The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Os experimentos com camundongos estavam em conformidade com a Lei alemã e da Sociedade Alemã de diretrizes neurociência da criação de animais. As comissões de cuidados de animais e utilização do Bochum Ruhr-University concederam as licenças apropriadas. 1. Preparação e Cultivo de Cortical astrócitos Nota: Conclua estas etapas do protocolo, pelo menos, 7 d antes de prosseguir para as próximas etapas, como as culturas de astrócitos devem desenvolver em monocamadas confluentes antes que os neurônios estão preparados. astrócitos primários são derivados de culturas gliais mistos obtidos a partir de filhotes de rato ao redor dia pós-natal (P) 0-3. Três cérebros (6 córtices) por frasco T75 são para ser usados. <ol><li> Prepara-se o meio de astrócitos, completando de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro de v / v de cavalo e 0,1% v / v de gentamicina sob condições estéreis. Armazenar o meio a 4 ° C durante até 2 semanas. </li><li> Brasão 3x T75 frascos with 10 ug / ml de poli-D-lisina (PDL; em água-cultura de grau célula) durante pelo menos 1 h a 37 ° C na presença de 6% v / v de CO2. Após o revestimento, os frascos de lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover catiões não ligados, e adicionar 9 ml de meio de astrócitos. </li><li> Para a preparação dos cérebros, adicionar Solução Salina Equilibrada de Hank 10 ml (HBSS) para 1x 10 centímetros de Petri e 1 ml de HBSS a 1 x 15 mL tubo (independentemente do número de cérebros que vai ser utilizado). Manter um par de tesouras cirúrgicas, 2 pinça fina e um binóculo ao alcance para o procedimento. </li><li> Decapitar 3 filhotes rapidamente com as tesouras cirúrgicas e recolher as cabeças em um vazio placa de 10 cm. <ol><li> Realizar a preparação dos córtices sob a binocular. Utilizando duas pinças finas, remover a pele dorsal a partir do crânio na linha mediana, a partir do pescoço para cima em direcção ao nível dos olhos. Depois disso, o cérebro com os seus vasos sanguíneos é visível sob o crânio. </li><li>Fixar a cabeça na extremidade rostral com um par de fórceps e inciso linha média do crânio, começando na extremidade posterior. Posteriormente, cortaria a direita e as metades esquerda do crânio para expor o cérebro. </li><li> Fechar a ponta do fórceps e posicioná-lo sob ventral do cérebro. Levantar o cérebro fora do crânio e transferi-lo para o HBSS-cheia 10 centímetros de Petri. Proceda da mesma forma com o modelo restantes até que todos os cérebros são recolhidas no prato. </li></ol></li><li> Após a coleta dos cérebros, comece com a separação dos córtices por beliscar fora da parte posterior do cérebro usando um par de fórceps, como um par de tesouras. Executar uma incisão na linha média entre os dois hemisférios com um par de pinças. Cuidadosamente corrigir o cérebro com uma pinça e cortar o mesencéfalo e os bulbos olfatórios utilizando uma segunda pinça para acabar com as metades corticais. </li><li> Fix metade cortical com um par de fórceps e descascar as meninges dos hemisférios destacando-los from a aresta lateral e, subsequentemente, puxando-os da superfície cortical utilizando uma segunda pinça. </li><li> Virar o meia cortical com a sua superfície orientada para baixo para o prato; dissecar cuidadosamente e remover o hipocampo em forma de crescente, usando um par de fórceps. Transfira os córtices individuais dentro do tubo cônico de 15 mL usando uma pinça fechadas para realizar um córtex individual. </li><li> Depois de recolher todos os córtices, o trânsito para a capela de fluxo laminar estéril e começar com os preparativos para a dissociação do tecido cortical. </li><li> Adicionar 1 ml de DMEM a um tubo de reacção de 2 mL e adicionar 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar a suspensão num banho de água a 37 ° C até que uma solução clarificada desenvolve (cerca de 3 min). Adicionar 0,24 mg / mL L-cisteína e 20 ng / mL DNAse e agitar suavemente. NOTA: Para a digestão, aproximadamente, 1 mL de solução de enzima é necessária. </li><li> Filtro (0,22 mM tamanho dos poros) para obter uma solução estéril mL antes de adicionar-lo para o tecido cortical. Incubar os tubos durante 30 minutos - 1 hora a 37 ° C (ou seja, em um banho de água). NOTA: As etapas 1,11-1,14 são críticos e devem ser concluídas dentro de 15 min. </li><li> Para terminar a reacção de digestão, adicionar um meio de astrócitos mL e tritura-se cuidadosamente o tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 mL. Para trituração, e mover-se suavemente o êmbolo da pipeta, aspirando assim, e extrusão da suspensão de tecido cortical. </li><li> Uma vez que o tecido foi dissociado para uma suspensão de uma única célula, adicionam-se 5 mL de meio de astrócitos e centrifugar durante 5 minutos a 216 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante com cuidado a partir do sedimento resultante e voltar a suspender as células em um meio de astrócitos mL. </li><li> Adicione as suspensões de células para frascos T75 reabastecidos com 9 meio de astrócitos mL (ver 1.2). </li><li> Incubar as células a 37 ° C na incubadora, na presença de 6% v / v de CO2. Após 4 d, realizar a primeira mudança meio completo (10 mL). Depois disso, mudar o meio de cultura a cada 2-3 d. </li><li> Após 7 d, verificar se as células formaram uma monocamada confluente. Se não, esperar durante mais de 2 - 3 dias até confluência completa da cultura é atingido. NOTA: Os astrócitos exibir grandes corpos celulares achatados, localizar-se no fundo do frasco e não se desenvolvem os processos celulares notáveis. Eles diferem das pequenas células progenitoras brilhantes de contraste de fase e a microglia que residem no topo da monocamada de 17. </li><li> A fim de se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos pura, coloque os frascos T75 em um agitador orbital e agitar as culturas O / N a 250 rpm. Certifique-se de que a temperatura é ajustada a 37 ° C e que o filtro do balão é selada com filme de laboratório para evitar a evaporação do CO 2. </li><li> No dia seguinte, Aspirar o meio e adicionar meio de cultura de 10 mL fresco reabastecido com 20 uM citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas em divisão residuais te. NOTA: incubação com AraC para 2-3 d na incubadora a 37 ° C, 6% de CO 2 vai resultar em uma cultura de astrócitos puro. </li><li> Monitorar a pureza das culturas de astrócitos por inspecção visual ao microscópio de luz. Se residual de contraste de fase de células progenitoras brilhante e microglia ainda residem no topo da monocamada astrocitária 17 (veja o passo 1.16), repita os passos de 1,18 e 1,19. NOTA: O confluente e monocamadas de astrócitos puros pode ser mantido durante até 14 d na incubadora (37 ° C, 6% v / v de CO2) antes de prosseguir para o próximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d. Não coletar, congelar e descongelar os astrócitos, uma vez que estas células irão perder as suas propriedades favoráveis ​​neuronais através do procedimento de armazenamento. </li></ol> 2. Os astrócitos preparando para o Coculture indireta Nota: 48 - 72 h antes de preparar os neurônios, astrócitos transferência para o celinserções l-cultura. Geralmente, um único frasco T75 proporciona um número suficiente de células para suportar as culturas neuronais obtidos com uma preparação. <ol><li> Coloque como muitos inserções conforme necessário para 24 poços placas. Revestimento cada inserção com 10 ug / mL PDL (dissolvido em água de grau de cultura de células) durante cerca de 1 h a 37 ° C, 6% v / v de CO2. Após a incubação, as inserções de lavar duas vezes com PBS. Nesse meio tempo, prosseguir com a preparação de astrócitos. NOTA: As inserções cheias com PBS pode ser mantido até que a suspensão de células de astrócitos está pronto para uso. </li><li> Aspirar o meio do astrócito (com AraC) e lava-se a cultura de uma vez com 10 mL de PBS para garantir qualquer soro residual é removido. </li><li> Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) aos frascos e incubar as células durante tripsinização a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante cerca de 10 min. </li><li> Controlar a separação celular por inspeção visual usando um microscópio e Facilitate o descolamento das células tocando no lado dos frascos contra a área de trabalho. NOTA: As etapas 2,5-2,8 são críticos e deve ser concluído dentro de 15 - 20 min. </li><li> Após o tratamento com tripsina, gentilmente re-suspender as células em meio de astrócitos 7 mL e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL. Centrifugar durante 5 minutos a 216 x g. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 mL de meio de astrócitos. </li><li> Contar as células utilizando uma câmara de contagem. </li><li> Encha o fundo das cavidades da 24 poços da placa com meio de astrócitos 500 uL e transferir 25.000 células em meio de astrócitos 500 ul em cada inserção individual. Incubar a cultura a 37 ° C, 6% v / v de CO2. NOTA: Depois de 42-72 h as culturas irá atingir cerca de 100% de confluência. Nesta fase, a pureza da cultura pode ser verificada por meio de imunocitoquímica 11. As culturas confluentes podem ser mantidos durante até 7 d até se proceder àpróximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d. </li></ol> 3. Preparação de primário neurônios do hipocampo Nota: os neurônios do hipocampo de rato primária deve ser derivado de E15.5 - embriões E16 de ratos grávidas cronometrados. <ol><li> Preparar o meio neuronal (MEM com piruvato de sódio 10 mM, 0,1% w / v de ovalbumina, 2% v / v de suplemento de meio B27, e 0,1% v / v de gentamicina (filtrado estéril)), e meio de preparação (HBSS com 0,6% w / v de glucose e 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-etanossulf único piperazina)). Pré-aquecido e pré-equilibrar a forma neurónio em frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v de CO2. </li><li> Coloque as lamelas de vidro-(12 mm de diâmetro) para os poços de 24 poços-placas (use as lamelas especiais, que são entalhadas para o uso com inserções de cultura de células). <ol><li> Revestimento durante pelo menos 1 h com 15 ug / ml de poli-DL-ornitina em água (cultura celular de grau) a 37 ° C. Use pelo menos, 500 uL por poço para assegurar queas lamelas estão completamente cobertos. Lavar as cavidades duas vezes com PBS. Deixar o PBS nos poços até plaqueamento das células. Certifique-se de que os poços não sequem. </li></ol></li><li> Para dissecar os hipocampos, prepare 3x 10 cm pratos cheios com meio de preparação e 1x tubo de 2 mL com um meio de preparação mL. Prepare uma tesoura e 2 pinça fina. </li><li> Sacrificar o mouse grávida por deslocamento cervical, esterilizar o abdómen por lavagem com 70% v / v de etanol, e abrir o abdômen usando uma tesoura afiada. Excisão do útero frisado cuidadosamente com uma tesoura e transferir o órgão em 1x placa de 10 cm cheios com meio preparação. </li><li> Em seguida, retire os embriões do útero. Cuidadosamente inciso do útero e remover a membrana amniótica sem prejudicar os embriões usando 2 fórceps. Em seguida, decapitar cada embrião com um par de tesouras e transferir as cabeças para uma segunda placa de 10 cm com meio de preparação fornecido. </li><li> Prosseguir com a preparação das cabeças (semelhante ao preparção descrita em 1,4-1,7). <ol><li> Imobilizar a cabeça com um par de pinças e incisão no crânio e a pele na região do pescoço próximo da parte posterior do cérebro, perpendicular ao neuroeixo. Usar um segundo par de fórceps para levantar tanto crânio e cobrindo a pele, e dobrar o gorro macio para a extremidade rostral da cabeça, expondo assim o cérebro. </li><li> Com a ajuda de uma pinça 2, retire o cérebro da cavidade craniana. Para fazer isso, par próximo 1 de fórceps e separar o cérebro do crânio começando pelos bulbos olfatórios e se movendo em direção à parte posterior do cérebro. Recolher os cérebros em outra placa de 10 cm cheios com meio preparação. </li></ol></li><li> Dissecar a hipocampos a partir das porções do córtex, tal como descrito acima para a preparação de astrócitos (passo 1.6). Remova o hipocampo de cada hemisfério e recolhê-las no tubo de 2 mL cheio com meio de preparação. </li><li> Depois de completar a dissecção, transferir o tubo para o banco de fluxo laminar estéril e Digest o tecido do hipocampo com uma solução de digestão mL contendo papaína. Preparar a solução de digestão tal como descrito no passo 1,9-1,10, mas em vez disso utilizar MEM DMEM. NOTA: os passos 3,9-3,12 são críticos e devem ser concluídas dentro de 10 - 15 min. </li><li> Após a conclusão da digestão, retirar-se cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta. </li><li> Lave o hipocampo 3 vezes com meio neurônio adicionando sequencialmente e, posteriormente, aspirando cuidadosamente 1 mL meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Não centrifugar a suspensão de células. </li><li> Após o passo de lavagem final, tritura-se cuidadosamente o tecido em 1 ml de meio neuronal. </li><li> Contar as células utilizando uma câmara de contagem e a placa 35.000 células em 500 uL de meio por neurónio um único poço de uma de 24 cavidades de placa (a placa mencionado em 3.2). NOTA: Opcionalmente, uma alíquota de células podem ser contrastadas com azul de tripano para avaliar a vitalidade da preparação celular. Controlar a densidade de revestimento por inspecionar visuaisiões utilizando o microscópio (tipicamente 90 - 110 células por campo visual de um objectivo padrão 10X). </li><li> Neurónios colocar no incubador a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante 1 h. </li><li> Publique incubação, tomar as inserções preparados (semeada com monocamadas confluentes de astrócitos) para fora da incubadora (veja o passo 2.8). Trocar o meio por aspiração do meio astrócitos e substituí-lo com 500 ul fresco neurônio médio. NOTA: As inserções devem abrigar monocamadas de astrócitos confluentes após 2-3 DIV (dias in vitro). </li><li> Coloque as inserções com astrócitos com cuidado para os poços que contêm as culturas de neurônios (passo 3.13) usando uma pinça estéril. </li><li> Coloque a co-cultura de neurónios-astrócitos indirecta resultante de volta na incubadora a 37 ° C, 6% v / v de CO2. Nota: Sob estas condições, os neurónios podem ser cultivada por até quatro semanas em meio completamente definido. Nenhuma mudança médio é necessário. Para as culturas de longa data, recomenda-se a encher eMtpa poços com água estéril, a fim de reduzir a evaporação a partir da placa bem-24. </li><li> Execute in vitro de células análises após períodos de cultura desejada (por exemplo, por imunocitoquímica, PCR, Western Blot, registros eletrofisiológicos (patch clamp ou matriz multieletrodo)) 7,15,18. NOTA: O sistema de cultura também é adequado para o tratamento farmacológico aguda e crónica das culturas 11. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O principal objetivo do protocolo atual é a de culturas neuronais e astrócitos completamente separadas, mantendo-os em meio compartilhado. Por esta razão, a pureza das culturas obtidas deverá ser verificada no início do procedimento. Recomendamos o uso de neurônio-específica tubulina, neurofilaments ou proteína NeuN como marcadores neuronais, GFAP como marcador de astrócitos, o antígeno O4 como marcador precursor oligodendrócitos e proteína Iba1 para identificar microglia. Preste...

Ao longo das últimas décadas, a interpretação geral da função neuroglia evoluiu a partir da atribuição de um apoio meramente no sentido de um papel regulador activa a respeito da função neuronal 1. Por causa de seu impacto importante na homeostase cerebral na saúde e na doença 2, os astrócitos são de especial interesse para a comunidade científica. Nos últimos anos, uma diversidade de estudos concentraram-se em interacções neurónio-glia in vivo e in vitro 3. No entanto, a maioria dos sistemas de cultura não permitem a análise em separado de ambos os tipos de células e de seus respectivos secretomes. Várias abordagens explorar o co-cultivo direta dos neurônios e da glia para alcançar a sobrevivência duradoura e de desenvolvimento da rede neuronal fisiologicamente relevante 4-6. O presente protocolo atinge os mesmos objetivos, mantendo ambos os tipos de células separadas fisicamente 7. Em comparação com conditioned média se aproxima de 8,9, o nosso sistema permite estudar a comunicação bidirecional entre neurónios e astrócitos. A expressão de moléculas de sinalização segregadas pode ser monitorizada, enquanto as células maturam no meio compartilhado. Esta possibilidade é especialmente relevante, tal como astrócitos libertam factores solúveis, tais como citoquinas, factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular 10,11, regulando desse modo o crescimento neuronal e função 7,12. Assim, foi demonstrado que a adição de trombospondina de células do gânglio retinal in vitro, induz a formação de sinapses 13. No entanto, outros fatores ainda desconhecidos são necessárias para tornar as sinapses funcionais 13. Além disso, as moléculas liberadas por astrócitos têm de ser identificados, a fim de compreender a base de interações neurônio-glia. A cultura de neurónios e astrócitos primários de ratinho e rato foi previamente descrito 14-16. Aqui nósapresentar uma ferramenta elegante e versátil para combinar ambos os tipos de células em uma abordagem co-cultura indirecta. Uma vez que as duas culturas são fisicamente separadas mas que partilham a mesma forma, o impacto de neurónios, astrócitos e as moléculas solúveis, podem ser analisados ​​separadamente, criando assim uma ferramenta poderosa para estudos de interacção Neuron-glia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

desenvolvimento neuronal adequada e função é o pré-requisito do desenvolvimento e do cérebro adulto. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação altamente controlada e manutenção de redes neuronais complexas não estão completamente compreendidos, até agora. As questões em aberto sobre neurônios na saúde e na doença são diversas e alcance da compreensão do desenvolvimento básico para investigar patologias relacionadas com humanos, por exemplo, doença de Alzheimer e esquizofrenia. A análise mais detalhada dos neurónios pode ser realizado in vitro. No entanto, os neurônios estão exigindo células e precisam do apoio adicional dos astrócitos para a sua sobrevivência a longo prazo. Esta heterogeneidade celular está em conflito com o objectivo de dissecar a análise de neurónios e astrócitos. Apresentamos aqui um ensaio de cultura de células que permite a co-cultura a longo prazo de neurónios e astrócitos primários puros, que partilham o mesmo meio definido quimicamente, sendo fisicamenteseparados. Nesta configuração, as culturas sobreviver por até quatro semanas e o ensaio é adequado para uma diversidade de investigações relativas a interação neurônio-glia.

A análise das culturas neuronais através do sistema de co-cultura indirecta é heterogénea e pode ser realizada em diferentes estágios de maturação da cultura. Devido ao facto de que as células podem ser mantidas durante até 4 semanas, as investigações a longo prazo das culturas são possíveis. O esquema no painel central esquerdo da Figura 1 demonstra a configuração de co-cultura. Com a utilizaç...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K visualizações.  Ruhr-University.  Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia. 

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Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

Investigação por imagem do cérebro os correlatos neurais da Observando Virtual Interações Sociais

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

Neurociência

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Investigação de imagens do cérebro do Efeito Memória de aumento da Emoção

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Investigação por imagem do cérebro o efeito prejudicial da emoção sobre a Cognição

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An

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