The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

<ol>
	<li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes,+from+brain+glue+to+communication+elements:+the+revolution+continues.">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li><li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic-neuronal+crosstalk:+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury.">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li><li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons.">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li><li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets.">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li><li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity:+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny.">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1 (2011).</li><li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons.">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li><li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays.">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li><li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis.">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li><li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth.">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li><li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC.">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li><li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay.">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+synaptic+transmission:+astrocytes+rule!.">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!.</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li><li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity:+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets.">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons.">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function.">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li><li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling:+synaptic+functions+and+targets.">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li><li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).</li><li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse.">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא תרבויות עצביות ו astrocytic נפרדים לחלוטין, תוך שמירה על אותם במדיום משותף. מסיבה זו, את הטוהר של תרבויות המתקבל צריך להיות מאומת בתחילת ההליך. אנו ממליצים על שימוש של טובולין נוירון ספציפי, neurofilaments או חלבון NeuN כמו סמנים עצביים, GFAP כסמן astrocytic, אנטיגן O4 כסמן מבשר oligodendrocyte ו Iba1 חלבון לזהות microglia. שים לב מיוחד בעת ביצוע שלב קריטי של הפרוטוקול, כפי שצוין על ידי &#39;הערה&#39; לפני תיאור הצעד. קח בחשבון כי הן התרבויות העיקריות של נוירונים האסטרוציטים הן די רגישות. לכן, כמה בעיות שעלולות להתעורר בתחילת ההליך. אם האסטרוציטים אינם מגיעים בשכבה ומחוברות ב T75 צלוחיות לאחר 10 DIV (סעיף פרוטוקול 1), לבדוק את הרכיבים של המדיום astrocyte (עבור תאריך תפוגה). בנוסף,להגדיל את כמות רקמת קליפת המוח מוכן ליזום את התרבות (עד 10 הקורטקס לכל בקבוק). אם האסטרוציטים אינם מגיעים בשכבה ומחוברת על מוסיף תרבית תאים לאחר 72 שעות (סעיף פרוטוקול 2), לבדוק את הרכיבים של מדיום astrocyte ו PDL (עבור תאריך תפוגה) .Try לצלחת החוצה תרבויות מוכנות טרי, לקבוע את שיעור קיימא תאים לפני ציפוי ולהתאים מספרים סלולריים בהתאם (למשל, להשתמש counterstaining trypan כחול). אם הישרדות נמוך של נוירונים מזוהה אחרי 24 שעות, רקמת ההיפוקמפוס לא triturated ובעדינות יתרה (שלב פרוטוקול 3.11) תשומת לב .Pay כדי למנוע היווצרות של בועות כאשר dissociating הרקמה. אם ההישרדות של נוירונים הוא הוריד באופן משמעותי לאחר 7 - 14 DIV ואם נוירונים ליצור אגרגטים של 3 - 5 תאים לאחר 7 DIV, השתמש מוכן מוסיף טרי עם האסטרוציטים, לבדוק טוהר astrocyte ידי immunocytochemistry, ולבדוק את המרכיבים בינוני נוירון. אם אגרגטים גדול של נוירונים (יותר מ -10 תאים) הוא נisible, יתכן כי רקמת ההיפוקמפוס לא triturated מספיק, וכתוצאה מכך ניתוק שלם (שלב פרוטוקול 3.11). שים לב ההומוגניות השעיה. אם התרבות העצבית היא מזוהם עם תאים שאינם עצביים (microglia, האסטרוציטים, תאים מבשרים oligodendrocyte, וכו &#39;), להסיר לחלוטין את רקמת קליפת המוח השכנה סמוכה בהיפוקמפוס (שלב 3.7) וגם לבדוק את הרכיבים הבינוניים נוירון. Coculture העקיף המוצע של הנוירונים עיקריים האסטרוציטים מספק כולים צדדיים לחקירה ארוכת הטווח של נוירון, גליה אינטראקציות. חשוב לציין, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד בתאי עכבר, אשר פותח פרספקטיבה ליישום מודלים גנטיים עכבר. בגלל ההפרדה הפיסית המלאה של 2 סוגי התאים, נוירונים האסטרוציטים של גנוטיפים ברורים ניתן לשלב בצורה הרצויה. בין מגוון של יישומים, גישה זו יכולה לשמש כדי INVestigate פיתוח רשתות עצביות, synaptogenesis, פעילות ברשת איתות astrocyte-נוירון. למרות cocultivation העקיף של נוירונים האסטרוציטים פותח הזדמנויות אדירות עבור ניתוח הפרדה שלהם ואיתות ארוך טווח, חוסר קשר ישיר עלול לפגוע בוויסות העדינה של פלסטיות הסינפטית 22. לפיכך, חוסר אינטראקציה בין בליטות astrocytic וסינפסות העצבית צריך להתייחס בזהירות בעת שימוש במודל זה. Assay הוא מבוסס על שני פרוטוקולים קודמים עבור astrocyte והכנות עצביות 14,17 ו שופר במהלך השנים האחרונות. הגישה במקור הוקמה לעכבר 7 וחולדה 11 תאים. פרסומים קודמים של המעבדה לספק אפיון מפורט של מבחני בנוגע הישרדות התא, היווצרות הסינפסה אפיון אלקטרו של תאים והתוצאה 7,11,15,18. יתר על כן, לאהוא assay ניתן להתאים הגדרות אחרות, כגון 7 מיקרו-אלקטרודות-מערכים (MEAs). ביישומים עתידיים, הקורא צריך לשקול פרוטוקולים אחרים עבור המחקר המפורט של תהליך היווצרות הסינפסה 23, כמו גם לניתוח MEA במבחנה. לסיכום, assay מספק כולים צדדיים למעבדות התמקדות בהיבטים שונים של אינטראקציות גליה נוירון.

במהלך העשורים האחרונים, הפרשנות הכללית של תפקוד תאי גלייה התפתחה מן הייחוס של תומכת רק לקראת תפקיד רגולציה פעיל בדבר עצבי פונקציה 1. בגלל ההשפעה הבולטת שלהם על הומאוסטזיס המוח בבריאות ובחולי 2, האסטרוציטים הם בעלי עניין מיוחד עבור הקהילה המדעית. בשנים האחרונות, מגוון של המחקרים התמקדו נוירון, גליה אינטראקציות in vivo ו במבחנה 3. עם זאת, רוב מערכות התרבות אינו מאפשרים הניתוח הנפרד של שני סוגי התאים ושל secretomes שלהם. גישות מספר לנצל את cocultivation הישיר של נוירונים גליה להשיג הישרדות לאורך זמן ופיתוח רשת עצבית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 4-6. הפרוטוקול הנוכחי מגיע את אותן מטרות, תוך שמירה על סוגי תאים הן מופרדות 7 פיזית. לעומת conditioneבינוני ד גישות 8,9, המערכת שלנו מאפשרת ללמוד את בתקשורת דו-כיוונית בין הנוירונים האסטרוציטים. הביטוי של מולקולות איתות מופרשים ניתן לנטר תוך התאים לְהַבשִׁיל במדיום המשותף. הזדמנות זה רלוונטית במיוחד, כמו האסטרוציטים לשחרר גורמים מסיסים, כגון ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות מטריקס 10,11, ובכך ויסות צמיחה עצבית ולתפקד 7,12. לפיכך, הוכח כי תוספת של thrombospondin לתאי הגנגליון ברשתית במבחנה גורם להיווצרות של סינפסות 13. עם זאת, אחרים עדיין גורמים לא ידועים נחוצים כדי להבהיר סינפסות 13 פונקציונלית. יתר על כן, מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים צריכות להיות מזוהות כדי להבין את הבסיס של נוירון, גליה אינטראקציות. הטיפוח של נוירונים עיקרי האסטרוציטים מעכבר והחולדה תואר בעבר 14-16. הנה אנחנולהציג כלי אלגנטים צדדי לשלב בין שני סוגי התאים בגישת coculture עקיפה. מאז שתי התרבויות מופרדים פיזית עדיין חולקים את אותו בינוני, ההשפעה של נוירונים, האסטרוציטים ומולקולות מסיסים, ניתן לנתח בנפרד, ובכך ליצור כלי רב עוצמה עבור מחקרים אינטראקציה נוירון, גליה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

התפתחות עצבית תקינה ותפקוד הוא התנאי ההכרחי של הפיתוח ו במוח הבוגר. עם זאת, המנגנונים להיווצרות מאוד מבוקר ותחזוקה של רשתות נוירונים מורכבות אינם מובנים לחלוטין עד כה. השאלות הפתוחות בנוגע נוירונים בבריאות ובחולי מגווני לכת להבנת ההתפתחות הבסיסית לחקירת פתולוגיות הקשורות אדם, למשל, מחלת אלצהיימר וסכיזופרניה. הניתוח המפורט ביותר של נוירונים יכול להתבצע במבחנה. עם זאת, נוירונים דורשים תאים זקוקים לתמיכה נוספת של האסטרוציטים להישרדות ארוכת הטווח. ההטרוגניות הסלולר זהו בסכסוך במטרה לנתח את הניתוח של נוירונים האסטרוציטים. אנו מציגים כאן assay תא-תרבות המאפשר cocultivation ארוכת הטווח של הנוירונים העיקריים טהור האסטרוציטים, אשר חולקים את אותה בינוני הגדרה כימית, בעת היותו פיזיתמופרד. במצב זה, התרבויות לשרוד במשך עד ארבעה שבועות assay הוא מתאים למגוון של חקירות לגבי האינטראקציה נוירון, גליה.

הניתוח של התרבויות העצביות באמצעות מערכת coculture העקיפה מגוון וניתן לבצעו בשלבים שונים של התבגרות התרבות. בשל העובדה כי התאים יכולים להישמר לתקופה של עד 4 שבועות, חקירות ארוכות טווח של התרבויות אפשריות. סכמטית בלוח השמאלי באמצע איור 1 מדגים את ההתקנה cocultivation. עם השימוש במערכת זו, הדמיה תא חי של סוגי תאים שניהם יכולים להתבצע, כפי שהודגם על ידי תמונות בניגוד שלב של monolayer astrocyte (בחלונית הימנית העליונה) ואת הרשת העצבית (הפאנל השמאלי התחתון). לאחר קיבוע, הערכת immunocytochemical אפשרית, כפי שמוצגת בפינה הימנית עליונה ופנלים ימניים תחתונים. נוירונים להתחיל להקים קשרים סינפטיים החל מ כ 7 DIV במודל שלנו (מידע לא מוצג). ב -14 DIV סינפסות מרובים נוצרות בתוך רשתות נוירונים, כפי שהוגדרו על ידי זיהוי immunocytochemical משולב של סמנים טרום postsynaptic (איור 1, פאנל מימין למטה). חשוב לציין, לא רק את הסכום של puncta סמן הסינפטי ניתן דמיין לכמת באמצעות גישה זו, אלא גם הסינפסות המבניות הושלם, אשר קרוב לוודאי לתרום קישוריות רשת. תרבויות astrocyte לא רק לספק תמיכה trophic לנוירונים 11, אלא גם לסנתז מספר גורמים המופרשים 19,20 מעורב פלסטיות עצבית. הביטוי של אחד מהגורמים הללו, כלומר מטריצה מטלו 2 (MMP2), בא לידי ביטוי בלוח הימני העליון של איור 1. מעניין לציין, כי 2-isoforms MMP2 הברור אותר מדיום coculture באמצעות כתם מערבי (איור 1, פנל מימין באמצע ). פוטנציאלי האסטרוציטים להפריש MMP2 לתוך היםבינוני hared, ובכך להשפיע על הפלסטיות של נוירונים. כמו כן isoforms המרובה של Tenascin-C, רגולטור ידוע של תולדה האקסון, נדידת תאים והתמיינות 21 זוהו. יחדיו, תוצאות אלה ממחישות שתי דוגמאות ובכך לספק הוכחה של עיקרון עבור המגוון של חקירות של האסטרוציטים, נוירונים ותקשורת הגומלין שלהם שיכולים להתממש בשיטת cocultivation העקיפה כפי שתתואר בהמשך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54757/54757fig1.jpg" /> . איור 1: המערכת העקיפה astrocyte-Neuron Coculture מאפשרת ניתוח נפרד של האסטרוציטים, נוירונים ומופרש מולקולריים מגשרי לוח למעלה, משמאל: monolayers טופס האסטרוציטים על הממברנה להכניס תרבית תאים, לעומת שלב; סרגל: 250 מיקרון פנל עליון, נכון:. כמוtrocytes הם immunostained עבור חלבון גליה חומציים סיבי (GFAP) (GA5 שיבוט העכבר) ומטריקס Metalloprotease 2 (MMP2) (ארנב polyclonal); סרגל:. 250 מיקרון לוח תיכון, לשמאל: את הערכה ממחישה את התקנת coculture העקיפה. למרות שתי תרבויות מופרדות פיזי, הם חולקים את אותה בינוני לוח תיכון, נכון:. שני מתווכים מולקולריים מופרשים של אינטראקציות גליה נוירון מתגלים במדיום שיתוף הטיפוח באמצעות כתם מערבי. . Isoforms המרובה של Tenascin C (TNC), רגולטור תולדה neurite, ו MMP2, צירוף תאי מטריקס, מתועדים פנל תחתון, לשמאל: הנוירונים עיקריים לפתח בזו קשר הדוק רשתות ב -14 היום ה טיפוח, לעומת שלב; . סרגל: 250 מיקרון הפאנל התחתון, נכון: החל 14 ד במבחנה, קשרים סינפטיים מרובים מבוססים בין נוירונים, כפי שזוהו על ידי תיוג immunocytochemical; סרגל: 50 מיקרון. שיתוף לוקליזציה של הסמן presynaptic בסון (ארנב polyclonal) עם חלבון פיגומים postsynaptic PSD95 (שיבוט העכבר 6G6-1C9) מתעד את היווצרות הסינפסות הושלמה מבחינה מבנית. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54757/54757fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions at JoVE.com

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K Views.  Ruhr-University.  פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות. 

Video: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

הדמיה מוחית של חקירה וקושרת עצבית של התבוננות אינטראקציות חברתיות וירטואליות

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

הדמיה מוחית חקירת אפקט זיכרון, שיפור של רגש

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

הדמיה מוחית חקירת אפקט פגיעה של רגש על קוגניציה

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...