The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

fareler ile deneyler hayvancılığın Nörobilim kurallarına Alman Hukuku ve Alman Derneği ile uyumluydu. Ruhr-University Bochum hayvan bakımı ve kullanım komiteleri uygun izinleri verdiniz. 1. Hazırlık ve Kortikal Astrositler Yetiştiriciliği Not: nöronlar hazırlanır önce astrosit kültürleri birleşen mono tabakaları haline gerektiği gibi, sonraki adımlara geçmeden önce protokolü en az 7 gün, bu adımları tamamlayın. Primer astrosit doğum sonrası gün (P) 0-3 etrafında fare yavrular elde edilen karışık bir glial kültürlerden elde edilir. T75 şişesi başına üç beyinleri (6 korteks) kullanılmalıdır. <ol><li> steril koşullar altında,% 10 h / h at serumu ve% 0.1 hacim / hacim gentamisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave etmek suretiyle astrosit hazırlarlar. 2 hafta boyunca 4 ° C &#39;de orta saklayın. </li><li> Coat 3x T75 wi şişeleri% 6 hacim / hacim CO2 varlığında 37 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca, (hücre kültürü dereceli su içinde PDL) 10 ug / ml poli-D-lizin Th. Kaplamadan sonra, bağlanmamış katyonları çıkaracaklardır, ve 9 ml astrosit orta eklemek için fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez şişeler yıkayın. </li><li> beyin hazırlanması için, (bağımsız olarak kullanılacak beyin sayısı), 10 mL Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) bir 15 ml tüp 1x 10 santimetrelik bir petri tabağına ve 1 mL HBSS 1x ekle. cerrahi makas, 2 ince forseps bir çift ve işlem için ulaşılabilecek bir Dürbünü tutun. </li><li> cerrahi makas ile hızlı bir şekilde 3 yavrular başını kesmek ve boş 10 cm çanak başkanları toplamak. <ol><li> binoküler altında korteks hazırlanmasını gerçekleştirin. İki ince forseps kullanarak, göz hizasına doğru boyun yukarı başlayarak, orta hatta kafatası dorsal cilt kaldırın. Bundan sonra, onun kan damarları ile beyin kafatası altında görülebilir. </li><li>forseps bir çift ile rostral sonunda baş düzeltmek ve arka sonunda başlayarak, kafatasının orta hat insizyon. Daha sonra, beyin açığa hakkı ve kafatasının sol yarısını off klibi. </li><li> forseps ucu kapatın ve beyin altında ventral konumlandırmak. Kafatasının dışında beyin kaldırın ve HBSS dolu 10 cm Petri kabı içine aktarın. Tüm beyinleri tabağı içinde toplandı kadar kalan örnek ile aynı şekilde devam ediniz. </li></ol></li><li> beyinleri topladıktan sonra, bir makas gibi forseps bir çift kullanarak arka beyin kapalı kısma korteks ayrılması ile başlar. forseps bir çift ile iki hemisfer arasında bir orta hat kesi gerçekleştirin. Dikkatli bir forseps ile beyin düzeltmek ve Ortabeyin kesti ve ikinci forseps kullanarak koku ampuller kortikal yarısı ile sonuna kadar. </li><li> forseps bir çift bir kortikal yarısını düzeltmek ve f bunları ayırarak hemispheres gelen meninksler soymayanal kenar rom ve daha sonra ikinci bir forseps kullanarak kortikal yüzeyinden çekerek. </li><li> çanak aşağı doğru yönlendirilmiş yüzeyi ile kortikal yarısını çevirin; dikkatle incelemek ve forseps bir çift kullanarak hilal şeklinde hipokampus kaldırın. Tek bir korteksi taşımak için bir kapalı forseps kullanılarak konik 15 ml tüp içine tek korteks aktarın. </li><li> Steril laminer akış kaputu tüm korteks, geçiş toplama ve kortikal doku ayrışması için hazırlıklarını başladıktan sonra. </li><li> 2 ml reaksiyon tüpüne 1 ml DMEM ilave edin ve h papain (30 birim) w /% 0.1 ekleyin. Bir açıklık çözeltisi (yaklaşık 3 dk) gelişene kadar 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde süspansiyon inkübe edin. 0.24 mg / ml L-sistein ve 20 ug / ml DNAz ekleyin ve yavaşça çalkalayın. Not: sindirim, enzim çözeltisi, yaklaşık 1 ml gereklidir. </li><li> ilave edilmeden önce 1 ml steril bir çözelti elde etmek için filtre (0.22 um gözenek boyutu)kortikal doku. (Bir su banyosu içinde, örneğin,) 37 ° C&#39;de 1 saat - 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: 1.11 Adımları - 1.14 kritik ve 15 dakika içinde tamamlanmalıdır. </li><li> Sindirim reaksiyonu sonlandırmak için, 1 ml astrosit ortamı ilave edin ve dikkatli bir şekilde 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş doku Karışım. toz haline için, hafifçe böylece aspirasyon ve kortikal doku süspansiyonu ekstrüzyon, pipet pistonu hareket ettirin. </li><li> Doku, tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış sonra, 216 x g&#39;de 5 dakika boyunca 5 ml astrosit orta ve santrifüj ekleyin. </li><li> Elde edilen pelet dikkatlice süpernatant aspirat ve 1 mL astrosit ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> 9 ml astrosit ortamı (1.2) ile doldurulan T75 balonlarına hücre süspansiyonları ekleyin. </li><li> % 6 hacim / hacim CO2 varlığında, bir inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. 