The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Die Versuche mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht und der Deutschen Gesellschaft für Neurologie Leitlinien der Tierhaltung. Die Tierpflege und -nutzung Gremien der Ruhr-Universität Bochum haben die entsprechenden Genehmigungen erteilt. 1. Vorbereitung und Bearbeitung von kortikalen Astrozyten Hinweis: Führen Sie diese Schritte des Protokolls mindestens 7 d, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren, da die Astrozytenkulturen in konfluente Monolayer entwickeln sollten, bevor die Neuronen vorbereitet sind. Primäre Astrozyten aus gemischten Gliazellen Kulturen abgeleitet von Maus Welpen um postnatalen Tag erhalten (P) 0-3. Drei Gehirne (6 Rinden) pro T75-Flasche verwendet werden sollen. <ol><li> Bereiten Sie die Astrozyten Medium durch Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Pferdeserum und 0,1% v / v Gentamycin unter sterilen Bedingungen zu ergänzen. Speichern das Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li><li> Mantel 3x T75-Flaschen with 10 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL; in Zellkultur-grade Wasser) für 2 mindestens 1 h bei 37 ° C in Gegenwart von 6% v / v CO. Nach dem Auftragen waschen die Kolben zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ungebundene Kationen zu entfernen, und fügen Sie 9 ml Astrozyten Medium. </li><li> Für die Herstellung der Gehirne, mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 10 cm Petrischale und 1 ml HBSS auf 1x 15 ml-Röhrchen auf 1x (unabhängig von der Anzahl der Köpfe, die verwendet wird). Halten Sie eine chirurgische Schere, 2 feinen Pinzette und ein Fernglas griffbereit für das Verfahren. </li><li> Enthaupten 3 Welpen schnell mit den chirurgischen Schere und sammeln Sie die Köpfe in einem leeren 10-cm-Schale. <ol><li> Führen Sie die Vorbereitung der Rinden unter dem Binokular. Mit zwei feinen Pinzette, entfernen Sie die Rückenhaut vom Schädel an der Mittellinie von der Halsbereich ausgehend bis in Richtung der Höhe der Augen. Danach wird das Gehirn mit seinen Blutgefäße unter der Schädel sichtbar. </li><li>Befestigen Sie den Kopf am rostralen Ende mit einem Paar Zangen und einschneiden die Mittellinie des Schädels, der am hinteren Ende beginnen. Anschließend befestigen Sie den rechten und linken Hälften des Schädels, das Gehirn zu belichten. </li><li> Schließen Sie die Spitze der Zange und positionieren es ventral unter dem Gehirn. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und übertragen sie in die HBSS gefüllte 10 cm Petrischale. Gehen Sie auf die gleiche Weise mit den restlichen Probe, bis alle Gehirne in der Schale gesammelt werden. </li></ol></li><li> Nachdem die Gehirne zu sammeln, mit der Trennung der Rinden starten, indem Sie die Rautenhirns mit einer Zange wie eine Schere Abschnüren. Führen Sie einen Mittelschnitt zwischen den beiden Hemisphären mit einer Pinzette. Fix vorsichtig das Gehirn mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mittelhirns und die Riechkolben eine zweite Pinzette, um am Ende mit den kortikalen Hälften aus. </li><li> Fix eine kortikale Hälfte mit einer Zange und ziehen die Meningen von den Hemisphären durch Lösen sie fROM mit der Seitenkante und sie anschließend von der kortikalen Oberfläche ziehen eine zweite Pinzette. </li><li> Drehen Sie die kortikale Hälfte mit seiner Oberfläche in Richtung der Schale orientiert nach unten; sorgfältig sezieren und die sichelförmigen Hippocampus mit einer Pinzette entfernen. Übertragen Sie die einzelnen Rinden in den konischen 15 ml-Röhrchen eine geschlossene Zange mit einem individuellen Kortex zu tragen. </li><li> Nachdem alle Rinden, Transit in den sterilen Laminarströmungsabzug zu sammeln und mit den Vorbereitungen für die Dissoziation des Rindengewebe beginnen. </li><li> 1 ml DMEM in ein 2 ml Reaktionsgefäß und Zugabe von 0,1% w / v Papain (30 Einheiten). Inkubieren der Suspension in einem Wasserbad bei 37 ° C, bis eine geklärte Lösung (ca. 3 min) entwickelt. In 0,24 mg / ml L-Cystein und 20 ug / ml DNAse und leicht schütteln. HINWEIS: Für die Verdauung, ca. 1 ml Enzymlösung benötigt. </li><li> Filter (0,22 um Porengröße) zu erhalten 1 ml sterilen Lösung vor der Zugabees dem kortikalen Gewebe. Inkubieren der Röhrchen für 30 min - 1 h bei 37 ° C (dh in einem Wasserbad). Hinweis: Die Schritte 1,11-1,14 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein. </li><li> Um die Verdauung Reaktion zu beenden, 1 mL Astrozyten Medium und sorgfältig das verdaute Gewebe unter Verwendung einer 1 ml Pipette verreiben. Für Verreiben, sanft die Pipette Kolben bewegen, wodurch Ansaugen und die kortikale Gewebesuspension Extrudieren. </li><li> Sobald das Gewebe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert worden, 5 ml Astrozyten Medium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 216 x g. </li><li> Aspirieren der Überstand vorsichtig von der resultierenden Pellets und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium Astrozyten. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspensionen zu T75-Flaschen aufgefüllt mit 9 ml Astrozyten-Medium (siehe 1.2). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C im Inkubator in Gegenwart von 6% v / v CO 2. Nach 4 d, führen Sie das erste komplette Mediumwechsel (10 ml). d 3 - Danach wird das Kulturmedium alle 2 ändern. </li><li> Nach 7 d, prüfen Sie, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben. Wenn nicht, warten weitere 2 - 3 Tage bis zur vollständigen Einmündung der Kultur erreicht wird. HINWEIS: Astrozyten große abgeflachte Zellkörper anzuzeigen, am Boden des Kolbens lokalisieren und keine nennenswerten zelluläre Prozesse zu entwickeln. Sie unterscheiden sich von den kleinen Phasenkontrast hellen Vorläuferzellen und Mikroglia die sich auf der Oberseite des Monolayer 17. </li><li> Um die Beseitigung der Vorläuferzellen zu erhalten und eine reine Astrozyten Kultur, legen Sie die T75-Flaschen auf einem Orbitalschüttler erhalten und die Kulturen O / N bei 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Sicherzustellen , dass die Temperatur auf 37 ° C eingestellt wird und dass der Filter des Kolbens mit Laborfilm versiegelt 2 Verdampfen des CO zu verhindern. </li><li> Am nächsten Tag absaugen Medium und fügen Sie 10 ml frisches Kulturmedium ergänzt mit 20 &amp; mgr; M Cytosin-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) zu Eliminate Restteilender Zellen. HINWEIS: Inkubation mit AraC für 2 - 3 d in den Inkubator bei 37 ° C, 6% CO 2 wird in einer reinen Kultur von Astrozyten führen. </li><li> Überwachen Sie die Reinheit der Astrozytenkulturen durch visuelle Inspektion unter dem Lichtmikroskop. Wenn Restphasenkontrast heller Vorläuferzellen und Mikroglia noch 17 auf der Oberseite der astrozytären einschichtigen befinden (siehe Schritt 1.16), wiederholen Sie die Schritte 1.18 und 1.19. HINWEIS: Die konfluenten Monolayern und reine astrocyte kann für bis zu 14 d in den Inkubator (37 ° C, 6% v / v CO 2) vor dem Fortfahren mit dem nächsten Schritt beibehalten werden. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d. Sammeln Sie nicht, einfrieren und die Astrozyten auftauen, da diese Zellen ihre neuronalen unterstützende Eigenschaften durch den Speichervorgang zu verlieren. </li></ol> 2. Vorbereitung Astrozyten für die indirekte Cokultur Hinweis: 48 - 72 h, bevor die Neuronen, die Übertragung Astrozyten auf die cel Vorbereitungl-Kultureinsätzen. Im Allgemeinen liefert eine einzelne T75-Kolben eine ausreichende Anzahl von Zellen, die die neuronalen Kulturen mit einer Zubereitung erhalten zu unterstützen. <ol><li> So viele Einsätze nach Bedarf in 24-Well-Platten. Mantel jeder Einsatz mit 10 ug / ml PDL (gelöst in Zellkultur-grade Wasser) für etwa 1 h bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. Nach der Inkubation waschen die Einsätze zweimal mit PBS. In der Zwischenzeit gehen mit der Herstellung von Astrozyten. HINWEIS: Die mit PBS gefüllt Einsätzen gehalten werden kann, bis die Astrozyten Zellsuspension zur Verwendung bereit ist. </li><li> Saugen Sie das Astrozyten Medium (mit AraC) und waschen Sie die Kultur einmal mit 10 ml PBS jegliche restliche Serum entfernt wird, um sicherzustellen. </li><li> 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in den Kolben und Inkubieren der Zellen für Trypsinisierung bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für ca. 10 min. </li><li> Kontrolle der Zellablösung durch visuelle Inspektion mit Hilfe eines Mikroskops und facilitate die Ablösung der Zellen durch die Seite der Kolben gegen den Desktop tippen. Hinweis: Die Schritte 2,5-2,8 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 fertig sein - 20 min. </li><li> Nach der Trypsinisierung aussetzen erneut die Zellen vorsichtig in 7 ml Astrozyten Medium und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 216 x g. </li><li> aspirieren vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 1 ml Astrozyten Medium. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zählkammer. </li><li> Füllen Sie den Boden der Wells der 24-Well-Platte mit 500 &amp; mgr; l Astrozyten Medium und übertragen 25.000 Zellen in 500 &amp; mgr; l Astrozyten Medium in jedem einzelnen Einsatz. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. HINWEIS: Nach 42 bis 72 h die Kulturen ungefähr 100% Konfluenz erreichen. In diesem Stadium ist die Reinheit der Kultur kann durch Immunzytochemie 11 überprüft werden. Die konfluenten Kulturen können die bis fortfahren bis zu 7 d beibehalten werdennächster Schritt. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d. </li></ol> 3. Herstellung von primären Neuronen im Hippocampus Hinweis: Primäre Maus Hippocampus-Neuronen sollte von E15.5 abgeleitet werden - E16 Embryonen von timed schwangeren Mäusen. <ol><li> Bereiten neuron Medium (MEM mit 10 mM Natriumpyruvat, 0,1% w / v Ovalbumin, 2% v / v B27 Medium zu ergänzen, und 0,1% v / v Gentamicin (steril filtriert)), und Vorbereitungsmedium (HBSS mit 0,6% w / v Glucose und 10 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazin-ethansulfonsäure)). Vorwärmen und pre-äquilibriert das Neuron Medium in Saugflaschen bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. </li><li> Das Glas-Deckgläschen (12 mm Durchmesser) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten (verwenden, um die speziellen Deckgläsern, die für die Verwendung mit Zellkultureinsätze eingekerbt sind). <ol><li> Mantel für mindestens 1 h mit 15 &amp; mgr; g / ml Poly-DL-Ornithin in Wasser (Zellkultur-grade) bei 37 ° C. Verwenden Sie mindestens 500 &amp; mgr; l pro Vertiefung, um sicherzustellen,die Deckgläser vollständig bedeckt. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS. Lassen Sie die PBS in den Vertiefungen, bis die Zellen Plattierung. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen nicht austrocknen. </li></ol></li><li> Um die hippocampi sezieren, bereiten 3x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt und 1x 2 ml-Röhrchen mit 1 ml Herstellungsmedium. Bereiten Sie Schere und zwei feinen Pinzette. </li><li> Opfere die schwangere Maus durch Genickbruch, sterilisieren den Bauch durch Waschen mit 70% v / v Ethanol, und öffnen Sie den Bauch mit einer scharfen Schere. Excise die wulstigen Gebärmutter vorsichtig mit einer Schere und übertragen Sie die Orgel in 1x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt. </li><li> Dann entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Vorsichtig die Gebärmutter einzuschneiden und die Eihaut entfernen, ohne dass durch Verwendung von 2 Zange um die Embryonen zu schädigen. Danach enthaupten jeden Embryo mit einer Schere und übertragen Sie die Köpfe in eine zweite 10-cm-Schale mit Präparationsmedium versorgt. </li><li> Fahren Sie mit der Vorbereitung der Köpfe (ähnlich dem preparation beschrieben in 1,4 bis 1,7). <ol><li> den Schädel und die Haut im Halsbereich der Nähe des Rautenhirns, die senkrecht zur neuraxis immobilisieren den Kopf mit einer Pinzette und einzuschneiden. Verwenden Sie ein zweites Paar von Zange sowohl Schädel und Deckhaut zu heben, und biegen Sie die weichen Schädelkappe in Richtung des rostralen Ende des Kopfes, wodurch das Gehirn ausgesetzt wird. </li><li> Mit Hilfe von 2 Pinzetten, um das Gehirn von der Schädelhöhle lösen. Dazu an den Riechkolben dies, schließen 1 Pinzette und trennen das Gehirn aus dem Schädel beginnt und in Richtung des Rautenhirns zu bewegen. Sammeln Sie die Gehirne in einem anderen 10-cm-Schale mit Präparationsmedium gefüllt. </li></ol></li><li> Präparieren Sie die hippocampi aus den Cortex-Einheiten wie oben für die Astrozyten Zubereitung beschrieben (Schritt 1.6). Entfernen Sie den Hippocampus von jeder Hemisphäre und sammeln sie in der 2-ml-Röhrchen mit Präparationsmedium gefüllt. </li><li> Nach der Präparation abgeschlossen, übertragen Sie den Schlauch in den sterilen Laminar-Flow-Bank und Digest die Hippocampus-Gewebe mit 1 ml Aufschlußlösung Papain enthalten. Bereiten Sie die Aufschlusslösung wie in Schritt 1,9 bis 1,10, aber verwenden MEM statt DMEM. Hinweis: Die Schritte 3,9-3,12 sind kritisch und sollte innerhalb von 10 abgeschlossen sein - 15 min. </li><li> Nach Abschluss der Verdauung, zurückziehen sorgfältig die Aufschlußlösung durch vorsichtiges Absaugen mit einer Pipette. </li><li> Waschen Sie die hippocampi 3-mal mit Neuron Medium durch aufeinanderfolgende Zugabe und danach sorgfältig die Entnahme von 1 ml frisches Kulturmedium pro Waschgang. Zentrifuge nicht die Zellsuspension. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt sorgfältig verreiben das Gewebe in 1 ml Medium Neurons. </li><li> Zählen Sie die Zellen, die eine Zählkammer mit und Platte 35.000 Zellen in 500 &amp; mgr; l Neuron Medium pro einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte (die Platte erwähnt in 3.2). HINWEIS: Optional kann eine Zelle aliquoten mit Trypanblau counterstained werden, um die Vitalität der Zellpräparation zu beurteilen. Kontrollieren Sie die Plattierungsdichte durch visuelle InspektionIon mit dem Mikroskop (in der Regel 90 bis 110 Zellen pro Gesichtsfeld eines Standard-10X-Objektiv). </li><li> Ort Neuronen in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für 1 h. </li><li> Sende Inkubation, nehmen die vorbereiteten Einsätze (ausgesät mit konfluenten Astrozyten Monolayern) aus dem Inkubator (siehe Schritt 2.8). Tauschen Sie das Medium durch die Astrozyten Medium ansaugt und mit 500 &amp; mgr; l frisches Neuron Medium zu ersetzen. HINWEIS: Die Einsätze konfluenten Astrozyten Monolayern nach 2 beherbergen sollte - 3 DIV (Tage in vitro). </li><li> Legen Sie die Einsätze mit Astrozyten sorgfältig in die Vertiefungen, die die Neuronenkulturen enthalten (Schritt 3.13) mit einer sterilen Zange. </li><li> Platzieren der resultierenden indirekten neuron-Astrozyten Kokultur wieder in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. HINWEIS: Unter diesen Bedingungen kann Neuronen für bis zu 4 Wochen in vollständig definiertem Medium kultiviert werden. Kein Mediumwechsel notwendig ist. Für Langzeitkulturen, wird empfohlen, e zu füllenMPTY Brunnen mit sterilem Wasser, um die Verdunstung von der 24-Well-Platte zu reduzieren. </li><li> Führen Sie in - vitro - Zellanalysen nach Kulturperioden gewünscht (zB für Immunzytochemie, PCR, Western Blot, elektrophysiologischen Ableitungen (Patch - Clamp oder Multielektroden - Array)) 7,15,18. HINWEIS: Die Kultursystem eignet sich auch für akute und chronische pharmakologische Behandlung der Kulturen 11. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das Hauptziel des aktuellen Protokolls ist es, völlig getrennte neuronale und astrozytären Kulturen, während sie in gemeinsam genutzten Medium beibehalten wird. Aus diesem Grund erhalten die Reinheit der Kulturen sollten zu Beginn des Verfahrens überprüft werden. Wir empfehlen die Verwendung von Neuron-spezifischen Tubulin, neurofilaments oder NeuN Protein als neuronale Marker GFAP als astrozytären Marker, O4 Antigen als Oligodendrozyten Vorläufermarker und Iba1 Protein Mikroglia zu identifizieren. <p class="...

In den vergangenen Jahrzehnten hat sich die allgemeine Interpretation von neuroglia Funktion aus der Zuschreibung eines nur unterstützend auf eine aktive regulatorische Rolle in Bezug auf neuronale Funktion 1 entwickelt. Aufgrund ihrer prominenten Auswirkungen auf Gehirn - Homöostase in Gesundheit und Krankheit 2, Astrozyten sind von besonderem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. In den letzten Jahren haben auf Neuron-Glia - Wechselwirkung in vivo und in vitro 3 eine Vielfalt von Studien konzentriert. Doch die meisten der Kultursysteme nicht für die getrennte Analyse der beiden Zelltypen und ihrer jeweiligen secretomes ermöglichen. Verschiedene Ansätze nutzen die direkte Co - Kultivierung von Neuronen und Glia 4-6 lang anhaltende Überleben und physiologisch relevanten neuronalen Netzwerk Entwicklung zu erreichen. Das vorliegende Protokoll erreicht die gleichen Ziele , während die beiden Zelltypen zu halten 7 physikalisch getrennt. Im Vergleich zu conditioned Medium nähert sich 8,9, unser System ermöglicht die bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten zu studieren. Die Expression der sekretierten Signalmoleküle können überwacht werden, während die Zellen in dem gemeinsam genutzten Medium maturate. Diese Möglichkeit ist besonders relevant, da Astrozyten lösliche Faktoren freisetzen, wie beispielsweise Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle 10,11, wodurch neuronal wachstumsregulierende und Funktion 7,12. Somit wurde gezeigt, dass die Zugabe an retinalen Ganglionzellen in vitro Thrombospondin die Bildung der Synapsen 13 induziert. Jedoch sind auch andere noch unbekannte Faktoren notwendig Synapsen zu machen funktionellen 13. Darüber hinaus haben freigesetzten Moleküle von Astrozyten, um identifiziert zu werden, um die Basis von Neuron-Glia Interaktionen zu verstehen. Der Anbau von primären Neuronen und Astrozyten aus Maus und Ratte wurde zuvor 14-16 beschrieben. Hier sind wirpräsentieren ein elegantes und vielseitiges Werkzeug beide Zelltypen in einem indirekten Kokultur Ansatz zu kombinieren. Da die beiden Kulturen noch physikalisch getrennt werden, um die gleiche Medium teilen, um die Auswirkungen von Neuronen, Astrozyten und lösliche Moleküle können separat analysiert werden, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug für Neuron-Glia-Interaktionsstudien zu schaffen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture-grade water</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&amp;#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>CAUTION: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&amp;nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>CAUTION: H317-334</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>CAUTION: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>self-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-wells-plate (for the&amp;nbsp; indirect co-culture)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Binocular</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST Dumont (#5)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips (12&amp;nbsp;mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&amp;auml;ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tube (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Syringe-driven filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>pipette (1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile work bench</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>tube (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>Water bath type 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

Proper neuronaler Entwicklung und Funktion ist die Voraussetzung der Entwicklungs- und adulten Gehirn. Jedoch sind die Mechanismen, die die stark kontrollierten Bildung und Aufrechterhaltung von komplexen neuronalen Netzwerken zugrunde liegenden nicht vollständig bisher verstanden. Die offenen Fragen Neuronen in Gesundheit und Krankheit betreffen , sind vielfältig und das Erreichen von Verständnis der grundlegenden Entwicklung der menschlichen Pathologien zu untersuchen, zum Beispiel Alzheimer-Krankheit und Schizophrenie. Die detaillierte Analyse der Neuronen in vitro durchgeführt werden. Allerdings Neuronen fordern Zellen und brauchen die zusätzliche Unterstützung von Astrozyten für ihre langfristige Überleben. Diese zelluläre Heterogenität in Konflikt mit dem Ziel, die Analyse von Neuronen und Astrozyten zu sezieren. Wir stellen Ihnen hier eine Zellkultur-Assay, der für die langfristige Co-Kultivierung von reinen primären Neuronen und Astrozyten, die die gleiche chemisch definierten Medium gemeinsam nutzen können, während er physisch zu seingetrennt. In diesem Aufbau überleben die Kulturen für bis zu vier Wochen, und der Test ist für eine Vielzahl von Untersuchungen über Neuron-Glia-Interaktion geeignet.

Die Analyse der neuronalen Kulturen über den indirekten Cokultur-System ist vielfältig und kann in verschiedenen Stadien der Kultur Reifung durchgeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zellen für bis zu 4 Wochen, sind Langzeituntersuchungen der Kulturen möglich aufrechterhalten werden kann. Das Schema in der Mitte linken Seite von Abbildung 1 zeigt die Co - Kultur - Setup. Mit dem Einsatz dieses S...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K Aufrufe.  Ruhr-University.  Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen. 

Serie: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologie

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Entwicklungsbiologie

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

 Primäres Mikroglia- und Neuronen-Co-Kulturprotokoll für ZNS-Interaktionsstudien

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autor im Rampenlicht: In vitro Co-Kultur-Modell zur Untersuchung von Mikroglia-neuronalen Interaktionen bei Krankheitszuständen

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

Eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kulturtechnik zur Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kulturtechnik zur Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen