinler 14 değişebilir. Nedenle, t optimize etmek için daha önce her bir de ön test etmek için önerilmektedirO zaman puan. </li><li> Hemen geri çekilmesi üzerine, buz gibi soğuk ithal durdurma tamponu bir tüp her 130 uL kısım aktarmak tüp hafifçe dokunarak karıştırın ve zaman ders tamamlanana kadar buz üzerinde tüm tüpleri korumak. </li><li> Santrifüj bir mikrofüj içinde 12,000 x g &#39;de 30 saat boyunca tüm örnekler, pipetleme süpernatantlar atmak ve pelet tekrar vorteks yoluyla 15 ul 2x protein yükleme tamponu. </li><li> Tüm örnekler artı standart SDS-PAGE ve otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme 15 ile pPsaD giriş kontrolü (adım 2.7, her ithalat reaksiyonuna ilave miktarın% 10&#39;u kadar pPsaD eşdeğer içeren) analiz. Sonuçları ölçmek ve analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. içe verimliliği bir gösterge sağlamak için, farklı genotipler ithal protein miktarı / koşullar Her bir olgun bant ile bağlantılı radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#242;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses.">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants.">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li><li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis,+transport,+and+assembly+of+ribulose+1,5-bisphosphate+carboxylase+subunits.">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li><li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase.">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases.">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li><li>Flores-P&#233;rez, &. #. 2. 1. 8. ;., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts.">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import,+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins.">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors.">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor,+atToc33,+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency.">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li><li>Huang, W., Ling, Q., B&#233;dard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane.">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, (1989).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves.">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays.">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li><li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition,+have+unstable+photosystem+I+complexes,+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma.">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li><li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants.">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li><li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts.">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li><li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast.">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li><li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway.">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Biz son zamanlarda kloroplast protein ithalat aktif kloroplast fonksiyonu ve bitki yaşam 3 için kritik stres, ile kontrol edilebilir olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, bu tür düzenlemeyi izlemek için, biz stres koşulları altında yetiştirilen bitkilerin ithalat kapasitesinin değerlendirilmesini sağlamak için bizim kloroplast izolasyon ve in vitro ithalat tahlil prosedürleri güncellenmiştir. Sonuçlar kloroplast protein ithalat düzenlenmesinde SP1 için önemli bir rol gösterdi. Geleneksel in vitro ithalat deneyleri standart MS ağar ortamı 6,17,18 yetiştirilen bitkiler kullanın. Burada anlatılan sp1 mutant durumunda, bu tür geleneksel tahliller WT 3 protein ithalat göreli herhangi bir farklılık ortaya koymamıştır. Protein ithalat burada tarif edilen yöntemler (Şekil 1) kullanarak stres koşulları altında değerlendirilir Ancak, protein ithalat düzenlenmesinde SP1 rolü açıkça ortaya çıkar. o m ikenay doğrudan (yöntemler sırasıyla, sıvı kültüründe ve agar ortamı üzerinde yetiştirilen bitkiler istihdam gibi) geleneksel deneylerde elde edilenlerle stres koşulları testte ithalat verileri karşılaştırmak mümkün olmayabilir, stres ve non-stres koşulları arasındaki karşılaştırmalar yapılabilir şartıyla vardır bitkilerin hepsi ya da stres olmadan aynı sıvı kültür ortamında yetiştirilir. Agar ortamı üzerinde stres tedavisi ile karşılaştırıldığında, sıvı kültür içinde in vitro içe deneyleri için gereken bitkilerin çok sayıda tedavisi için daha uygundur. Ayrıca, kısa süreli stres tedaviler için özellikle önemlidir, tüm bitkiler için bir stres, düzgün uygulamayı kolaylaştırır. Burada sunulan yöntem manitol tedavisi ile osmotik stres çalışma uygulanmış, ama kolayca, diğer streslere geniş bir şekilde adapte edilebilir; örnek, kısa vadeli tuz stresi ve oksidatif stres, hangi karşılık gelen stres olabilir b içine benzer sıvı MS ortamı aracılığıyla başvurdu. gerilmelerin diğer türleri için, stres derecesi ilk optimize edilmiş öneririz; aşırı ağır tedaviler izole organellerin verim ve / veya ithal yeterlilik üzerinde olumsuz etkileri olabilir. aşağıda ayrıntılı olarak bir, özel dikkat protokol kapsamında birçok önemli adım vardır. üreticiye bağlı olarak - (ağırlık / hacim,% 0.9 0.6) MS ortamı için en uygun agar konsantrasyonu değişebilir. Bu nedenle, deneysel deneyler başlamadan önce konsantrasyonda agar optimize etmek önerilir. orta o hasat adım (adım 1.9) de dokuya yapışır ve böylece yumuşak olmamalı, ne o kadar zor bitkinin kök gelişimini önlediğini olmalıdır. sukroz konsantrasyonu da kullanılan bitkilere göre ayarlanabilir. (W / v) sakaroz bitkilerin daha iyi büyümesi yardımcı olabilir% 3 - özellikle de hasta mutantları ile çalışırken, MS ortamı 2 ile takviye edilmiştir. ne zaman uygulamastres tedavileri yalan, sıvı ortamda (örneğin,&gt; 14 gün eski) çok eski bitkilerin aktarmak iyi değildir. eski tesislerin daha gelişmiş kök daha kolay bir transfere sırasında zarar olmasıdır. buğday tohumu dayananlar ve tavşan retikülosit dayananlar: kopya / çeviri sistemine ilişkin olarak, 2 büyük sistemler bulunmaktadır. Bu kitler, örneğin linearize plazmid, unlinearized plazmidler, ya da PCR ürünleri gibi farklı şablonlar kullanabilir. kitleri, aynı zamanda, T3, T7 ve SP6 başlatıcısına özgüdür. Burada tavsiye kiti PCR ürünlerinin ve T7 promotörü ile birlikte kullanılmak üzere uygun olduğunu not edin. Ancak, bilinmeyen nedenlerle, bu sistem ile yapılan bazı radyoaktif işaretli preproteins ithalat deneyinde verimli işe yaramayabilir; Bu tür durumlarda, bir bir buğday tohumu özü sistemi veya plazmid şablonları içindir bir retikülosit lizat sistemi deneyebilirsiniz. Bir de transkripsiyon / çeviri yeniden sonucunu artırabilirÜreticinin el kitabında göre reaksiyon koşulları değiştirerek eylem. Bu sabah erken kloroplast izolasyon başlamak önemlidir (ya da erken büyüme odasında ışık döngüsü içinde) bozulmamış organellerin izolasyonu engelleyebilir nedeniyle fotosentez kloroplastların içinde nişasta birikimini önlemek amacıyla. kloroplast izolasyon prosedürü gereksiz gecikme olmadan hızlı bir şekilde yapılmalıdır ve izole kloroplastların her zaman soğuk tutulmalıdır. Bu yavaş yavaş iyi değil onların canlılığını kaybeder kloroplast izole gözlem karşı azaltmaktır. Yeni çözülmüş CIB veya HMS tampon kullanıyorsanız, homojen bir çözelti elde etmek Kullanmadan önce iyice tampon karıştırmak için emin olun. bitki malzemesinin homojenizasyonu için en uygun koşullar ampirik olarak kurulmuştur ve farklı doku homojenizer kullanıldığında değişebilir. Farklı bitki genotipleri simila içeriyorsar klorofil düzeyleri, klorofil miktar ithalat deneyleri yapmadan önce örnekleri normalleştirmek için alternatif bir yol olarak kullanılabilir. Klorofil% 80 izole edilmiş kloroplastlara bir numunenin ekstre aşağıdaki spektrofotometrik tespit edilebilir (h / h) sulu bir aseton 19,20. Bitkilerin ithalat oranları (örneğin, klorotik fenotipleri ile mutantlar) karşılaştırılmalıdır farklı klorofil içeriğini gösteren Ancak, ithalat tahlillerinde kloroplast örnekleri normalleştirmek sayma kloroplast numarasını kullanabilirsiniz. İyice adımda 3.11 kloroplast tekrar süspansiyon özellikle önemlidir. Yetersiz tabanda ithalat reaksiyonlarında doğru yükleme engel olacak böylece zor numaralar doğru saymaya yapacak kloroplastların, agrega terk edip olabilir. Şiddetli toplama mikroskop altında görüldüğü takdirde Aggregat kadar buz üzerinde kloroplast örnek sallayarak devam (örneğin, 10 kloroplast birlikte katıldı&gt; ile agrega)es kaldırılır. Tampon daha küçük bir hacimde kloroplast tekrar süspansiyon daha kolaydır. Protein ithalat reaksiyonları (Bölüm 5) nedeniyle radyoaktif doğanın uygun önlemler ile yapılmalıdır farkında olmak önemlidir. Gerekli önlemler şunlardır: izleme ve çalışma yüzeyi ve ekipman dekontaminasyon ve onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atıkların bertaraf, tek kullanımlık eldiven, laboratuvar giyim ve koruyucu gözlük takan. Ayrıca doğru ozmotik basınç ithalat reaksiyonları esnasında kloroplast sa¤laml korumak için kritik öneme sahiptir akılda tutmak ve bu esas HMS tampon tarafından yapılmaktadır. 10x HMS yapışkan olduğu için, ilk önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır ve daha sonra iyice karıştırıldı ve doğru hacim ölçümü sağlamak için bir kesim pipet kullanılarak uygulanmalıdır. içe reaksiyonunda soğuk metionin olmayan chloropl halinde serbest radyo-etiketli metionin dahil edilmesini önlemek için ilave edilirinkübasyon aşaması esnasında organel çeviri yoluyla ast proteinler, BSA proteazlar için bir alt-tabaka olarak işlev görerek, proteolizi en aza için kullanılır ise.

Kloroplastlar bitkilerin yeşil dokularda mevcut oldukça bol organelleri. Onlar fotosentez kritik rol, şeker karbondioksit dönüştürmek ve böylece yeryüzünde 1 neredeyse tüm yaşamı desteklemek için ışık enerjisini kullanan bir işlem için iyi bilinmektedir. Buna ek olarak, kloroplast (ve plastidler adlandırılan ilgili organellerin geniş ailesi) amino asitler, lipidler, pigmentlerin sentezi ve bu ağırlık ve patojen zorlaması gibi çevresel sinyalin duyulması da dahil olmak üzere, bitkilerde bir çok önemli rol oynar. Fotosentez, belirli koşullar altında yararlı role sahip olduğu, yan ürünleri gibi reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturur, ancak, eğer zarar ya da ölümcül etkilere neden olabilir fazlasıyla üretilmiştir. ROS aşırı özellikle olumsuz çevre koşulları tarafından teşvik edilir ve böylece kloroplastlar yakından tuzluluk ve ozmotik stresler 2 olarak abiyotik streslere, verilen yanıtların bağlantılıdır. Chloroplasts karmaşık bir yapıya sahiptir. Her bir kloroplast dış ve iç membranlar oluşur kaplama olarak adlandırılan bir çift membran dış katman ile çevrilidir. Dahili olarak, fotosentezin ışık reaksiyonları gerçekleşecek thylakoid, adında başka bir zar sistemi vardır. iki membran sistemleri arasında sulu bir bölme arama C tespit katılır stroma vardır. Bir kloroplast 3.000 ~ farklı proteinleri içerebilir, ve bu proteinlerin büyük çoğunluğu ön-madde biçiminde sitozol sentezlenir ve zarf membran 1 adanmış proteini translocons ile organel içe gerekir. İlginçtir, son çalışma kloroplast proteini ithalatı aktif düzenlenir belirtti ve bu yüzden kloroplast proteom üzerinde kontrol önemli bir seviyede uygulamak mümkün. Örneğin, protein ithalat inci bolluğu doğrudan yönetmelikle abiyotik strese yanıt verebilir 2015 yılında rapor edilmiştirubikuitin-proteazom sistemi 3 ile kloroplastlar (TOK) Dış zarfın zarında e translokon. Saflaştırılmış kloroplast kullanılması ve in vitro sentezlenen ön-madde proteinlerinin protein içe vitro 4,5 içinde yeniden edilebilir. Böylece, in vitro yöntemler, protein ithalat makine varsayılan bileşenlerinin analizi için ve protein ithalat ve düzenleme altında yatan mekanizmaları keşfetmek için kritik bir yaklaşım olmuştur farklı mutant bitki 6, ithalat oranlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, kloroplast kloroplast proteinlerinin 7,8 alt organel lokalizasyon, topoloji ve çalışmalarını kolaylaştırabilir in vitro ithalat aşağıdaki ileri fraksiyon ya da proteaz sindirim, ile işlenebilir. biz açıklayacağız olarak stres protein ithalat düzenlenmesini incelemek için, bizim rutin kloroplast izolasyon yöntemi değiştirdinizİşte. Önemli olarak, kloroplast 8 gün boyunca ortam agar standart Murashige ve Skoog (MS) büyütülmüş ve daha sonra, nispeten kısa, kontrollü baskı tedavisi sağlayan, stres ile takviye Sıvı MS ortamı içine transfer edilmiş bitkilerden izole edildi. Stres ile tedavi edilen bitkilerden izole kloroplast verimi ve yetkinlik İn-vitro protein içe tahlilinde 3 alt uyumludur. Kloroplast yalıtım protokole ek olarak, sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve yaygın olarak 3,9-12 kullanılan in vitro protein alma için, rutin bir yöntem sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1048">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Murashige and Skoog basal salt&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">M0221</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">phytoagar</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2002</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BPE151-500</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">surgical tape (e.g., Micropore, 3M)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">filter paper</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB59023</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Percoll</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10607095</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D/0700/53</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2001</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">filtration cloth (Miracloth)</td>
			<td style="width:175px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">CFT-595-040M</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">250 mL centrifuge bottle</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">CFT-891-V</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11010070</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11030083</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B34182</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363930</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363058</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">346963</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:475px;">radiolabeled [35S] methionine</td>
			<td style="width:175px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG072002MC</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L5540</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i)</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:475px;">haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td>
			<td style="width:175px;">Hawksley Technology</td>
			<td style="width:119px;">AC1000</td>
			<td style="width:280px;">0.1 mm depth, 1/400 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">cover glasses</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-094</td>
			<td style="width:280px;">22 mm &#215; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">2 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">S1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">microfuge (e.g., Eppendorf 5415D)</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SPR-700-310L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">gluconic acid (potassium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22932-2500</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">MgATP</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9187</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">methionine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6039</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B/P620/44</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">glycerol&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G/0650/17</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SDS</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/5200/53</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Tris Base&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2005</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer)</td>
			<td style="width:175px;">Raytest</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

Kloroplastlar fotosentez ama birçok diğer metabolik ve sinyal fonksiyonları sadece içeren bitkilerin pek çok yaşamsal roller ile organelleri. Ayrıca, kloroplast gibi tuzluluk ve ozmotik stresler gibi çeşitli abiyotik streslere, bitki yanıtları için kritik öneme sahiptir. Bir kloroplast kendi genomu tarafından kodlanan, bazıları ~ 3.000 farklı protein kadar ihtiva edebilir. Ancak, kloroplast proteinlerinin çoğunluğu çekirdeğine kodlanmış ve sitozolde sentezlenen ve bu proteinler kloroplast zarf membranların de translocons aracılığıyla kloroplast alınmak üzere ihtiyacı vardır. Son çalışmalar, kloroplast proteini içe aktif stres ile kontrol edilebilir olduğunu göstermiştir. biyokimyasal stres koşulları altında, protein ithalat gibi düzenlenmesini araştırmak, biz kolayca herhangi bir laboratuvarda elde edilebilir hızlı ve basit bir işlem olarak burada açıklanan yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, bitkiler normal conditio altında yetiştirilirDaha sonra ns ve sıvı kültüründe stres koşullarına maruz. Bitki materyali toplanır ve kloroplastlar sonra homojenizasyon tarafından serbest bırakılır. Ham homojenat sağlam kloroplast izolasyonunu sağlayan, yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile ayrılır. Kloroplast verim sayımı ile değerlendirilir ve kloroplast intakt bir mikroskop altında kontrol edilir. Protein ithalat tahlilleri için, saflaştırılmış kloroplastlar in vitro çevrilmiş haberci proteinleri 35 S radyoetiketlenmiş ile inkübe edilir ve zaman ders deneyler stres koşullarında genotipleri arasındaki ithalat oranları karşılaştırmalar sağlamak için yapılmaktadır. Biz düzenleyici mutant gelen kloroplastlar içine protein ithalat oranı özellikle ozmotik stres koşulları altında değişmiş olduğunu gösteriyor bu yöntem kullanılarak üretilen verileri sunmak.

3 zaman noktaları ile bir örnek kloroplast proteini içe Deney, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PSAD ~ 23 kD 16 bir ön-madde biçiminde olan, bir stroma maruz fotosistem bir ~ 18 kD bileşenidir. Bunu sabit olarak WT göre SP1 mutant, yükselir çünkü pSAD mutant 3 ithalat etkinliğindeki bir değişikliğe işaret, gerilimli şartlar altında, burada in vitro protein içe deneyi için seçildi. SP1 proteini 3 - sp1 mutant kloroplast protein ithalat makine önemli bir regülatör bir kusur taşır. Normal koşullar altında yetiştirilen bitkilerden izole kloroplastların için sp1 ve WT arasındaki pSAD ithalat belirgin bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir) 3. Ancak, burada açıklanan yöntemler kullanılarak ozmotik izole kloroplastların içine pSAD ithalat değerlendirmek içinstresli bitkiler, açık bir fark tespit edildi. Biz de genotipleri ile zamana bağlı bir şekilde olgun protein formunda birikimi gözlenen iken, ithalat oranı önceki sonuçlarla 3 ile uyumludur sp1 kloroplastlarda (Şekil 1), için daha WT kloroplastlar için anlamlı olarak daha düşüktü ve ortaya stres koşulları altında pSAD kloroplast ithalatını düzenleyen SP1 proteinin önemli bir rol. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Şekil 1. Protein İthalat Testi stres koşullarında yetiştirilen Kloroplastlar 10 günlük bir WT (Col-0) izole edilmiştir. Osmotik Stres Koşullarında Yetiştirilen bitkilerden izole edilen kloroplastlarda ve sp1 mutant Arabidopsis bitkileri kullanarak Yürütülen (200 mM mannitol) 2 gün boyunca. (A) Protein ithalat kullanılarak gerçekleştirilmiştir [35 S] -methionine etiketli pPsaD ve SDS-PAGE ve fosfor görüntüleme ile analizden önce 4, 8 ve 12 dakika devam etmesine izin verilir. Buna paralel olarak, in vitro olarak aşağıdakileri içeren pPsaD% 10 giriş kontrolü, çevrilen protein (IVT) analiz edilmiştir. muhtemelen kesilmiş veya proteolizlenen çeviri ürünlere karşılık iki bant vardır aralarında iken kendi yoğunluk zamanla (*) sırasında değişmedi çünkü (ön) ve olgun haberci (mat) pPsaD formları, belirtilmiştir. Stres koşulları altında yetiştirilen WT ve sp1 bitkilerden kloroplastların içine ithalat fiyatlarını karşılaştırın (B), A ithal olgun proteine karşılık gelen her bir bandın şiddeti ölçüldü. Tüm veriler 12 dakika sonra WT bitkilerden kloroplastlarda ithal protein miktarı yüzde olarak ifade edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants at JoVE.com

Stresli Bitkilerden İzole Edilen Kloroplastlara Protein İthalatının Analizi | Biyoloji | Video

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Görüntüleme.  University of Oxford.  Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir. 

Video: Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...