Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di PJ dalla Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council (BBSRC; concedere rif BB / K018442 / 1.).

1. La crescita di piante di Arabidopsis e il trattamento dello stress <ol><li> Preparare 1 L di Murashige e Skoog (MS) aggiungendo 4,3 g di MS Basal Salt miscela, 10 g di saccarosio, 0,5 g 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) in acqua deionizzata fino a 1 L e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 6 g di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C. <ol><li> Prima di solidificazione, versare il terreno in piastre di Petri rotonde (diametro 9 cm, altezza 1,5 cm, con 20 - 25 mL MS medio per piastra). Lasciare le piastre ad asciugare per ~ 1 h in una cappa a flusso laminare prima di chiudere le palpebre. </li></ol></li><li> Posizionare semi Arabidopsis thaliana in un mL provetta 1.5 per sterilizzazione superficiale aggiungendo 1 ml di 70% (v / v) etanolo contenente 0,02% (v / v) Triton X-100 e continuamente agitazione per 5-10 min. Per ciascun genotipo / condizione, preparare 10 piatti di Petri ogni trasportano ~ 100 - 150 piantine. </li><li> Attendere circa 10 s fino a quando i semi si depositano alfondo del tubo, e quindi scartare il surnatante pipettando. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, e agitare nuovamente il tubo per 10 min. </li><li> Preparare la cappa a flusso laminare, mentre i semi sono sterilizzando. Prendete un pezzo di carta da filtro per campione, piegarlo a metà per facilitare la semina, e immergerlo in 100% di etanolo nella cappa. Attendere che si asciughi completamente. Si noti che l&#39;etanolo 100% è usato come evapora più velocemente del 70% di etanolo. </li><li> Trasferire i semi sulla carta da filtro pipettando utilizzando un 1 ml punta della pipetta taglio ~ 5 mm dalla fine fine. Lasciarli asciugare, che dovrebbe prendere circa 10 - 15 min. </li><li> Seminare ~ 100 - 150 semi sterilizzati in modo uniforme su ogni piatto MS medio Petri, e sigillare ogni piatto con del nastro adesivo chirurgico. </li><li> Conservare le piastre a testa in giù a 4 ° C per 2 - 4 d incoraggiare e sincronizzare la germinazione. I vecchi semi possono avere bisogno di rimanere più a lungo (fino ad una settimana) a 4 ° C. </li><li> Trasferire le piastre di una camera di coltura di tessuti vegetali e lasciarli a testa in su.Far crescere le piante per 8 d nell&#39;ambito di un ciclo di lunga giornata (16 h 100 micromol · m - 2 · s - 1 luce, 8 h scuro) a 20 ° C. </li><li> Per il trattamento di stress, quando le piante sono 8 d vecchia, nella cappa a flusso, trasferirli dal mezzo agar, da loro raschiando delicatamente a mano indossando guanti di etanolo-sterilizzati, in un pallone sterilizzato del mezzo MS liquido contenente il fattore di stress (ad esempio, 200 mm mannitolo). Evitare di portare su agar. Coprire bocca pallone in un foglio sterilizzato e consentono alle piante di crescere nelle stesse condizioni come al punto 1.8 per ulteriori 2 d su agitatore orbitale con agitazione delicata (~ 100 rpm). </li></ol> 2. Fare un proteina precursore in vitro Trascrizione / Traduzione Nota: Questo protocollo assume l&#39;uso di Arabidopsis fotosistema I subunità D precursore (pPsaD) come modello / preproteina, ma il metodo è compatibile con gli altri. <ol&gt; <li> Clonare la sequenza codificante (CDS) del pPsaD nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pBlueScript II SK (o qualsiasi altro vettore simile con un promotore T7 upstream) 13. Purificare il plasmide (pBSK-pPsaD) utilizzando un kit di isolamento del DNA e verificare la sequenza dal sequenziamento del DNA. NOTA: Tutte queste operazioni impiegano tecniche standard di clonazione molecolare. </li><li> Determinare la concentrazione plasmide DNA pBSK-pPsaD utilizzando uno spettrofotometro impostato per misurare l&#39;assorbanza a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. </li><li> Eseguire un 20 microlitri PCR (per 35 cicli) utilizzando il plasmide diluito come modello. Preparare la reazione nel modo seguente: 2 ml di buffer 10 × polimerasi, 2 microlitri 2 mM dNTP, 1 ml 5 mM M13 Forward Primer (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 ml 5 mM M13 primer reverse (5 &#39;-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3&#39;), 1 ml diluito pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polimerasi, e acqua distillata per rendere il volume totale di reazione fino a20 ml. Utilizzare un programma PCR standard, come segue: 95 ° C, 5 min; 35 cicli di [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); e 72 ° C, 5 min. </li><li> Eseguire 5 microlitri del prodotto di PCR su un 1% (w / v) gel di agarosio in TAE tampone (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM di acido acetico, 1 mM EDTA) per verificare la corretta amplificazione del cDNA, e quantificare il relativo banda rispetto agli standard per confermare la concentrazione. Conservare il resto del prodotto a -20 ° C per ulteriori applicazioni. </li><li> Preparare una reazione di 50 microlitri utilizzando un sistema di reticolociti di coniglio lisato base privo di cellule di trascrizione / traduzione compatibile con PCR DNA, come segue: 40 microlitri lisato di reticolociti dal sistema di trascrizione / traduzione, 2,5 microlitri radiomarcato [35 S] metionina, 11 pCi / mL (attività specifica:&gt; 1.000 Ci / mmol), acqua distillata 2,5 ml sterili, e 5 ml di prodotto pPsaD PCR (100-800 ng). Attenzione: Indossare guanti, indumenti di laboratorio e vetro di sicurezzases durante la manipolazione di materiale radioattivo. Monitorare e decontaminare la superficie di lavoro e le attrezzature. Smaltire tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. </li><li> Incubare la reazione per 90 min in un bagno d&#39;acqua a 30 ° C. Arrestare la reazione ponendo il campione sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere 1 ml della reazione come campione di prova (lo stesso volume può anche servire come un controllo di input per step 5.7) per la verifica su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide standard (SDS-PAGE) seguita da autoradiografia, fluorography o l&#39;imaging fosforo. Un buon risultato è indicato dalla osservazione di una banda distinta e forte corrispondente al peso molecolare di pPsaD (~ 23 kD). Conservare il resto della reazione a -80 ° C per ulteriori applicazioni. </li></ol> 3. Isolamento Cloroplasto <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre: <ol><li> Preparare isolamento Cloroplasto Buffer (CIB, 2x): 0.6 M sorbitolo, 10 mM cloruro di magnesio(MgCl 2), 10 mM glicole etilenico tetraacetico (EGTA), 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 20 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO 3), 40 mm 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) ; regolare a pH 8,0 con KOH. Preparare 2 L di 2x CIB, fare aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Per rendere 1x CIB, diluire il 2x CIB 1: 1 con acqua distillata; questo può essere preparato fresco il giorno dell&#39;esperimento isolamento cloroplasto. </li><li> Preparare HEPES-MgSO 4 -Sorbitolo tampone (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM solfato di magnesio (MgSO 4), 0,3 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con idrossido di sodio (NaOH). Preparare 400 ml di tampone, rendere aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. </li></ol></li><li> Effettuare tutte le seguenti procedure nella cella o su ghiaccio. Preraffreddare tutte le soluzioni, dispositivi, attrezzature, e rotori prima starting. </li><li> Preparare un gradiente di densità continua miscelando 13 ml di Percoll, 13 mL 2x CIB buffer e 5 mg di glutatione in una provetta da centrifuga 50, e centrifugando la miscela a 43.000 xg per 30 min (freno off) a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire il tubo con cura per evitare di disturbare il gradiente e tenerlo in ghiaccio per un uso successivo. </li><li> Trasferire 100 ml di 1x CIB per il genotipo / condizione a un 1 L bicchiere. <ol><li> Rimuovere le piantine dal mezzo liquido da loro ribaltamento in un setaccio, e trasferirli in un altro bicchiere CIB contenenti; poi, risciacquare il tessuto con il CIB per rimuovere liquido residuo prima di sostituirla con 100 mL di CIB fresco. </li></ol></li><li> Per omogeneizzazione, usare un totale di 100 ml di 1x CIB per campione in cinque turni consecutivi di omogeneizzazione, ogni turno usando 20 mL di CIB fresche presenti in un bicchiere da 50 ml. <ol><li> Per il primo turno di omogeneizzazione, trasferire il tessuto vegetale nel beaker da 50 ml a mano, consentendo laPrecedente buffer di detenzione di defluire attraverso le dita. Provate ad utilizzare la maggior parte del tessuto al primo turno, ma assicurarsi che sia immerso con tampone; se ciò non è possibile, introdurre il tessuto non utilizzato residuo al secondo turno. </li></ol></li><li> Posizionare sonda del omogeneizzatore tessuto nel tessuto e omogeneizzare con due impulsi di 1 - 2 s ciascuna. Filtrare l&#39;omogeneizzato attraverso due strati di tessuto di filtrazione in un 250 mL provetta delicatamente spremitura. Conservare il filtrato, e trasferire il tessuto indietro al ml bicchiere da 50. </li><li> Posizionare un secondo 20 ml CIB aliquota in ml bicchiere 50, l&#39;aggiunta di qualsiasi tessuto rimanente non utilizzato nel primo turno di omogeneizzazione, e ripetere la procedura di omogeneizzazione e filtrazione. Quindi, ripetere i punti 3.5 e 3.6 fino a quando tutti i 100 ml di CIB è stata utilizzata (ad esempio, 5 aliquote di 20 ml), e combinare i filtrati risultanti. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato pool a 1.000 g per 5 min (freno) a 4 ° C, e versare offil surnatante immediatamente dopo il completamento della centrifugazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet nel surnatante residua nella provetta agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Non risospendere vigorosamente pipettando o vortex. </li><li> trasferire delicatamente l&#39;omogeneizzato sulla parte superiore del gradiente di densità continua premade, usando una pipetta Pasteur per applicarlo attraverso la parete del tubo ricevente. Evitare di disturbare il gradiente. Centrifugare in un rotore oscillante secchio a 7.800 xg per 10 min (freno off) a 4 ° C. NOTA: Due bande verdi possono essere visti nel gradiente dopo la centrifugazione: la banda inferiore contiene cloroplasti intatti, e la banda superiore contiene cloroplasti rotti. </li><li> Eliminare la banda superiore pipettando, e poi trasferire la banda inferiore con una pipetta Pasteur in un fresco 50 mL provetta da centrifuga, mantenendo un volume di fino a 8 ml per gradiente. </li><li> Aggiungi ~ 25 ml di 1x HMS tampone nel tubo e capovolgere il tubo per due volte to lavare il Percoll dai cloroplasti. Riposizionare il tubo nel rotore oscillante-benna e centrifugare a 1000 g per 5 min (freno) a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con cura dei cloroplasti nelle HMS residua nel tubo agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Aggiungere ulteriori 100 - 300 ml di HMS se necessario (in base alle dimensioni del pellet e il conteggio nella sezione 4), ma cercate di non diluire il campione troppo. <ol><li> Mantenere i cloroplasti sul ghiaccio. Ogni volta prima che i cloroplasti sono utilizzati per applicazioni a valle, agitare il tubo per sospendere di nuovo loro. Usare sempre un puntale di taglio (con pori allargata) per trasferire i cloroplasti. </li></ol></li></ol> 4. Analisi del rendimento e integrità dei cloroplasti <ol><li> Aggiungere 5 ml di cloroplasti isolati a 495 microlitri di buffer di 1x HMS in una provetta da 1,5 ml, e poi mescolare delicatamente invertendo il tubo per ottenere una diluizione 1: 100. </li><li> PlaCe un vetro di copertura sulla sommità della camera di conteggio del dell&#39;emocitometro. Lentamente pipetta ~ 40 - 60 microlitri della sospensione cloroplasto diluita nella fessura tra il vetro di copertura e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X o 20X, cloroplasti intatte aspetto rotondo e luminose e sono circondate da un alone di luce. NOTA: Sotto il microscopio, vi è un&#39;area di 1 mm 2 conteggio con 25 grandi piazze, ciascuno contenente 16 piccoli piazze del centro della camera di conteggio. </li><li> Contare il numero di cloroplasti in 10 grandi piazze. Il numero di cloroplasti per piazzale dovrebbe media tra il 10 e il 30. Se troppo pochi o troppi cloroplasti sono presenti, regolare il fattore di diluizione (al punto 4.1) di conseguenza, e ripetere la procedura. </li><li> Calcolare il numero di cloroplasti per ml (concentrazione) come segue: n (il numero medio di cloroplasti per piazzale calcolata al punto 4.3) × 25 (numero totale di grandi piazze) × 100 (il fattore di diluizione) × 10 4 (fattore di scala per esprimere i dati per 1 ml, in quanto il volume di sopra dei 25 quadrati è di 0,1 mm 3). </li><li> Calcolare la resa effettiva dei cloroplasti moltiplicando la concentrazione del volume di sospensione cloroplasto ottenuta nello stadio 3.12. Normalmente, più di 50 × 10 6 cloroplasti possono essere ottenuti. </li></ol> 5. Cloroplasto proteine ​​Import <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre: <ol><li> Preparare 10x HMS buffer: 500 mm HEPES, 30 mM MgSO 4 e 3.0 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con NaOH. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e a 4 ° C per una conservazione a breve termine. </li><li> Preparare Importa buffer di arresto: 50 mm EDTA sciolto in 1x HMS buffer. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare 2x tampone proteico caricamento: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glicerolo, 2% (w/ V) di SDS, 0,005% (w / v) di bromofenolo blu. Fare 50 ml, e conservare a 4 ° C. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere 100 ml di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) a 900 ml di tampone. </li></ol></li><li> Per eseguire una volta portate con 3 punti temporali, preparare 3 tubetti contenenti ciascuno una un&#39;aliquota 130 ml di tampone arresto di importazione, e lasciarli sul ghiaccio. Preparare una reazione di importazione 450 microlitri in un tubo di 2 ml (per genotipo / condizione). Scongelare tutti gli ingredienti appena prima dell&#39;uso. <ol><li> Per una reazione di importazione, di solito utilizzare 10 × 10 6 cloroplasti in un volume microlitri; per esempio, se la concentrazione cloroplasto è 2,5 × 10 8 / mL, utilizzare 40 microlitri di sospensione cloroplasto. Tre punti temporali avranno bisogno di 3 × A microlitri (ad esempio, 120 ml nel nostro esempio). </li><li> Miscelare i componenti reazioni sul ghiaccio nel seguente ordine: acqua distillata (per rendere il volume totale di 600 microlitri), B microlitri 10x HMS tampone (dove B = [600-3 × A] / 10, cioè 48 nel nostro esempio), 12 microlitri1 M di acido gluconico (sale di potassio), 6 ml 1 M NaHCO 3, 6 microlitri 20% (w / v) BSA, 30 microlitri 100 mM adenosina 5&#39;-trifosfato sale di magnesio (MgATP), 24 microlitri 250 mM metionina (non radiomarcato ), e 30 microlitri proteina precursore. Immediatamente prima di iniziare la reazione di importazione, aggiungere 3 × Un ml di cloroplasti e mescolare picchiettando delicatamente il tubo. </li></ol></li><li> Incubare la provetta di reazione a 25 ° C in un bagno di acqua sotto 100 mmol · m - 2 · s - 1 luce. Di tanto in tanto sfogliare i tubi per risospendere cloroplasti. </li><li> Per condurre un time-corso, ritirare 130 aliquote microlitri dalla reazione al time-punti richiesti entro il campo lineare di importazione, che per pPsaD è fino a ~ 12 min (4, 8 e 12 min di tempo sono adatti in questo caso). Il periodo di gamma lineare può variare per diverse proteine 14. Pertanto, si suggerisce di verifica di ogni singolo preproteina prima di ottimizzare tlui punti di tempo. </li><li> Subito dopo il ritiro, trasferire ogni aliquota 130 ml ad un tubo di tampone arresto importazione ghiacciata, Mescolare agitando leggermente il tubo, e mantenere tutti i tubi in ghiaccio fino al momento-corso è stato completato. </li><li> Centrifuga tutti i campioni per 30 s a 12.000 × g in una microcentrifuga, scartare il surnatante pipettando, e pellet risospendere in 15 ml di 2x tampone proteico di carico con il vortex. </li><li> Analizzare tutti i campioni, più il controllo di input pPsaD (contenente pPsaD pari al 10% dell&#39;importo aggiunto per ogni reazione di importazione, dal punto 2.7) secondo le norme SDS-PAGE e autoradiografia, fluorography o immagini fosforo 15. Utilizzare immagine software di analisi per quantificare e analizzare i risultati. Per fornire un&#39;indicazione dell&#39;efficienza importazione, la quantità di proteina importato in differenti genotipi / condizioni può essere valutata misurando la radioattività associata con ciascuna banda maturo. </li></ol>

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Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;importazione di proteine cloroplasto può essere regolata attivamente da stress, che è fondamentale per la funzione cloroplasto e impianto di sopravvivenza a 3. In questo studio, per monitorare tale regolamentazione, abbiamo modificato il nostro isolamento cloroplasto e nelle procedure di test in vitro di importazione al fine di consentire di accertare la capacità di importazione di piante coltivate in condizioni di stress. I risultati hanno indicato un ruolo importante per il SP1 nel cloroplasto regolamento importazione delle proteine. Convenzionali in vitro di importazione utilizzano piante coltivate su MS standard di agar medio 6,17,18. Nel caso del mutante sp1 qui descritto, tali dosaggi convenzionali non hanno evidenziato differenze nella proteina importazione relative al WT 3. Tuttavia, il ruolo di SP1 nella regolazione importazione delle proteine si rivela chiaramente quando importazione proteina viene valutata in condizioni di stress utilizzando i metodi descritti di seguito (Figura 1). Mentre may non essere possibile confrontare direttamente importare dati dal saggio condizioni di stress con quelli ottenuti da test convenzionali (come i metodi impiegano piante coltivate in coltura liquida e su agar, rispettivamente), i confronti tra le condizioni di stress e non stress sono fattibili a condizione che le piante sono cresciuti nello stesso terreno di coltura liquido, con o senza stress. Rispetto al trattamento stress sul terreno agarizzato, coltura liquido è più conveniente per il trattamento del gran numero di piante necessarie in vitro importazione. Inoltre, facilita l&#39;applicazione uniforme del fattore stressante per tutte le piante, che è particolarmente importante per i trattamenti di stress a breve termine. Il metodo qui presentato è stato applicato per studiare lo stress osmotico mediante trattamento mannitolo, ma potrebbe essere facilmente adattato ad una vasta gamma di altre sollecitazioni; per esempio, lo stress sale a breve termine e lo stress ossidativo, per i quali i corrispondenti fattori di stress potrebbero be allo stesso modo applicato su supporto MS liquido. Per altri tipi di stress, si consiglia il grado di stress viene prima ottimizzata; eccessivamente trattamenti gravi possono avere effetti negativi sulla resa e / o di competenza importazione dei organelli isolati. Ci sono diversi passaggi importanti all&#39;interno del protocollo a cui si deve prestare particolare attenzione, come di seguito dettagliato. La concentrazione agar ottimale per il mezzo MS possono differire (0,6 - 0,9%, w / v) a seconda del produttore. Pertanto, si raccomanda di ottimizzare empiricamente la concentrazione di agar prima di iniziare esperimenti. Il mezzo non dovrebbe essere così morbido che si attacca al tessuto nella fase di raccolta (passo 1,9), non dovrebbe essere così difficile che inibisce lo sviluppo delle radici delle piante. La concentrazione di saccarosio può essere regolato secondo le piante utilizzate. Quando si lavora con mutanti particolarmente malati, medie MS completato con 2 - 3% (w / v) di saccarosio può aiutare le piante a crescere meglio. quando appsdraiato trattamenti di stress, non è buono per il trasferimento molto vecchi impianti al mezzo liquido (per esempio,&gt; 14 giorni di età). Questo è perché le radici più sviluppati delle piante più vecchie sono più facilmente danneggiati durante trasferimento. Per quanto riguarda il sistema di trascrizione / traduzione, ci sono 2 sistemi principali: quelle a base di germe di grano, e quelle a base di reticolociti di coniglio. Questi kit possono utilizzare diversi modelli, come plasmidi linearizzati, plasmidi unlinearized, o prodotti di PCR. I kit sono anche specifici per i promotori T3, T7 e SP6. Si noti che il kit si consiglia qui è adatto solo per l&#39;uso con i prodotti di PCR e il promotore T7. Tuttavia, per ragioni sconosciute, alcune preproteine ​​radiomarcati realizzati con questo sistema potrebbero non funzionare in modo efficiente nel saggio di importazione; in questi casi, si può considerare cercando un sistema di estratto di germe di grano o di un sistema di lisato di reticolociti significato per modelli plasmidi. Si può anche migliorare il risultato della trascrizione / traduzione reazione modificando le condizioni di reazione secondo il manuale del produttore. È importante iniziare isolamento cloroplasto prime ore del mattino (o ravvicinata alla luce ciclo della camera di crescita), al fine di evitare l&#39;accumulo di amido all&#39;interno cloroplasti causa di fotosintesi, che possono ostacolare l&#39;isolamento di organelli intatti. La procedura di isolamento cloroplasto deve essere fatto rapidamente senza inutili ritardi, e cloroplasti isolati deve essere mantenuta sempre freddo. Questo è quello di mitigare l&#39;osservazione che isolato cloroplasti gradualmente perdono la loro vitalità, che non è buono. Se si utilizza CIB appena scongelati o buffer di HMS, assicuratevi di mescolare il buffer bene prima dell&#39;uso per ottenere una soluzione omogenea. Le condizioni ottimali per l&#39;omogeneizzazione del materiale vegetale sono state stabilite empiricamente, e possono variare se si utilizza un diverso omogeneizzatore tessuto. Se i diversi genotipi vegetali contengono similalivelli di clorofilla r, clorofilla quantificazione può essere usato come un modo alternativo per normalizzare i campioni prima di effettuare i test di importazione. Clorofilla può essere determinato spettrofotometricamente dopo l&#39;estrazione di un campione dei cloroplasti isolati in 80% (v / v) di acetone acquoso 19,20. Tuttavia, se i tassi di importazione di piante che presentano diversi contenuti di clorofilla (ad esempio, mutanti con fenotipi clorotiche) devono essere confrontati, utilizzare il numero cloroplasto contare per normalizzare i campioni cloroplasti nei saggi di importazione. È particolarmente importante per risospendere le cloroplasti accuratamente nel passo 3.11. risospensione insufficiente può lasciare aggregati di cloroplasti, che renderà difficile contare i numeri in modo accurato e, quindi, ostacolerà il corretto caricamento nelle reazioni di importazione. Se grave aggregazione è visto al microscopio (ad esempio, aggregati con&gt; 10 cloroplasto unite), continuare scuotendo il campione cloroplasto in ghiaccio fino al aggregatES vengono rimossi. E &#39;più facile risospendere le cloroplasti in un volume più piccolo di tampone. E &#39;importante essere consapevoli che le reazioni importazione delle proteine ​​(sezione 5) devono essere condotte con le opportune precauzioni a causa della loro natura radioattiva. precauzioni necessarie includono: indossare guanti monouso, indumenti da laboratorio e occhiali di sicurezza, il monitoraggio e la decontaminazione del piano di lavoro e le attrezzature, e lo smaltimento di tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. Anche tenere presente che la corretta pressione osmotica è fondamentale per mantenere l&#39;integrità dei cloroplasti durante le reazioni di importazione, e questo è principalmente mantenuto dal buffer HMS. Perché 10x HMS è viscoso, occorre in primo luogo riscaldato a RT, e poi accuratamente miscelati, e applicato con un puntale di taglio al fine di garantire la misurazione dei volumi accurati. Nella reazione di importazione, si aggiunge metionina freddo per inibire l&#39;incorporazione di metionina radioattivo libera in chloropl estraneiproteine ​​AST attraverso una versione organelli durante la fase di incubazione, mentre BSA viene utilizzato per minimizzare proteolisi agendo come substrato per proteasi.

Cloroplasti sono organelli molto abbondanti che esistono nei tessuti verdi delle piante. Essi sono ben noti per il loro ruolo fondamentale nella fotosintesi, un processo che utilizza l&#39;energia della luce per convertire l&#39;anidride carbonica allo zucchero e sostenere così quasi tutta la vita sulla terra 1. Inoltre, cloroplasti (e l&#39;ampia famiglia di organelli correlati chiamati plastidi) svolgono molte altre funzioni vitali nella piante, tra la biosintesi degli aminoacidi, lipidi, pigmenti, e il rilevamento di segnali ambientali come la gravità e la sfida patogeno. La fotosintesi genera specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) come sottoprodotti, che in determinate circostanze hanno un ruolo utile, ma se overproduced può causare effetti dannosi o addirittura letali. La sovrapproduzione di ROS è particolarmente promossa da condizioni ambientali avverse, e quindi cloroplasti sono strettamente legate alle risposte a stress abiotici, come salinità e stress osmotico 2. Chloroplasts hanno una struttura complessa. Ogni cloroplasto è circondato da uno strato esterno doppio membrana chiamata busta, che consiste di membrane esterne ed interne. Internamente, vi è un altro sistema di membrana chiamata tilacoidi, dove le reazioni luce della fotosintesi avvengono. Tra i due sistemi a membrana vi è un vano chiamata acquosa stroma, che è coinvolto nella fissazione del carbonio. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine diverse, e la stragrande maggioranza di queste proteine sono sintetizzate nel citoplasma in forma precursori e devono essere importati nella organello attraverso translocons proteine dedicati nelle membrane busta 1. È interessante notare che, recente lavoro ha indicato che l&#39;importazione di proteine ​​cloroplasto è regolata attivamente, e così è in grado di esercitare un importante livello di controllo sul proteoma cloroplasto. Ad esempio, è stato riferito nel 2015 che l&#39;importazione di proteine ​​in grado di rispondere a stress abiotici attraverso la regolazione diretta dell&#39;abbondanza di The translocon a livello della membrana busta esterna dei cloroplasti (TOC) da parte del sistema ubiquitina-proteasoma 3. Utilizzando cloroplasti purificati e in vitro sintetizzato proteine precursori, importazione delle proteine può essere ricostituito in vitro 4,5. Così, metodi in vitro possono essere utilizzati per valutare i tassi di importazione in diverse piante mutanti 6, che è stato un approccio critico per l&#39;analisi delle componenti putativi del macchinario importazione delle proteine e per scoprire i meccanismi alla base importazione delle proteine e la sua regolamentazione. Inoltre, cloroplasti possono essere trattati con un ulteriore frazionamento o proteasi digestione, a seguito di importazione in vitro, che può facilitare studi sulla localizzazione sub-organelli e la topologia delle proteine cloroplasti 7,8. Per studiare la regolazione di importazione delle proteine ​​da stress, abbiamo modificato il nostro metodo di isolamento dei cloroplasti di routine come descriveremoQui. Importante, cloroplasti sono stati isolati da piante che erano state coltivate in serie Murashige e Skoog (MS) agar per 8 giorni e poi trasferite in un mezzo liquido MS supplementato con stress, fornendo un tempo relativamente breve, stress trattamento controllato. Il rendimento e la competenza dei cloroplasti isolati da tali impianti stress trattati siano compatibili con la valle di proteine vitro importazione 3. Oltre al protocollo di isolamento cloroplasto, presentiamo il nostro metodo di routine per vitro importazione proteina, che ha dimostrato di essere robusto ed è ampiamente usato 3,9-12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1048">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Murashige and Skoog basal salt&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">M0221</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">phytoagar</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2002</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BPE151-500</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">surgical tape (e.g., Micropore, 3M)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">filter paper</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB59023</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Percoll</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10607095</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D/0700/53</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2001</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">filtration cloth (Miracloth)</td>
			<td style="width:175px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">CFT-595-040M</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">250 mL centrifuge bottle</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">CFT-891-V</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11010070</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11030083</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B34182</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363930</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363058</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1)</td>
			<td style="width:175px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">346963</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:475px;">radiolabeled [35S] methionine</td>
			<td style="width:175px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG072002MC</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L5540</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i)</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:475px;">haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td>
			<td style="width:175px;">Hawksley Technology</td>
			<td style="width:119px;">AC1000</td>
			<td style="width:280px;">0.1 mm depth, 1/400 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">cover glasses</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-094</td>
			<td style="width:280px;">22 mm &#215; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">2 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">S1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">microfuge (e.g., Eppendorf 5415D)</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SPR-700-310L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">gluconic acid (potassium salt)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22932-2500</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">MgATP</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9187</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">methionine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6039</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B/P620/44</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">glycerol&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G/0650/17</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SDS</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/5200/53</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Tris Base&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B2005</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:175px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">MB1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer)</td>
			<td style="width:175px;">Raytest</td>
			<td style="width:119px;">unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

Cloroplasti sono organelli con molti ruoli vitali nelle piante, che comprendono non solo la fotosintesi, ma numerose altre funzioni metaboliche e di segnalazione. Inoltre, i cloroplasti sono fondamentali per le risposte delle piante a vari stress abiotici, come la salinità e stress osmotico. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine ​​diverse, alcune delle quali sono codificati dal proprio genoma. Tuttavia, la maggior parte delle proteine ​​cloroplasti sono codificati nel nucleo e sintetizzata nel citosol, e queste proteine ​​devono essere importati nel cloroplasto attraverso translocons le membrane dei cloroplasti busta. Recenti studi hanno dimostrato che l&#39;importazione delle proteine ​​cloroplasto può essere regolata attivamente da stress. Per indagare biochimicamente tale regolazione di importazione delle proteine ​​in condizioni di stress, abbiamo sviluppato il metodo descritto qui come una procedura rapida e semplice che può essere facilmente realizzato in qualsiasi laboratorio. In questo metodo, le piante vengono coltivate in conditio normalens e quindi esposti a condizioni di stress in coltura liquida. materiale vegetale viene raccolto, e cloroplasti sono poi rilasciato dalla omogeneizzazione. L&#39;omogenato grezzo viene separato per centrifugazione in gradiente di densità, consentendo isolamento dei cloroplasti intatti. resa cloroplasto è valutata mediante conteggio e integrità cloroplasto viene controllato al microscopio. Per i saggi di importazione delle proteine, i cloroplasti purificate vengono incubate con 35 S radioattivo in vitro tradotto proteine precursori, e sono condotte esperimenti time-corso per consentire il confronto dei tassi di importazione tra i genotipi in condizioni di stress. Presentiamo dati generati con questo metodo che mostrano che il tasso di importazione delle proteine ​​in cloroplasti da un mutante normativo è specificamente alterata in condizioni di stress osmotico.

Un esempio proteine cloroplasto esperimento importazione di 3 punti temporali è mostrato in Figura 1. PSAD è un componente ~ 18 kD del fotosistema esposi al stroma, con una forma precursore di ~ 23 kD 16. PSAD è stato scelto qui per la proteina saggio di importazione in vitro perché i suoi livelli di steady-state sono elevati nel mutante sp1, rispetto al WT, in condizioni di stress, che suggerisce un cambiamento nella sua efficienza importazione nel mutante 3. Il mutante sp1 porta un difetto in un importante regolatore del cloroplasto macchinari importazione delle proteine - la proteina SP1 3. Per cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni normali, non vi era alcuna differenza evidente in importazione PSAD tra SP1 e WT (dati non riportati) 3. Tuttavia, utilizzando i metodi descritti qui per valutare PSAD importazione in cloroplasti isolati da osmoticamentepiante stressate, è stata rilevata una differenza chiara. Mentre abbiamo osservato l&#39;accumulo di forma proteina matura in un modo dipendente dal tempo con entrambi i genotipi, il tasso di importazione era significativamente più basso per i cloroplasti WT che per cloroplasti SP1 (Figura 1), che è coerente con i nostri risultati precedenti 3, e rivela un ruolo importante per la proteina SP1 nel regolare l&#39;importazione cloroplasto di PSAD in condizioni di stress. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Figura 1. Una proteina Importa test condotti utilizzando cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni di stress osmotici. I cloroplasti sono stati isolati da un WT 10 giorni di età (Col-0) e un SP1 mutanti piante di Arabidopsis coltivate in condizioni di stress (200 mm mannitolo) per 2 d. Importazione (A) della proteina è stata condotta utilizzando [35 S] -methionine marcato pPsaD e lasciata procedere per 4, 8 e 12 minuti prima analisi mediante SDS-PAGE e l&#39;imaging fosforo. In parallelo, il controllo di input del 10% pPsaD che comprende in vitro tradotto proteine (IVT) è stato analizzato. Il precursore (pre) e maturo (mat) forme di pPsaD sono indicati, mentre in mezzo ci sono due band che probabilmente corrispondono ai prodotti di traduzione troncati o proteolyzed perché la loro intensità non è cambiata nel corso tempo (*). (B) Per confrontare i tassi di importazione in cloroplasti da piante WT e SP1 cresciuti in condizioni di stress, l&#39;intensità di ogni banda corrispondente alla proteina matura importati in A è stato quantificato. Tutti i dati sono espressi come percentuale della quantità di proteine importati nei cloroplasti da piante WT dopo 12 min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Analisi dell'importazione di proteine ​​nei cloroplasti isolati da piante stressate | Biologia | Video

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine ​​in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l&#39;importazione proteine ​​cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori.

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

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20.9K Views.  University of Oxford.  Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine ​​in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l'importazione proteine ​​cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori. 

Video: Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Analisi delle proteine importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La colorazione delle proteine in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

Misurazione spaziale e temporale Ca

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Arricchimento della matrice extracellulare proteine da tessuti e digestione in Peptidi per l'analisi Spettrometria di Massa

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

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Misurazione spaziale e temporale Ca

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Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

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Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

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Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

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