4 gün sonra, (ilk tam orta değişikliği gerçekleştirmek10 mL) eklenmiştir. 3 D - Daha sonra, kültür ortamı, her 2 değiştirin. </li><li> Hücreler konfluent tek tabaka oluşmuş varsa 7 gün sonra kontrol edin. Kültürün tam izdiham ulaşılana kadar 3 gün - Değilse, başka bir 2 için bekleyin. NOT: Astrositler büyük düzleştirilmiş hücre gövdeleri görüntülemek şişenin dibinde lokalize ve önemli hücresel süreçleri ortaya çıkmaz. Onlar tek tabakalı 17 üstünde bulunan küçük faz-kontrast parlak progenitör hücreler ve mikroglia farklıdır. </li><li> sırayla progenitör hücrelerin kurtulmak ve saf astrosit kültürü elde, bir orbital çalkalayıcı üzerinde T75 şişeler yerleştirmek ve 250 rpm&#39;de kültürleri O / N sallamak. Sıcaklık, 37 ° C arasında ve şişeye filtre CO2 buharlaşmasını önlemek için laboratuar tipi film ile kapatılmış olduğundan ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> Sonraki gün, Elimina 20 uM sitosin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) ile doldurulan 10 ml taze kültür ortamı aspire orta ekleyinte kalıntı bölünen hücreler. Not: 2 araC inkübasyon - 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 3 gün,% 6 CO2 saf astrosit kültürü ile sonuçlanacaktır. </li><li> ışık mikroskobu altında görsel inceleme ile astrosit kültürlerinin saflığı izleyin. Artık faz-kontrast parlak progenitör hücrelerin ve mikroglia hala astrositik tek tabakalı 17 üstünde bulunuyorsa, tekrar 1.18 ve 1.19 adımları (adım 1.16 bakınız). Not: konfluent ve saf astrosit mono tabakalar bir sonraki aşamaya geçmeden önce inkübatör içerisine 14 D (37 ° C,% 6 hacim / hacim CO2) muhafaza edilebilir. orta yarısı her 3 d değiştirin. Bu hücreler depolama prosedürü yoluyla nöronal destekleyici özelliklerini kaybeder olarak, toplamak, dondurma ve astrositler çözülme etmeyin. </li></ol> Dolaylı kokültürü 2. hazırlanması Astrositler Not: 48-72 saat cel nöronların transfer astrositler hazırlamadan öncel-kültür ekleri. Genel olarak, tek bir T75 şişesi bir preparat elde nöron hücreleri desteklemek için yeterli hücre sayısını verir. <ol><li> 24-iyi-tabak içine gerektiği kadar ekler yerleştirin. Ceket, 37 ° C&#39;de yaklaşık 1 saat boyunca 10 ug / ml PDL (hücre kültürü dereceli su içinde çözülmüş) ile birlikte her bir delik,% 6 hacim / hacim CO2. İnkübasyondan sonra, PBS ile iki kez uçlar yıkayın. Bu arada, astrositler hazırlanması devam edin. Not: astrosit hücre süspansiyonu kullanıma hazır olana kadar, PBS ile doldurulmuş uçlar tutulabilir. </li><li> (AraC) ile astrosit orta aspire ve kalan serum kaldırılır sağlamak için 10 ml PBS ile bir kez kültür yıkayın. </li><li> Şişelere% 0.05 tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit), 3 ml ilave edilir ve yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de,% 6 hacim / hacim CO2 de trypsinization hücreleri inkübe edin. </li><li> Bir mikroskop ve facilita kullanarak görsel muayene ile hücre dekolmanı kontrolMasaüstünde karşı matara yan dokunarak hücrelerin dekolmanı te. NOT: 2.5 Adımları - 2.8 kritik ve 15 içinde bitmiş olmalıdır - 20 dakika. </li><li> Tripsinizasyonu takiben hafifçe 7 ml astrosit orta hücrelerin yeniden askıya ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. 216 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Süpernatantı dikkatlice aspire ve 1 mL astrosit ortamında hücre pelletini. </li><li> Bir sayma odacığı kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 500 uL astrosit ortam maddesi ile 24 oyuklu plaka deliklerinin taban doldurun ve her bir ekin içine 500 uL astrosit ortamı içinde 25,000 hücre transfer edin. 37 ° C&#39;de,% 6 hacim / hacim CO2 de kültür inkübe edin. NOT: 42 Sonra - 72 saat kültürleri yaklaşık% 100 izdiham ulaşacaktır. Bu aşamada kültür saflığı 11 immunositokimya ile doğrulanabilir. konfluen kültürlerin geçmeden kadar 7 gün boyunca muhafaza edilebilirSonraki adım. orta yarısı her 3 d değiştirin. </li></ol> Birincil hippokampal nöronlar 3. hazırlanması Not: Birincil fare hipokampal nöronları E15.5 elde edilmelidir - zamanlanmış gebe farelerin E16 embriyoların. <ol><li> W /% 0.6 nöron ortamı (10 mM sodyum piruvat ile MEM,% 0.1 w / v ovalbümin,% 2 hacim / hacim olarak B27 ortamı takviyesi ve% 0.1 v / v gentamisin (steril filtre edildi)), ve hazırlama ortamı (HBSS hazırlanması h glukoz ve 10 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin etansülfonik asit)). Pre-sıcak ve önceden dengeye 37 ° C&#39;de,% 6 hacim / hacim CO2 filtre şişelerinde nöron orta. </li><li> 24 kuyulu plakalara ait kuyucuklar içerisine cam lamelleri (12 mm çapında) yerleştirilir (hücre kültürü ekler ile kullanım için çentiklenir özel lamelleri kullanımı). <ol><li> 37 ° C&#39;de su (hücre kültürü dereceli) 15 ug / mL poli-DL-ornitin ile en az 1 saat boyunca kaplayın. sağlamak için oyuk başına en az 500 ul kullanınlamelleri tamamen kaplıdır. PBS ile iki kez kuyu yıkayın. hücreleri kaplama kadar kuyu PBS bırakın. kuyu kurumaz emin olun. </li></ol></li><li> Hippocampi incelemek için, hazırlık ortamı ile doldurulmuş 3x 10 cm yemekleri ve 1 mL hazırlık ortamı ile 1x 2 ml tüp hazırlayın. makas ve 2 ince forseps hazırlayın. </li><li> , Servikal dislokasyon ile hamile fare Kurban% 70 v / v etanol ile yıkanarak karın sterilize ve keskin bir makas kullanarak karın açın. makasla dikkatlice boncuklu rahim tüketim ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 1x 10 cm çanak içine organı aktarın. </li><li> Sonra, rahim embriyolar kaldırmak. Dikkatle rahim insizyon ve 2 forseps kullanarak embriyolar zarar vermeden amniyon çıkarın. Bundan sonra, bir makas ile her bir embriyo başını kesmek ve hazırlık ortamı ile birlikte ikinci bir 10 cm çanak içine başlarını aktarın. </li><li> HAZIRLIK benzer kafaları hazırlanması (devam edin1.7) - asyon 1.4 tarif. <ol><li> forseps bir çift ile baş hareketsiz ve Neuraxis dik Beyin yakın boyun bölgesinde kafatası ve cilt, insizyon. böylece beyin açığa kafatası ve kaplama cilt hem kaldırın ve baş rostral sonuna doğru yumuşak kafatası kap bükmek için forseps ikinci bir çift kullanın. </li><li> 2 forseps yardımıyla, kafatası boşluğunda beyin ayırın. Bu forseps, 1 yakın çift yapmak ve koku ampuller başlayan ve Beyin doğru hareket kafatası beyin ayırmak için. Hazırlık ortamı ile dolu başka bir 10 cm&#39;lik çanak içinde beyinleri toplayın. </li></ol></li><li> astrosit hazırlanması (adım 1.6) için yukarıda tarif edildiği gibi korteks parçalarının hippocampi teşrih. Her yarımkürede hippocampi çıkarın ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 2 ml tüp onları toplamak. </li><li> diseksiyon tamamladıktan sonra, steril bir laminer akış tezgah ve Diges tüp transferi1 ml Sindirim solüsyonu papain içeren hipokamp dokusunda t. Adım 1.9 açıklandığı gibi sindirim çözüm hazırlayın - 1.10 ama MEM yerine DMEM kullanın. NOT: 3.9 Adımları - 3.12 kritik ve 10 içinde tamamlanması gerekmektedir - 15 dakika. </li><li> sindirim tamamlandıktan sonra, dikkatlice bir pipet ile hafif bir emme yoluyla sindirim çözümü çekme. </li><li> ardışık olarak ilave edilmesi ve daha sonra dikkatli bir şekilde, yıkama döngüsü başına 1 ml taze kültür ortamı aspire hippocampi nöron ortamı ile 3 kez yıkayın. hücre süspansiyonu santrifüj etmeyin. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, dikkatli bir şekilde 1 mL nöron ortam içinde doku Karışım. </li><li> Bir sayma odacığı kullanılarak hücrelerin sayısı ve 24 oyuklu bir plaka (3.2 belirtilen plaka) tek bir oyuk başına 500 uL nöron ortamı içinde 35,000 hücre plaka. Not: İsteğe bağlı olarak, hücre tümböleni hücre hazırlama canlılığını değerlendirmek için tripan mavisi ile zıt olabilir. Görsel kontrol ile kaplama yoğunluğunu kontrol(- Standart 10X objektif görme alanı başına 110 hücreleri genellikle 90) iyon mikroskobu kullanılarak. </li><li> 37 ° C&#39;de, 1 saat boyunca% 6 hacim / hacim CO2 inkübatörde yer nöronlar. </li><li> , Inkübasyon yayınla hazırlanan ekler almak kuluçka (birleşen astrosit mono tabakaları ile tohumlanmış) (adım 2.8 bakınız). astrosit orta aspire ve 500 ul taze nöron ortamı ile değiştirerek orta alışverişinde bulunurlar. NOT: ekler 2&#39;den sonra birleşik astrosit tek tabakaları liman olmalıdır - 3 DIV (İn Vitro Gün). </li><li> dikkatle steril forseps kullanarak nöron kültürleri (3.13 adım) ihtiva kuyulara astrositler ile ekler yerleştirin. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 6 hacim / hacim CO2 geri inkübatöre elde dolaylı nöron astrosit kokültürü yerleştirin. NOT: Bu koşullar altında, nöronlar tam olarak tanımlanmış ortam içinde 4 hafta için yetiştirilebilir. Hiçbir orta değişikliği gerekli. Uzun süre kültürleri için, e doldurmak için tavsiye edilir24 oyuklu bir plaka buharlaşmayı azaltmak için steril su ile mpty kuyu. </li><li> Gerçekleştirmek in vitro hücre analizleri sonra kültür dönemleri istenen (örneğin, immünsitokimya, PCR, Western Blot, elektrofizyolojik kayıtlar (yama kelepçe veya multielectrode dizi) için) 7,15,18. NOT: kültür sistemi, aynı zamanda kültürler 11 akut ve kronik farmakolojik tedavisi için uygundur. </li></ol>

<ol>
	<li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes,+from+brain+glue+to+communication+elements:+the+revolution+continues.">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li><li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic-neuronal+crosstalk:+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury.">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li><li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons.">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li><li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets.">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li><li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity:+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny.">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1 (2011).</li><li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons.">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li><li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays.">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li><li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis.">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li><li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth.">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li><li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC.">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li><li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay.">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+synaptic+transmission:+astrocytes+rule!.">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!.</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li><li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity:+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets.">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons.">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function.">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li><li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling:+synaptic+functions+and+targets.">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li><li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).</li><li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse.">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Paylaşılan ortamda bunları korurken mevcut protokolün temel amacı, tamamen ayrı nöronal ve astrositik kültürler etmektir. Bu nedenle, elde edilen kültürlerin saflığı prosedürü başlangıcında kontrol edilmelidir. Biz nöronal belirteç olarak nöron-spesifik tubulin, nörofilament veya Neun proteininin kullanılmasını tavsiye, GFAP astrositik işaretleyici olarak, oligodendrosit öncüsü işareti ve Iba1 protein olarak O4 antijen mikroglia tanımlamak için. protokol krit...

Geçtiğimiz yıllar içinde, nöroglia fonksiyonunun genel yorumlama nöronal fonksiyonu 1 ile ilgili aktif bir düzenleyici rolüne yönelik bir sadece destekleyici bir atıf dönüşmüştür. Çünkü sağlık ve hastalık 2 beyin homeostazisi üzerindeki belirgin etkisi, astrositler bilimsel topluluk için özel bir öneme sahiptir. Son birkaç yıl içinde, çalışmalar çeşitliliği in vivo ve in vitro 3 nöron-glia etkileşimlerine odaklanmıştır. Ancak, kültür sistemlerinin çoğu, her iki hücre tiplerinin ayrı bir analiz için ve ilgili secretomes arasında izin vermez. Çeşitli yaklaşımlar uzun ömürlü sağkalım ve fizyolojik ilgili nöronal ağ geliştirme 4-6 ulaşmak için nöronların ve glia doğrudan kültürleştirilmeye istifade eder. Fiziksel olarak 7 ayrı iki hücre tipleri tutarken mevcut protokol aynı hedefleri ulaşır. conditione karşılaştırıldığındad orta sistemimiz nöronlar ve astrositler arasındaki çift yönlü iletişimi çalışma sağlar, 8,9 yaklaşır. Hücreler paylaşılan ortam içinde olgunlaşmak ise salgılanan sinyal molekülleri ekspresyonu izlenebilir. Astrositler ve böylece sinir hücresi büyümesini düzenleyen, sitokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı matris moleküllerinin 10,11 gibi çözünür faktörlerin, serbest ve 7,12 fonksiyonu olarak fırsat ilişkindir. Nedenle, in vitro olarak, retinal bez hücrelerin trombospondin eklenmesi sinaps 13 oluşumunu uyardığını ortaya konmuştur. Bununla birlikte, diğer henüz bilinmeyen faktörler 13 fonksiyonel sinaps oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, astrositler tarafından yayımlanan moleküller nöron glia etkileşimleri temelini anlamak için tespit edilmelidir. Fare ve sıçan primer nöron ve astrositler ekimi önce 14-16 tarif edilmiştir. buradadolaylı kokültürünün yaklaşımla hem hücre tipleri birleştirmek için zarif ve çok yönlü bir araç sunuyoruz. iki kültür fiziksel ama aynı ortam, nöronlar, astrositler ve çözünür moleküllerin etkisi, dövme ayrılmış olması nedeniyle, ayrıca bu şekilde nöron glia etkileşim çalışmaları için güçlü bir araç sunar analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture-grade water</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&amp;#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>CAUTION: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&amp;nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>CAUTION: H317-334</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>CAUTION: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>self-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-wells-plate (for the&amp;nbsp; indirect co-culture)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Binocular</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST Dumont (#5)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips (12&amp;nbsp;mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&amp;auml;ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tube (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Syringe-driven filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>pipette (1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile work bench</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>tube (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>Water bath type 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

Uygun nöronal gelişim ve fonksiyon gelişen ve yetişkin beyin ön koşuldur. Bununla birlikte, kompleks nöronal ağların son derece kontrollü oluşumu ve bakım altında yatan mekanizmaları tam bugüne kadar anlaşılamamıştır. Sağlıkta ve hastalıkta nöronlar ile ilgili açık sorular insan ile ilgili patolojiler, örneğin, Alzheimer hastalığı ve Şizofreni soruşturma temel gelişmeyi anlamaktan çeşitli ve kapsamlıdır. Nöronların en ayrıntılı analizi, in vitro olarak yapılabilir. Ancak, nöronlar hücreleri talep ve uzun vadeli hayatta kalmak için astrositlerin ek desteğe ihtiyacı vardır. Bu hücresel heterojenlik nöron ve astrositlerin analizini incelemek amacıyla çelişmektedir. Fiziksel olarak ederken, aynı burada kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam paylaşan saf birincil nöronlar ve astrositler, uzun süreli birlikte yetiştirme için izin veren bir hücre kültürü tahlil mevcutayrıldı. Bu ayarda, kültürler en fazla dört hafta boyunca hayatta ve tahlil nöron glia etkileşimine ilişkin araştırmaların bir çeşitlilik için uygundur.

Dolaylı Coculture sistemiyle nöronal kültürler analizi çok yönlü ve kültür olgunlaşma farklı aşamalarında gerçekleştirilebilir. Hücrede 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir olması kültürlerin uzun dönem araştırmalar mümkündür. Şekil 1 orta sol panelde şematik birlikte üretim kurulumunu göstermektedir. astrosit tek katmanlı (üst sol panel) ve nöronal ağın (sol alt panel) faz kon...

Watch this Scientific Journal Video about The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions at JoVE.com

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K Görüntüleme.  Ruhr-University.  Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar. 

Video: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Nörobilim

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Gelişim Biyolojisi

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

 CNS Etkileşim Çalışmaları için Primer Mikroglia ve Nöron Ko-Kültür Protokolü

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği